梁志健嚴(yán)家榮陳桂煌張建軍陳潤紅鄺少松*

(1.廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,廣東佛山 528248；2.廣東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,廣州 510080)

據(jù)統(tǒng)計(jì)40～70 歲男性中有約52%患有不同程度的性功能障礙,主要表現(xiàn)為性欲減退、陰莖勃起障礙、射精障礙及精子活力下降等[1-2]。 其原因可能與雄激素水平降低、機(jī)體疲勞、處于亞健康、疾病等有關(guān)。 尋找能改善性功能障礙的安全有效的藥物及保健食品具有深遠(yuǎn)的意義。 中醫(yī)認(rèn)為“腎藏精、主生殖”,“腎者作強(qiáng)之官,伎巧出焉”,因此,中醫(yī)補(bǔ)腎法是治療性功能障礙和精子異常的基本治法[3-5]。 蒺藜淫羊藿復(fù)合物便是根據(jù)這一治法,由淫羊藿、蒺藜、西洋參提取物組方而成。 本課題在半去勢雄性大鼠模型基礎(chǔ)上,通過觀察蒺藜淫羊藿復(fù)合物對模型大鼠的交配行為、睪酮含量、精子活力等指標(biāo)的影響,綜合評價(jià)其是否具有增強(qiáng)性功能,改善性功能障礙的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級 SD 大鼠,100 只,雌雄各半,8 周齡,271～298 g；購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(粵)2018-0002], 合 格 證 號 為: 44007200039469、44007200039470。 實(shí)驗(yàn)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心進(jìn)行[SYXK (粵) 2018-0002],實(shí)驗(yàn)證明號為:00169157、00169158。 飼養(yǎng)條件:5 只/籠,自由進(jìn)食飲水,采用12 h ∶12 h 晝夜間斷照明,飼養(yǎng)室條件始終保持穩(wěn)定。 本研究經(jīng)廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審核(B201704-8),符合3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

十一酸睪酮軟膠囊(藥品級,浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠)；戊巴比妥鈉(分析純,德國默克公司)；苯甲酸雌二醇注射液(藥品級,寧波第二激素廠)；黃體酮注射液(藥品級,赤峰博恩藥業(yè)有限公司)；睪酮檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

BL-420 S 型生物機(jī)能儀(成都泰盟軟件有限公司)；CX21 型生物顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 劑量設(shè)計(jì)與樣品配制

蒺藜淫羊藿復(fù)合物由湯臣倍健股份有限公司提供,由蒺藜、淫羊藿、西洋參和輔料組成,其中每100 g 含總皂苷不低于2.0 g、淫羊藿苷不低于0.5 g。 根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003 年版),蒺藜淫羊藿復(fù)合物以成人推薦用量的10 倍、30 倍設(shè)為大鼠的低、高劑量,即分別為0.51、1.52 g/kg。 配制方法:稱取8.36 g 蒺藜淫羊藿復(fù)合物粉末,用純凈水溶解至55 mL,得質(zhì)量濃度0.152 g/mL的蒺藜淫羊藿復(fù)合物高劑量溶液。 取14 mL 的高劑量溶液,用純凈水稀釋至42 mL,得0.051 g/mL 的低劑量溶液。

陽性對照品選用十一酸睪酮,以成人推薦用量的10 倍設(shè)為大鼠的劑量,即0.02 g/kg。

1.3.2 動物分組及處理

雄鼠的處理:50 只大鼠隨機(jī)分為正常對照組10只和造模組40 只。 造模組動物按45 mg/kg 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,摘除右側(cè)睪丸、左側(cè)不做處理。正常對照組大鼠做假手術(shù)處理。 術(shù)后各組動物肌肉注射青霉素鈉,每只80000 U,每天1 次,連續(xù)3 d。 術(shù)后3 d,造模組動物按體重隨機(jī)分為模型對照組、陽性對照組、蒺藜淫羊藿復(fù)合物低、高劑量組,每組10 只。 陽性對照組動物灌胃給予十一酸睪酮,蒺藜淫羊藿復(fù)合物低、高劑量組灌胃給予相應(yīng)濃度的蒺藜淫羊藿復(fù)合物溶液,其余組別給予純凈水,灌胃體積均為10 mL/kg,1 次1 d,共40 d。

雌鼠的處理:50 只大鼠按45 mg/kg 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,摘除雙側(cè)卵巢。 術(shù)后按上述方法肌注青霉素鈉進(jìn)行抗感染處理。

1.3.3 交配實(shí)驗(yàn)

為使去勢的雌鼠同時(shí)發(fā)情,進(jìn)行交配實(shí)驗(yàn)前2 d,皮下注射給予苯甲酸雌二醇,劑量為0.2 mg/kg；交配實(shí)驗(yàn)前4 h,皮下注射給予黃體酮,劑量為2 mg/kg。 雄鼠在灌胃第30 天晚上按1 只/籠放入飼養(yǎng)籠中,適應(yīng)環(huán)境5 min 后,然后每籠投入1 只發(fā)情雌鼠。 記錄投入雌鼠起40 min 內(nèi),雄鼠首次捕捉雌鼠的時(shí)間、首次射精的時(shí)間、捕捉及射精的次數(shù),并計(jì)算每組雄鼠的捕捉率和射精率[6]。

1.3.4 陰莖勃起實(shí)驗(yàn)

雄鼠在結(jié)束第35 天灌胃的1 h 后,檢測動物的陰莖勃起潛伏期。 將生物機(jī)能儀的電極固定于陰莖根部,以35 V、35 Hz 的電流進(jìn)行刺激,記錄刺激開始到陰莖充血勃起的時(shí)間,記為陰莖勃起潛伏期[6]。

1.3.5 睪酮、臟器系數(shù)檢測

雄性大鼠第40 天末次灌胃1 h 后,動物腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,腹主動脈采血,離心,取上清,根據(jù)試劑盒說明書檢測其中睪酮的含量。 大鼠采血、安樂死后,取睪丸、包皮腺、提肛肌、腎上腺、精囊腺+前列腺,稱重后按公式計(jì)算臟器系數(shù)。

1.3.6 精子數(shù)量、活動率與活力檢測

取左側(cè)附睪,用剪刀中間剪開,放入1 mL 生理鹽水中,振揺并放置10 min,使精子充分溢出,取1滴該液體置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中,在顯微鏡下計(jì)數(shù),得到每毫升稀釋液中含有的精子數(shù)量。 再取1 滴該液體置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中,顯微鏡下觀察200 個(gè)精子,記錄活動精子數(shù)目,按下列公式計(jì)算精子活動率[7]。

在觀察活動率的同時(shí),觀察精子活力,精子活動分為 a、b、c、d 四個(gè)級別,a 級:精子呈快速直線前向運(yùn)動；b 級:慢速或呆滯的前向運(yùn)動；c 級:非前向運(yùn)動；d 級:死精子。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對半去勢大鼠交配實(shí)驗(yàn)的影響

如表1 所示,模型對照組雄性大鼠的捕捉率較正常對照組降低(P＜0.01)。 與模型對照組比較,陽性對照組捕捉率升高(P＜0.01),精力能低、高劑量組的捕捉率、射精率和射精次數(shù)升高,具有顯著差異(P＜0.05)。

表1 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對半去勢大鼠交配實(shí)驗(yàn)的影響(, n=10)Table 1 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on mating test of hemi-castrated rats

表1 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對半去勢大鼠交配實(shí)驗(yàn)的影響(, n=10)Table 1 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on mating test of hemi-castrated rats

注:與正常對照組相比,**P＜0.01；與模型對照組相比,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01。Note. Compared with the normal control group,**P＜0.01. Compared with the model control group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01.

組別Groups捕捉率(%)Capture rate射精率(%)Ejaculation rate捕捉次數(shù)(次)Capture times射精次數(shù)(次)Ejaculation times正常對照組Normal control group 80 60 9.2±6.3 11.3±10.0模型對照組Model control group 60** 50 11.8±14.1 10.2±5.4陽性對照組Positive control group 100＃＃ 60 21.3±13.1 25.0±11.5＃蒺藜淫羊藿復(fù)合物低劑量組Low dose group 100＃＃ 80＃＃ 30.4±19.9 26.8±15.8＃蒺藜淫羊藿復(fù)合物高劑量組High dose group 100＃＃ 70＃＃ 30.9±26.4 28.0±18.8＃

2.2 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對去勢雄性大鼠性功能、激素及生殖系統(tǒng)的影響

如表2 及表3 所示,蒺藜淫羊藿復(fù)合物低劑量組能顯著提高去勢雄性大鼠血清中睪酮的含量(P＜0.05),同時(shí)顯著增加精囊腺和前列腺系數(shù)(P＜0.05)。 而高劑量組可見縮短陰莖勃起潛伏期的趨勢,但無顯著性(P＞0.05)。

表2 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對去勢大鼠勃起潛伏期、血清睪酮的影響(,n=10)Table 2 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on erectile times and serum-testosterone level of hemi-castrated rats

表2 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對去勢大鼠勃起潛伏期、血清睪酮的影響(,n=10)Table 2 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on erectile times and serum-testosterone level of hemi-castrated rats

注:與正常對照組相比,**P＜0.01；與模型對照組相比,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01。Note. Compared with the normal control group,**P＜0.01. Compared with the model control group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01.

組別Groups勃起潛伏期(s)Erectile times睪酮(nmol/L)Testosterone正常對照組Normal control group 5.01±4.01 24.1±3.7模型對照組Model control group 9.27±3.01 17.6±3.8**陽性對照組Positive control group 8.72±3.65 24.6±5.0＃＃蒺藜淫羊藿復(fù)合物低劑量組Low dose group 9.48±4.48 21.2±3.3＃蒺藜淫羊藿復(fù)合物高劑量組High dose group 7.05±3.09 20.7±3.3

表3 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對去勢大鼠性器官臟器系數(shù)的影響(, n=10)Table 3 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on genital organs coefficient of hemi-castrated rats

表3 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對去勢大鼠性器官臟器系數(shù)的影響(, n=10)Table 3 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on genital organs coefficient of hemi-castrated rats

注:與正常對照組相比,*P＜0.05；與模型對照組相比,＃P＜0.05。Note. Compared with the normal control group,*P＜0.05. Compared with the model control group,＃P＜0.05.

組別Groups臟器系數(shù)(mg/g)Organ coefficient睪丸Testicles包皮腺Preputial glands精囊腺和前列腺Seminal vesicles and prostate glands正常對照組Normal control group 3.68±0.16 0.33±0.10 5.97±0.45模型對照組Model control group 3.59±0.30 0.31±0.08 5.29±0.74*陽性對照組Positive control group 3.76±0.64 0.32±0.11 5.98±0.89＃蒺藜淫羊藿復(fù)合物低劑量組Low dose group 3.86±0.19 0.35±0.12 6.03±0.64＃蒺藜淫羊藿復(fù)合物高劑量組High dose group 3.69±0.57 0.35±0.13 5.84±0.85

2.3 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對去勢雄性大鼠精子數(shù)量、精子活動率及精子活力的影響

如表4 所示,與正常對照組比較,模型對照組的精子數(shù)量減少(P＜0.01)、精子活動率降低(P＜0.01)、呈快速直線前向運(yùn)動的精子減少(P＜0.01)、非前向運(yùn)動的精子和死精子增多(P＜0.01)。 與模型對照組比較,蒺藜淫羊藿復(fù)合物高劑量組的精子活動率升高(P＜0.01),呈快速直線前向運(yùn)動的精子增多(P＜0.05),死精子數(shù)量減少(P＜0.01)。

表4 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對去勢大鼠精子數(shù)量、精子活動率和活力的影響(, n=10)Table 4 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on sperm counts, activity ratio and vitality on hemi-castrated rats

表4 蒺藜淫羊藿復(fù)合物對去勢大鼠精子數(shù)量、精子活動率和活力的影響(, n=10)Table 4 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on sperm counts, activity ratio and vitality on hemi-castrated rats

注:與正常對照組相比,**P＜0.01；與模型對照組相比,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01。Note. Compared with the normal control group,**P＜0.01. Compared with the model control group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01.

組別Groups精子數(shù)量(×108/mL)Sperm count精子活動率(%)Motility rate精子活動強(qiáng)度(%)Motility rate a 級Level a b 級Level b c 級Level c d 級Level d正常對照組Normal control group 1.05±0.04 73.5±2.4 125±10 14±6 9±3 53±5模型對照組Model control group 0.78±0.12** 66.4±3.0** 105±7** 15±4 13±3** 67±6**陽性對照組Positive control group 0.94±0.05＃ 70.9±3.6 116±8 13±2 13±3 58±7蒺藜淫羊藿復(fù)合物低劑量組Low dose group 0.92±0.02 68.7±2.7 114±5 11±1 13±2 63±5蒺藜淫羊藿復(fù)合物高劑量組High dose group 0.91±0.02 70.1±2.1＃＃ 116±5＃ 12±3 12±2 60±4＃＃

3 討論

隨著環(huán)境的污染、飲食習(xí)慣的改變及生活壓力的增加,男性的生殖功能障礙呈明顯的上升趨勢,主要表現(xiàn)性欲地下、勃起功能障礙、射精障礙、精子數(shù)量及活力降低等[8-10]。 其中多見于中老年人群,這可能與該類人群受到各種壓力的影響,機(jī)體處于疲勞的狀態(tài)有關(guān)。 此外,睪酮作為雄激素的主要成份,與男性性功能、生育功能有著密切關(guān)系,可促進(jìn)性器官的發(fā)育、第二性征的維持、精子發(fā)生及成熟,而伴隨著年齡增長的睪酮分泌水平下降。 機(jī)體的疲勞狀態(tài)和睪酮分泌減少,共同影響著中老年男性的性功能健康。

中醫(yī)作為我國傳統(tǒng)文化的瑰寶,具有十分重大的研究意義,根據(jù)中醫(yī)理論指導(dǎo)開發(fā)方藥及保健食品一直是研究熱點(diǎn),本課題便是從傳統(tǒng)中醫(yī)理論出發(fā),尋找可以改善上述人群性功能的保健食品。 中醫(yī)認(rèn)為腎藏精,主生殖,為先天之本。 腎精不足,命門火衰則會出現(xiàn)性欲減退、陰莖勃起困難等表現(xiàn),這與男性長期受到各種壓力而導(dǎo)致的疲勞狀態(tài)和伴隨年齡增長的雄激素分泌減少所導(dǎo)致的性功能障礙極為相似,所以補(bǔ)腎益精及補(bǔ)氣類中藥常用于開發(fā)為改善性功能障礙的產(chǎn)品[11-13]。

淫羊藿是小檗科淫羊藿屬多年生草本植物,有堅(jiān)筋骨、益精氣、補(bǔ)腰膝、強(qiáng)心力等作用。 現(xiàn)代藥理研究表明,淫羊藿的主要成分是黃酮類和多糖,淫羊藿總黃酮及其標(biāo)志成分淫羊藿苷可減緩睪丸組織的退行性變化,具有雄激素樣作用,對下丘腦-垂體-性腺軸系統(tǒng)起正向調(diào)節(jié)作用,促進(jìn)睪酮分泌[14-15]；此外,淫羊藿可以減輕大鼠受高強(qiáng)度運(yùn)動量的影響,維持在正常生理水平,同時(shí)促進(jìn)蛋白質(zhì)合成,抑制氨基酸和蛋白質(zhì)分解,提高運(yùn)動訓(xùn)練大鼠血紅蛋白含量和糖原的儲備,從而增強(qiáng)大鼠抗疲勞能力[16-17]。 西洋參具有補(bǔ)氣益血、清肺腎、涼心脾、清虛火、生津止渴、補(bǔ)陰退熱、調(diào)補(bǔ)五臟、安神除煩、固精等功效。 現(xiàn)代研究證明,西洋參主要有效成分為人參皂苷類成分,西洋參在抗疲勞、增強(qiáng)免疫力等方面均有良好的功效[18-19]。 蒺藜為蒺藜科植物蒺藜的果實(shí),具有平肝解郁、活血祛風(fēng)、明目止癢的功效。 蒺藜主要含有皂苷類、黃酮類、生物堿類、多糖類等化合物,其中的蒺藜總皂甙能促進(jìn)精液產(chǎn)生,增加性欲,促進(jìn)雌性大鼠發(fā)情,提高生殖能力；臨床研究發(fā)現(xiàn)可增加男人的精子數(shù)及活力,治療男性性功能低下,其作用可能與其提高體內(nèi)性激素的含量有關(guān)[20-23]。 這一功效可能與其中的原薯蕷皂甙在體內(nèi)通過代謝轉(zhuǎn)化成脫氫表雄酮有關(guān)。同時(shí)蒺藜可以促進(jìn)蛋白質(zhì)合成,抑制氨基酸和蛋白質(zhì)分解,提高血紅蛋白含量和糖原的儲備,增強(qiáng)抗疲勞能力。 蒺藜淫羊藿復(fù)合物便是由淫羊藿提取物、西洋參提取物和蒺藜提取物組方而成,在增強(qiáng)機(jī)體抗疲勞能力的基礎(chǔ)上加以補(bǔ)腎益精的作用。

選擇合適的指標(biāo)和合適的動物模型,是客觀評價(jià)樣品功效的關(guān)鍵。 大鼠交配過程中的捕捉次數(shù)、射精次數(shù)、捕捉率和射精率可直接反映其性功能的強(qiáng)弱,作為評價(jià)性功能常用的指標(biāo)。 而附性器官,如包皮腺、精囊腺和前列腺等,在受到雄激素的影響時(shí),會被促進(jìn)發(fā)育而重量增加,所以附性器官的重量變化可反應(yīng)樣品的雄激素樣作用。 單側(cè)去勢雄鼠能模擬人體睪酮分泌減少的狀態(tài),雄性大鼠經(jīng)單側(cè)去勢后,交配過程中捕捉率降低,陰莖勃起潛伏期延長,精囊腺和前列腺系數(shù)降低,精子數(shù)量、精子活動率降低,死精子增加。 故本課題采用了這一動物模型對蒺藜淫羊藿復(fù)合物的改善性功能功效進(jìn)行評價(jià)。

本課題研究發(fā)現(xiàn),由淫羊藿、西洋參和蒺藜提取物組方而成的蒺藜淫羊藿復(fù)合物可提高半去勢雄性大鼠交配過程中的捕捉率、射精率和射精次數(shù),促進(jìn)精囊腺和前列腺的生長發(fā)育,同時(shí)改善睪酮缺乏所致的精子數(shù)量減少、精子活力低下,這些功能可能與蒺藜淫羊藿復(fù)合物增加睪酮分泌和雄激素樣作用有關(guān)。 因此,蒺藜淫羊藿復(fù)合物可適用于體力疲勞和年齡增長所致的雄激素分泌低下的人群,改善其性功能表現(xiàn)。