潘夢詩，郭文陽，張宗源，岳丹丹，亓蘭達(dá)，王雪妍，張英濤

(河南省科學(xué)院生物研究所，鄭州 450008)

花生(ArachishypogaeaLinn.)是一年生豆科植物，是我國除油菜外的第二大油料作物，也是我國重要的出口創(chuàng)匯農(nóng)產(chǎn)品[1]。近年來，花生種植面積不斷增加，但連作現(xiàn)象明顯，施肥過度，花生病害發(fā)生也隨之增加，其中花生白絹病是花生病害中危害較大的一種[2]。花生白絹病病原菌為半知菌亞門無孢菌目齊整小菌核屬(Sclerotiumrolfsii)，可危及花生莖基部、果柄、莢果、種仁及根，可導(dǎo)致花生大面積減產(chǎn)和品質(zhì)下降，該菌產(chǎn)生的菌核可在土壤中存活多年，造成土傳污染和防治困難[3]。目前在花生生產(chǎn)上主要依靠化學(xué)農(nóng)藥如噻呋酰胺、醚菌酯等進(jìn)行花生白絹病的防治[4]，但長期使用化學(xué)農(nóng)藥存在病原菌抗藥性、環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問題，不符合綠色農(nóng)業(yè)和可持續(xù)發(fā)展的理念[5-6]。以菌治菌的生物防治則具有生態(tài)環(huán)保、高效安全、可持續(xù)的特點(diǎn)，成為植物病害防治的研究熱點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景[7-8]。其中，芽孢桿菌屬因其產(chǎn)芽孢、高效的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用到植物病害防治中。

貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是芽孢桿菌屬的一個(gè)新種，近幾年研究熱度不斷增加，國內(nèi)外分離得到的貝萊斯芽孢桿菌均在生物防治方面表現(xiàn)出巨大的潛力[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌含有多種脂肽抑菌物質(zhì)合成基因，其無菌發(fā)酵濾液具有廣譜的抑菌性，可抑制多種植物病原菌的生長[11-13]。目前暫無貝萊斯芽孢桿菌用于花生白絹病防治方面的研究。試驗(yàn)以貝萊斯芽孢桿菌作為生防潛力菌，研究其對花生白絹病的生防作用，為花生白絹病的生物防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試作物

花生品種為豫花40號(hào)，購自河南豫研種子科技有限公司。

1.1.2 供試菌株

花生白絹病(Sclerotiumrolfsii)由河南省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；貝萊斯芽孢桿菌BS-1(Bacillusvelezensis)由本實(shí)驗(yàn)室從土壤中分離并保存。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基、蛋白酶培養(yǎng)基、淀粉酶培養(yǎng)基、纖維素酶培養(yǎng)基、嗜鐵素培養(yǎng)基：參考文獻(xiàn)[14]進(jìn)行配制。

1.2 方法

1.2.1 平板對峙試驗(yàn)

將花生白絹病菌接種于PDA培養(yǎng)基中央，28 ℃，培養(yǎng)7 d，待病菌長滿平板后放于4 ℃冰箱備用。挑取貝萊斯芽孢桿菌BS-1單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，180 r/min，30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)24 h備用。將長滿花生白絹病菌的平板打孔，取直徑為5 mm的圓形菌塊接種于PDA培養(yǎng)基中央，在距離菌塊中央3 cm處四周各點(diǎn)接10 μL活化的BS-1菌液，空白對照組點(diǎn)接無菌水，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，28 ℃，培養(yǎng)7 d，觀察花生白絹病菌絲生長狀況，計(jì)算菌絲生長抑制率，顯微鏡下觀察菌絲結(jié)構(gòu)變化。培養(yǎng)1個(gè)月后，對菌核計(jì)數(shù)，計(jì)算菌核抑制率。

菌絲生長抑制率=(對照菌絲直徑-處理菌絲直徑)/對照菌絲直徑×100%

菌核抑制率=(對照菌核數(shù)量-處理菌核數(shù)量)/對照菌核數(shù)量×100%

1.2.2 貝萊斯芽孢桿菌對花生白絹病菌的拮抗機(jī)制

(1)無菌發(fā)酵濾液的抑菌性。接種貝萊斯芽孢桿菌BS-1于LB液體培養(yǎng)基中，180 r/min，30 ℃培養(yǎng)24 h，將菌液于12 000 r/min，離心20 min，收集上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾。處理組將無菌濾液與PDA培養(yǎng)基1∶10混合制成含藥平板，空白對照用LB液體培養(yǎng)基代替，在平板中央放置花生白絹病菌塊，28 ℃，培養(yǎng)7 d，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，觀察花生白絹病菌絲生長狀況，計(jì)算菌絲生長抑制率。(2)揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌性。參考文獻(xiàn)[15]使用雙板法進(jìn)行測定，在PDA培養(yǎng)基中央放置一塊直徑為5 mm的花生白絹病菌塊，用接種環(huán)在另一個(gè)LB平板上劃線貝萊斯芽孢桿菌單菌落，將前者反扣后者之上，用封口膜將兩皿接觸處密封，以空白LB平板作對照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，28 ℃，培養(yǎng)7 d，觀察花生白絹病生長狀況。(3)次級(jí)代謝產(chǎn)物胞外酶的產(chǎn)生情況。將貝萊斯芽孢桿菌分別點(diǎn)接到已滅菌的蛋白酶培養(yǎng)基、淀粉酶培養(yǎng)基、纖維素酶培養(yǎng)基和嗜鐵素培養(yǎng)基上，28 ℃，培養(yǎng)5 d后觀察有無透明圈，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 盆栽防治試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[5]方法，略作調(diào)整。將沙土與營養(yǎng)土1∶1混勻，250 g，分裝于16.5 cm×10 cm盆栽盆中，挑選大小均一、飽滿度一致的花生種子，用1% NaClO浸泡1～2 min，無菌水沖洗4～5次，播種于盆栽盆中，每盆3?；ㄉN子，每個(gè)處理組6個(gè)重復(fù)。待花生出芽2 d后進(jìn)行花生白絹病的侵染，參考文獻(xiàn)[16]，采用燕麥粒侵染法，于2粒燕麥粒上放置1個(gè)花生白絹病菌餅，28 ℃培養(yǎng)7 d，用錫箔紙包裹麥粒菌塊于花生莖基部，每天噴霧保濕。處理1：菌液拌土，將107cfu/mL貝萊斯菌液50 mL與盆栽土混合均勻后播種；處理2：噴灑處理，在接種花生白絹病病菌前2 d進(jìn)行107cfu/mL菌液噴灑；處理3：噴灑處理，在接種花生白絹病病菌后2 d進(jìn)行107cfu/mL菌液噴灑。對照組為僅接種病菌，不做其他處理。侵染2周后取樣，統(tǒng)計(jì)花生的病情指數(shù)，測定花生的生長指標(biāo)。

花生病情指數(shù)分級(jí)，主要觀察花生莖基部病斑數(shù)。0級(jí)：無病斑；1級(jí)：1～3個(gè)病斑；3級(jí)：病斑較多，面積占莖和根的1/4～1/3；5級(jí)：病斑面積占莖和根的1/2～3/4；7級(jí)：病斑成片，有燒莖現(xiàn)象，根部壞死。病情指數(shù)=∑(各級(jí)病株數(shù)×病情級(jí)別數(shù))/(植株總株數(shù)×最高病情級(jí)別數(shù))×100%。

花生生長指標(biāo)包括株高、根長、地上鮮重、地下鮮重、地上干重和地下干重(105 ℃殺青30 min，75 ℃烘干至恒重)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 和SPSS Statistic 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝萊斯芽孢桿菌對花生白絹病的拮抗結(jié)果

貝萊斯芽孢桿菌BS-1對花生白絹病的拮抗作用如圖1所示。BS-1可顯著抑制花生白絹病菌絲的生長，培養(yǎng)7 d后，BS-1對花生白絹病菌菌絲的抑菌率為81.93%。通過顯微鏡觀察菌絲結(jié)構(gòu)可知，對照組菌絲呈線狀平滑生長，BS-1處理組花生白絹病菌絲分支增多，菌絲頂端出現(xiàn)膨大，菌絲結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂。培養(yǎng)1個(gè)月后，BS-1呈云霧狀生長，將白絹病菌菌塊溶解，花生白絹病菌絲體消失，未見菌核的產(chǎn)生，對菌核生成的抑制率高達(dá)100%。結(jié)果表明，BS-1對花生白絹病菌存在明顯的拮抗作用，具有良好的生防潛力。

(a)花生白絹病菌；(b)BS-1對病菌菌絲生長的影響；(c)花生白絹病菌菌絲結(jié)構(gòu)(20×)；(d)BS-1對病菌菌絲結(jié)構(gòu)的影響(20 ×)；(e)花生白絹病菌菌核；(f)BS-1對花生白絹病菌菌核的影響；白色箭頭處可見菌絲結(jié)構(gòu)膨大。

2.2 貝萊斯芽孢桿菌無菌濾液對花生白絹病的抑制作用

BS-1無菌發(fā)酵濾液可顯著抑制花生白絹病的生長，菌絲抑制率達(dá)74.68%(圖2)。已有研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌含有多種抗菌物質(zhì)合成的關(guān)鍵基因，如srf AA、fen D等，因此其代謝物中可能含有抗菌活性物質(zhì)，從而表現(xiàn)出抑菌特性[17]。

圖2 無菌發(fā)酵濾液對花生白絹病的抑制作用

2.3 貝萊斯芽孢桿菌揮發(fā)性產(chǎn)物對花生白絹病的抑制作用

芽孢桿菌屬可通過產(chǎn)生揮發(fā)性氣體如氰化氫、2-壬醇、2-乙基己醇等，對植物病原菌產(chǎn)生毒殺作用[18-19]，對照組和處理組花生白絹病菌絲均生長旺盛，鋪滿整個(gè)平板(圖3)，由此可知BS-1并非通過其揮發(fā)性產(chǎn)物對病原菌產(chǎn)生拮抗作用。

圖3 貝萊斯芽孢桿菌揮發(fā)性產(chǎn)物對花生白絹病的影響

2.4 貝萊斯芽孢桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物胞外酶的產(chǎn)生情況

由圖4可知貝萊斯芽孢桿菌可產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和嗜鐵素。蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶均屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物水解酶，可降解病原菌細(xì)胞壁，破壞菌體結(jié)構(gòu)，從而抑制病原菌菌絲的生長[20]。嗜鐵素可將Fe3+競爭性利用，抑制病原菌孢子萌發(fā)和菌絲生長[21]。由此推斷，貝萊斯芽孢桿菌可通過產(chǎn)生水解酶等次級(jí)代謝產(chǎn)物抑制花生白絹病病原菌的生長。

2.5 貝萊斯芽孢桿菌處理對花生白絹病的防治效果

花生盆栽試驗(yàn)結(jié)果如圖5和表1所示。正常花生的莖基部平滑，白色無病斑，侵染對照組花生莖根部可見明顯的病斑，褐變嚴(yán)重，病情指數(shù)高達(dá)71.43%，說明花生白絹病病原菌對花生具有很強(qiáng)的致病性。與侵染對照組相比，經(jīng)貝萊斯芽孢桿菌BS-1菌液處理可顯著降低花生的病情指數(shù)，防效在34.00%～66.15%(P<0.05)。菌液拌土處理的防效低于噴灑處理(處理1防效34%，低于處理2和處理3)，以侵染病菌2 d后噴灑菌液的處理3生防效果最佳，對花生白絹病的防效高達(dá)66.15%。

表1 不同處理對花生白絹病的防治效果

2.6 貝萊斯芽孢桿菌處理對花生生長的影響

盆栽試驗(yàn)中，通過測定花生的株高、根長、地上鮮重、地下鮮重、地上干重和地下干重指標(biāo)判斷不同處理對花生生長的影響，結(jié)果如表2所示。較對照組相比結(jié)果：處理1可顯著提高花生的株高和地上鮮重部分(P<0.05)，增加花生的根長、地上干重和地下干重，但無顯著性差異(P>0.05)；處理2可顯著增加花生的株高和地上鮮重(P<0.05)，增加花生的地下鮮重和地上干重，但無顯著性差異(P>0.05)；處理3對花生地上鮮重增加顯著(P<0.05)，對花生的株高、根長、地下鮮重，地上干重、地下干重均有一定的促進(jìn)作用。結(jié)果表明，經(jīng)貝萊斯生防菌劑處理后均可在一定程度上促進(jìn)花生的生長。

表2 不同處理對花生生長的影響

3 討論與結(jié)論

基于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和環(huán)保安全的理念，生物防治已成為植物病害防治的研究重點(diǎn)[22]。我國的微生物農(nóng)藥登記顯示，芽孢桿菌作為登記最多的生物農(nóng)藥，約占50%[23]，芽孢桿菌因其可產(chǎn)生芽孢特性，生防效果穩(wěn)定，可有效抑制病原菌的侵染[24]。貝萊斯芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬，因其含有多種菌肽基因組，具有巨大的生防潛力，近幾年被廣大學(xué)者爭先研究和報(bào)道。以貝萊斯芽孢桿菌為潛力生防菌，研究其對花生白絹病的防治效果，平板對峙試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌可顯著抑制花生白絹病的生長，具有良好的生防前景。

通過對貝萊斯芽孢桿菌生防機(jī)理的初步研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌的揮發(fā)性產(chǎn)物雖未對花生白絹病菌起到抑制作用，但可產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶等細(xì)胞壁水解酶，產(chǎn)生嗜鐵素，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物均可抑制病原菌的生長，這與其無菌發(fā)酵濾液具有拮抗性的試驗(yàn)結(jié)果相吻合。

盆栽試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了貝萊斯芽孢桿菌可對花生白絹病起到良好的防治效果，對花生具有一定的促生作用。菌液噴灑處理效果優(yōu)于拌土處理，其中接種病菌后2 d進(jìn)行菌液噴灑的防治效果最優(yōu)，花生的病情指數(shù)最低，這與其他相似研究的結(jié)果不太一致[25-26]。接種后處理優(yōu)于接種前處理，一方面與生防菌特性有關(guān)，另一方面可能是由于后期接種，大量新鮮菌液直接與花生白絹病菌相接觸，菌體活性最強(qiáng)，有效及時(shí)地抑制了花生白絹病菌的生長。這也說明，貝萊斯芽孢桿菌的生防作用不僅與其有效的代謝產(chǎn)物有關(guān)，還與其活菌對病原菌的相互作用有關(guān)，具體還需要進(jìn)一步研究。貝萊斯芽孢桿菌可作為防治花生白絹病的潛力生防菌，后期還需進(jìn)行產(chǎn)孢條件的優(yōu)化、菌劑的制備和大田試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證其生防效果，為其商業(yè)化生產(chǎn)提供支持。