徐福霞

(天津市靜海區(qū)醫(yī)院婦科，天津 301600)

子宮內(nèi)膜異位癥是婦科中一種較難治愈的疾病[1]，多種研究表明該病是一種與炎性反應(yīng)、免疫有關(guān)的疾病，其與腹腔微環(huán)境及機(jī)體的炎性密切相關(guān)[2]。COX為一種膜結(jié)構(gòu)蛋白，是炎性過(guò)程中重要的誘導(dǎo)酶，與炎性形成有關(guān)，大量的炎性細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、癌基因、低氧、脂多糖和腫瘤啟動(dòng)子等均能誘導(dǎo)COX-2的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)異癥患者體內(nèi)COX-2表達(dá)增加，COX-2基因在內(nèi)異癥在位、異位子宮內(nèi)膜中均存在高表達(dá)，且COX-2可誘導(dǎo)EMs中子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管生成[3]。前列腺素(PG)是一種半衰期極短的不穩(wěn)定型類花生四烯酸化合物(AA)，在生物體內(nèi)含量極微而活性極強(qiáng)，具有廣泛的生理和病理作用。有研究表明伴有盆腔痛癥狀的內(nèi)異癥患者異位病灶COX-2、PGE2表達(dá)水平明顯升高，且腹腔沖洗液PGE2濃度也明顯升高[4]。COX-2的過(guò)表達(dá)及伴隨的PGs升高可能使子宮內(nèi)膜處于一種異常狀態(tài)，加上巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞分泌的致炎因子對(duì)腹膜的損傷，為其種植提供良好環(huán)境。磷脂酶A2(PLA2)是一類轉(zhuǎn)變膜磷脂為花生四烯酸并隨后生成二十碳酸類炎性介質(zhì)的重要酶類，AA分別經(jīng)環(huán)氧化酶和脂氧酶途徑生成前列腺素。

1 資料與方法

1.1一般材料：選取2016年3月～2020年2月天津市靜海區(qū)醫(yī)院腹腔鏡手術(shù)并經(jīng)術(shù)后病理確診為子宮內(nèi)膜異位癥的患者，取病變最典型部位為研究標(biāo)本，共22份，按手術(shù)所見分型為：卵巢型14例，腹膜型2例，盆底深部浸潤(rùn)型6例。按照美國(guó)生育協(xié)會(huì)修正分期法(R-AFS)對(duì)患者進(jìn)行臨床分期，其中Ⅰ期～Ⅱ期11例，Ⅲ期～Ⅳ期11例。該組年齡20～50歲，平均(33.6±9.2)歲，術(shù)前除外合并急慢性盆腔炎，無(wú)藥物治療史，無(wú)其他內(nèi)科合并癥，月經(jīng)規(guī)律且非月經(jīng)期。同時(shí)選擇同期因卵巢良性畸胎瘤行腹腔鏡手術(shù)的患者為對(duì)照組，共20例，年齡24～48歲，平均(34.8±8.6)歲，該組均為體檢發(fā)現(xiàn)，排除標(biāo)準(zhǔn)同病例組。本研究設(shè)計(jì)經(jīng)過(guò)倫理委員會(huì)同意，術(shù)前征得患者同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)sPLA2：術(shù)中留取內(nèi)異癥組及對(duì)照組患者腹腔液或腹腔沖洗液10 ml，室溫靜置1 h，以3 000 r/min離心3 min后取上清液約1 ml分裝，置于-80℃冰箱保存。共采集內(nèi)異癥組標(biāo)本22份,其中Ⅰ期～Ⅱ期11例，Ⅲ期～Ⅳ期11例；對(duì)照組標(biāo)本20份。采用ELISA檢測(cè)sPLA2含量。 試劑盒購(gòu)自福州博科生物科技公司，檢測(cè)敏感度均為1 pg/ml，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.2免疫組化法檢測(cè)cPLA2：術(shù)中留取組織標(biāo)本經(jīng)生理鹽水沖洗后，部分4%甲醛溶液固定,石蠟包埋，4 μm厚的連續(xù)切片；部分置-80℃冰箱保存行Western blot檢測(cè)。采用HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)，免疫組化SP法進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，兔抗人cPLA2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)immunoway公司，染色步驟按SP試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，一抗、二抗滴度均為1∶200，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，DAB進(jìn)行染色。在異位病灶的子宮內(nèi)膜和血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)上出現(xiàn)棕色顆粒樣物質(zhì)的細(xì)胞為陽(yáng)性。取組織標(biāo)本，加入RIPA裂解液裂解，冰上孵育20 min，13 500 r/min 離心20 min，收獲蛋白，根據(jù)BCA法蛋白定量測(cè)定蛋白濃度。十二基甲酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)恒壓110 V電泳分離，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(1∶500兔抗人cPLA2多克隆抗體)4℃冰箱中過(guò)夜，TBST稀釋的二抗37℃搖床2 h，化學(xué)發(fā)光底物顯色。將膠片進(jìn)行掃描，對(duì)目的條帶行灰度掃描分析，測(cè)得的灰度值與actin蛋白條帶灰度值的比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.2sPLA2在內(nèi)異癥患者中的表達(dá)：sPLA2在內(nèi)異癥組和對(duì)照組中表達(dá)水平分別為(818.8±325.6)ng/L和(545.4±243.3)ng/L，內(nèi)異癥組顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A；內(nèi)異癥Ⅲ期～Ⅳ期和Ⅰ期～Ⅱ期患者sPLA2分別為(687.4±279.9)ng/L和(950.2±327.3)ng/L,Ⅲ期～Ⅳ期顯著高于Ⅰ期～Ⅱ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1B。

圖1 sPLA2在內(nèi)異癥患者中的表達(dá)

2.2cPLA2在內(nèi)異癥患者中的表達(dá)：cPLA2主要表達(dá)于異位子宮內(nèi)膜組織，定位于子宮內(nèi)膜腺體上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿，陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色顆粒。見圖2。

2.3sPLA2診斷內(nèi)異癥價(jià)值：以腹腔液中sPLA2為參考，診斷內(nèi)異癥的敏感性和特異性分別為75.0%(50.9%～91.34%)和80.0%(56.34%～94.27%)， ROC曲線下面積為0.76(0.61～0.92)，見圖3A。sPLA2鑒別診斷Ⅲ期～Ⅳ期和Ⅰ期～Ⅱ期內(nèi)異癥敏感性和特異性分別為80.0%(44.39%～97.48%)和70.0%(34.75%～93.33%)，見表1。ROC曲線下面積為0.73(0.49%～0.96%)，見圖3B、表1。

圖2 cPLA2在盆底異位病灶和卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫血管中的表達(dá)

圖3 sPLA2診斷內(nèi)異癥價(jià)值

表1 sPLA2診斷內(nèi)異癥及對(duì)分期的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

內(nèi)異癥在某一階段從臨床上抑或病理上可表現(xiàn)為一種炎性過(guò)程，而研究證明PLA2在炎性反應(yīng)發(fā)展中起重要作用[5]。在COX-2和脂氧化酶作用下，AA可生成PGs、白三烯等炎性活性物質(zhì)參與機(jī)體的一系列生理病理過(guò)程啟動(dòng)炎性反應(yīng)，引起機(jī)體多種疾病。Sano[6]等研究發(fā)現(xiàn)PLA2在內(nèi)異癥患者腹腔液中表達(dá)升高，Sahmani等[7]研究也表明sPLA2在內(nèi)異癥患者體內(nèi)表達(dá)升高，提示PLA2在內(nèi)異癥發(fā)病中起到重要作用，但PLA2在內(nèi)異癥中發(fā)揮的作用在國(guó)內(nèi)尚未見研究。

sPLA2是磷脂酶A2家族中的一種，其表達(dá)在炎性反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞等，當(dāng)機(jī)體受到細(xì)菌等微生物侵襲或發(fā)生自身免疫性疾病時(shí)，sPLA2會(huì)被白細(xì)胞等含有sPLA2的細(xì)胞大量地分泌到細(xì)胞外液中，并與白細(xì)胞相互作用，共同參與炎性反應(yīng)和發(fā)揮殺菌作用[8]。本研究結(jié)果表明，隨著內(nèi)異癥病情的進(jìn)展，sPLA2值明顯升高，提示sPLA2可能作為一種炎性介質(zhì)，在內(nèi)異癥的活動(dòng)中起促進(jìn)作用。

cPLA2與sPLA2兩者相互作用可促進(jìn)炎性反應(yīng)中AA的大量出現(xiàn)，在同時(shí)表達(dá)cPLA2和sPLA2細(xì)胞中，AA的大量產(chǎn)生受sPLA2的調(diào)控，而sPLA2的作用在某種程度上取決于cPLA2的活化，實(shí)驗(yàn)證明在肥大細(xì)胞及中性粒細(xì)胞中，外源的sPLA2產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)可誘導(dǎo)cPLA2活性；在巨噬細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞中，sPLA2分泌的AA受到cPLA2的調(diào)節(jié)[9]。本研究結(jié)果顯示Ⅲ期～Ⅳ期內(nèi)異癥患者體內(nèi)cPLA2表達(dá)水平顯著高于Ⅰ期～Ⅱ期，與腹腔液中sPLA結(jié)果一致，由此可以設(shè)想在內(nèi)異癥患者體內(nèi)兩者相互誘導(dǎo)共同作用，對(duì)內(nèi)異癥病情的進(jìn)展起到重要作用，具體機(jī)制需進(jìn)一步探討。

本研究結(jié)果提示腹腔液中sPLA2升高，并與疾病進(jìn)展有關(guān)。以sPLA2為參考診斷內(nèi)異癥及對(duì)內(nèi)異癥分期有較高的診斷敏感性和特異性，可作為臨床應(yīng)用的生物學(xué)指標(biāo)。