糜曉梅，楊聞君

（重慶市紅十字會(huì)醫(yī)院/江北區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400020）

鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii,Ab）作為一種臨床常見的革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界的水、土壤和醫(yī)院環(huán)境中，此外還存在于人體皮膚、呼吸道、消化道和泌尿生殖道等全身多部位，是一種常見的條件致病菌[1?3]。該菌在醫(yī)院環(huán)境中分布較為廣泛且存活時(shí)間較長(zhǎng)，易導(dǎo)致危重患者院內(nèi)感染的發(fā)生[4?5]。近年來隨著抗菌藥物的大量使用以及不合理使用，多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌（multi?drug resistantAcinetobacter baumannii,MDR?Ab）的檢出率逐年升高，其感染率及致死率也日趨嚴(yán)重[6?9]。鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制極其復(fù)雜，其中產(chǎn)碳青霉烯酶是MDR?Ab最重要的耐藥機(jī)制。已有研究報(bào)道由于地域性差異和醫(yī)院治療方式不同，細(xì)菌面臨的選擇性壓力也存在一定的差異，容易引起細(xì)菌異質(zhì)性耐藥[10?11]。為此，本研究針對(duì)重慶市紅十字會(huì)醫(yī)院2013－2020年臨床各科室分離的1 008株MDR?Ab的臨床分布、耐藥性和碳青霉烯酶基因進(jìn)行分析，為MDR?Ab耐藥性的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提供基線數(shù)據(jù)，以便制定合理有效的感染控制措施，最大限度地阻止MDR?Ab的播散。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2013－2020年重慶市紅十字會(huì)醫(yī)院臨床分離的MDR?Ab 1 008株，無效標(biāo)本未納入此次研究。大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853作為本實(shí)驗(yàn)的質(zhì)控菌株。

1.2 儀器與試劑

儀器：DL96?Ⅱ型細(xì)菌測(cè)定系統(tǒng)（珠海迪爾生物工程有限公司）；歐萊博恒溫培養(yǎng)箱（濟(jì)南千司生物技術(shù)有限公司）。試劑：血平板（重慶龐通公司生產(chǎn)）；DL96?Ⅱ型細(xì)菌測(cè)定系統(tǒng)配套的細(xì)菌鑒定卡和藥敏卡（珠海迪爾生物工程有限公司）。

1.3 鮑曼不動(dòng)桿菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

所有實(shí)驗(yàn)菌株均由DL96?Ⅱ型細(xì)菌測(cè)定系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏分析，并采用最小抑菌濃度（mini‐mal inhibit concentration,MⅠC）法對(duì)臨床常用抗菌藥物進(jìn)行敏感性分析，具體參照2020版CLSⅠ?M100標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果，最后通過WHONET 5.6軟件對(duì)菌株的臨床分布和藥敏資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本實(shí)驗(yàn)室將對(duì)亞胺培南耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌定義為MDR?Ab，并對(duì)各種抗菌藥物耐藥率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 碳青霉烯酶基因檢測(cè)

1.4.1 模板制備MDR?Ab菌株DNA采用金屬浴煮沸法進(jìn)行提取，提取后放-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 碳青霉烯酶基因的PCR檢測(cè) 以MDR?Ab菌株DNA為模板分別進(jìn)行blaOXA‐51、blaOXA‐23、blaOXA‐24和blaOXA‐58基因的PCR擴(kuò)增，各引物序列根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[12]，見表1。PCR體系：Taq PCR Master Mix體系12.5μL，ddH2O 9.5μL，上下游引物各1μL，模板DNA 1μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；退火30 s，退火溫度見表1；72℃，延伸根據(jù)具體根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度而定；變性、退火、延伸45個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，并通過凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

表1 PCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度Table 1 PCRprimer sequence and product length

1.4.3 碳青霉烯酶基因測(cè)序 將碳青霉烯酶基因陽(yáng)性的擴(kuò)增產(chǎn)物送重慶擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank進(jìn)行Blast比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 菌株分布特征

1 008株MDR?Ab菌株的檢出率和分離率見表2。標(biāo)本類型中痰液占84.2%，肺泡灌洗液占7.4%，分泌物占2.9%，中段尿占2.4%，血液占1.6%，其他占1.5%；年齡分布集中在71~90歲（占60.8%），其中81~90歲330人（占32.7%），71~80歲283人（占28.1%）；科室分布主要為重癥醫(yī)學(xué)科、呼吸內(nèi)科、腫瘤科和神經(jīng)外科。見表3~表5。

表2 2013－2020年MDR?Ab菌株的檢出情況Table 2 Detection of MDR?Ab strains from 2013 to 2020

2.2 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

1 008株MDR?Ab對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥率和敏感率均存在小幅度波動(dòng)但基本維持穩(wěn)定。見表6。

表6 2013－2020年MDR?Ab菌株耐藥率和敏感率Table 6 Resistance and sensitivity rates of MDR?Ab strains from 2013 to 2020 %

2.3 碳青霉烯酶基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

1 008株MDR?Ab的blaOXA‐51、blaOXA‐23基因型的檢出率分別為62.0%、71.9%，且以blaOXA‐51/blaOXA‐23基因型為主（59.5%），未檢出blaOXA‐24和blaOXA‐58基因型。部分菌株P(guān)CR產(chǎn)物電泳見圖1、圖2。

圖1 blaOXA‐51基因型陽(yáng)性PCR產(chǎn)物電泳圖Figure 1 PCR products of blaOXA‐51 gene

圖2 blaOXA‐23基因型陽(yáng)性PCR產(chǎn)物電泳圖Figure 2 PCRproducts of blaOXA‐23 gene

2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

碳青霉烯酶基因陽(yáng)性菌株測(cè)序結(jié)果與GenBank進(jìn)行序列比對(duì)，測(cè)序分析結(jié)果與電泳結(jié)果完全一致。

3 討論

本研究對(duì)2013－2020年重慶市紅十字會(huì)醫(yī)院臨床各科室分離的1 008株MDR?Ab菌株進(jìn)行了回顧性分析，結(jié)果顯示，標(biāo)本的質(zhì)量控制較好，該菌株的檢出率和分離率未見明顯變化，陽(yáng)性率穩(wěn)定在5.8%~9.8%的檢出范圍內(nèi)。MDR?Ab菌株的標(biāo)本類型、年齡分布、科室分布等與國(guó)內(nèi)多家醫(yī)院報(bào)道一致，這些病區(qū)患者多為危重癥患者、老年患者或者接受過氣管插管等有創(chuàng)治療，大多數(shù)患者的免疫力低下，同時(shí)還由于大量使用了碳青霉烯類抗生素，造成菌群失調(diào)，使得MDR?Ab菌株泛濫進(jìn)而出現(xiàn)嚴(yán)重感染現(xiàn)象[13?16]。逐年比較發(fā)現(xiàn)：2019年MDR?Ab菌株出現(xiàn)較快增長(zhǎng)，檢出率和分離率均為最高值，而2020年的檢出率和分離率卻呈現(xiàn)較大幅度降低，這可能與近年來加強(qiáng)醫(yī)院感染監(jiān)測(cè)、注重醫(yī)院感染宣傳、加強(qiáng)手衛(wèi)生和環(huán)境清潔、減少侵入性操作等各種措施有關(guān)[17?18]。此外，藥敏結(jié)果表明，1 008株MDR?Ab菌株對(duì)大部分臨床常見抗菌藥物的耐藥率都大于80%，僅對(duì)復(fù)方新諾明、左旋氧氟沙星和氨芐西林/舒巴坦的耐藥率低于80%。8年間MDR?Ab菌株對(duì)阿米卡星和慶大霉素的耐藥率呈上升趨勢(shì)，其耐藥率從2013年的23.7%、80.3%上升至2020年的88.1%、96.6%，對(duì)其他常用抗菌藥物的敏感率相對(duì)穩(wěn)定。逐年比較發(fā)現(xiàn)：MDR?Ab菌株對(duì)美羅培南、替卡西林/克拉維酸、頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦和環(huán)丙沙星的耐藥率均＞90%，提示MDR?Ab菌株對(duì)這5種抗菌藥物高度耐藥。

表32013 －2020年MDR?Ab菌株標(biāo)本類型及構(gòu)成Table3TypesandcompositionofMDR?Abstrainsamplesfrom2013to2020

表42013 －2020年MDR?Ab菌株感染患者的年齡分布Table4AgedistributionofpatientsinfectedwithMDR?Abstrainsfrom2013to2020

表52013 －2020年MDR?Ab菌株科室分布及構(gòu)成比Table5 DistributionandcompositionofMDR?Abstrainsindifferentdepartmentsfrom2013to2020

以往研究報(bào)道，鮑曼不動(dòng)桿菌存在較多的耐藥機(jī)制，包括產(chǎn)β?內(nèi)酰胺酶、膜通透性下降、外排泵過度表達(dá)、生物膜的形成等[19]。復(fù)雜的耐藥機(jī)制已成為MDR?Ab迅速傳播的主要原因，而目前臨床針對(duì)MDR?Ab治療選擇的藥物非常有限，因此要求醫(yī)院各部門攜手并進(jìn)，采取有力措施，包括：臨床醫(yī)護(hù)工作人員應(yīng)加強(qiáng)醫(yī)療器械及物品的消毒管理，同時(shí)做好手衛(wèi)生，并嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作及消毒隔離，避免院內(nèi)感染的暴發(fā)流行和耐藥菌的進(jìn)一步播散；檢驗(yàn)科還需要提供準(zhǔn)確的鑒定和藥敏結(jié)果，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)MDR?Ab菌株的耐藥性變化及同源性比較分析，為“精準(zhǔn)”抗感染提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)；臨床藥師和臨床醫(yī)生需要根據(jù)藥敏結(jié)果制定合理的用藥方案，精準(zhǔn)用藥以延緩MDR?Ab菌株的產(chǎn)生[20?21]。

鮑曼不動(dòng)桿菌是臨床最常見的病原菌之一，它容易引起呼吸道、泌尿道和胃腸道等全身多部位的感染[22?23]。碳青霉烯類抗菌藥物作為革蘭陰性菌感染最廣譜的抗菌藥物，對(duì)大多數(shù)產(chǎn)超廣譜β‐內(nèi)酰胺酶具有較高的穩(wěn)定性[24]。目前，隨著該類抗菌藥物的廣泛使用甚至過度治療，導(dǎo)致臨床耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌呈逐年增加趨勢(shì)，且耐藥范圍已分布于全球各地[25]。本研究結(jié)果顯示：1 008株MDR?Ab菌株blaOXA‐51基因型陽(yáng)性率為62.0%，blaOXA‐23基因型陽(yáng) 性 率 為71.9%，其 中blaOXA‐51/blaOXA‐23基 因 型 占59.5%，但未檢出blaOXA‐24和blaOXA‐58基因陽(yáng)性攜帶情況，說明從攜帶碳青霉烯酶基因?qū)用嫔蟻砜矗瑪y帶blaOXA‐51和blaOXA‐23基因產(chǎn)生耐藥是我院鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的一個(gè)重要機(jī)制，而blaOXA‐24和blaOXA‐58基因尚未在我院傳播流行。因此，預(yù)防和控制產(chǎn)OXA?513酶和OXA?23酶MDR?Ab是醫(yī)院感染是一項(xiàng)非常重要的工作。臨床上對(duì)疑似感染患者應(yīng)盡早采集標(biāo)本做出多重耐藥菌診斷，合理使用抗菌藥物，加強(qiáng)重點(diǎn)科室的感染控制工作，以減少多重耐藥菌的產(chǎn)生和傳播。

綜上所述，本研究通過對(duì)2013－2020年重慶市紅十字會(huì)醫(yī)院分離的MDR?Ab菌株臨床分布特征和耐藥特征結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，進(jìn)一步了解了醫(yī)院MDR?Ab菌株的分布情況和耐藥性變遷規(guī)律，為今后MDR?Ab菌株的耐藥性動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提供基線數(shù)據(jù)，為更有效地控制MDR?Ab菌株引起的感染暴發(fā)和流行提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。