郝 志胡明會邢 影劉 坤張 浩楊煥新李自發(fā)耿希文*魏 盛*

(1.山東中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院,濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學實驗中心,濟南 250355；3.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)生物工程學院,濟南 250355)

經前煩躁障礙(premenstrual dysphoric disorder,PMDD)是經前期綜合征的一種以情緒癥狀為主的嚴重亞型[1]。 患者在月經來潮的前1 周出現(xiàn)情緒不穩(wěn)定、易怒、抑郁情緒、焦慮、興趣缺失等癥狀,并在不久后癥狀自行改善。 PMDD 已被美國《精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊》(DSM-V)歸為一個新型診斷類別[2]。 值得注意的是,PMDD 與抑郁癥和焦慮癥的終生共病率很高,超過50%的PMDD 患者被診斷為終生重度抑郁癥[3],因此有關PMDD 的診斷與治療逐漸吸引了社會各界的關注。 目前PMDD 發(fā)病的潛在機制仍未明確。

在傳統(tǒng)中醫(yī)學中,PMDD 被冠以月經前后諸癥,屬于典型情志病證。 現(xiàn)代醫(yī)家基于肝主疏泄理論,將PMDD 認定為肝氣逆證、肝氣郁證兩種亞型[4]。20 世紀90 年代山東地區(qū)女性流行病學調查發(fā)現(xiàn),該病證候呈規(guī)律性分布, 肝氣逆證占患者總數(shù)的58.9%[5],急躁易怒為其最主要的臨床表現(xiàn)[6]。 現(xiàn)代研究表明,PMDD 的發(fā)病機制可能與黃體期5-羥色胺系統(tǒng)、γ-氨基丁酸A 型受體(GABAA)對神經甾體四氫孕酮的敏感性變化和涉及情緒功能的腦回路改變有關[7],而5-HT3R 和CB1R 共表達于可調控情緒的額葉皮層、海馬、杏仁核等腦區(qū)GABA 能神經元的突觸前膜[8]。 同時,5-HT 與5-HT3R 結合可促進GABA 的釋放,CB1R 信號途徑可通過逆向傳遞抑制GABA 的釋放。 由前期工作我們發(fā)現(xiàn)中藥白香丹膠囊(BXD)可能是通過調節(jié)血清及大腦皮層中GABA 含量發(fā)揮療效[9],其是否可作用于情緒調節(jié)腦區(qū)的5-HT3R 和 CB1R 受體進而發(fā)揮效應,仍有待進一步探查。 因此,本研究通過觀察BXD、5-HT3R 與 CB1R 的特異性激動拮抗劑對PMDD 焦慮癥大鼠焦慮樣行為的影響,評價比較其干預效應,并對BXD 的干預作用與5-HT3R、CB1R的相關性進行探索。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級健康雌性大鼠,Wistar 大鼠 150 只,6 ～ 8周齡,體重(140±20)g；SD 雌性大鼠 50 只,4 ～6 周齡,體重(100±20)g。 由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[SCXK(京)2021-0006]。 動物飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心[SYXK(魯)2017-0022],實驗操作均在暗淡紅燈(＜25 lux)下進行,均遵守美國NIH 頒布的《實驗動物護理和使用指南》[10]要求。 本研究獲山東中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準(DWSY201703013),符合3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

白香丹膠囊(由山東中醫(yī)藥大學藥劑實驗室提供)；戊巴比妥鈉(SigmaAldrich(上海)貿易有限公司,批號20160414)；苯甲酸雌二醇(Macklin 有限公司,批號10042617)；孕酮(SigmaAldrich(上海)貿易有限公司,批號101327062)；雌二醇(Macklin 有限公司,批號10006920)；羧甲基纖維素鈉(上海國藥集團,批號 20170110)；1-phenylbiguanide(PBG,TCI(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司,批號FIA01-SOS)；WIN55212-2(WIN,MCE 中國(上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司),批號 18285)；Granisetron(MCE 中國(上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司),批號 HYB0071)；Rimonabant(MCE 中國(上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司),批號HY-14136)。 SuperMaze 動物行為分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司,型號XR-Xmaze)；曠場實驗系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司,型號XR-XG201)；高架十字迷宮實驗系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司,型號XR-XG201)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗設計流程

實驗設計流程見圖1。

圖1 特異性激動/拮抗劑和BXD 對PMDD 焦慮癥大鼠模型干預效應流程圖Figure 1 Flow chart of intervention effects of specific agonists/antagonists and BXD on PMDD anxiety rat model

1.3.2 構建PMDD 動物模型的復合因子

通過大鼠卵巢摘除、激素誘導和居住入侵3 種復合因子,構建PMDD 焦慮癥動物模型。

1.3.3 卵巢摘除手術

手術器械用75%乙醇溶液浸泡并高溫消毒,大鼠術前禁食。 于大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉進行麻醉(劑量60 mg/kg),在其后肢髂前上脊上部切口,沿脂肪找到子宮結扎摘除,滴入青霉素鉀進行消毒。 術后大鼠單籠飼養(yǎng),每天腹腔注射青霉素2萬單位/只進行消炎,持續(xù)3 d。

1.3.4 外源性激素誘導正常動情周期

卵巢摘除術后2 周進行外源激素誘導正常動情周期。 第1 天11:30 每只大鼠皮下注射0.5 μg/0.1 mL 苯甲酸雌二醇,第 2 天 19:30 注射 0.5 μg/0.1 mL 雌二醇,第 3 天 7:30 注射 0.5 mg/0.1 mL 孕酮,持續(xù)5 個周期。

1.3.5 居住入侵(resident-intruder test, RIT)構建PMDD 焦慮癥大鼠模型

居住入侵實驗評估動物由焦慮情緒產生的攻擊行為。 實驗于12:30～15:30 在暗淡光線(＜2 lux)下進行,攝像記錄10 min 內大鼠的攻擊行為[11]?；旌凸粜袨榈梅值挠嬎愎綖?復合攻擊行為得分=攻擊次數(shù)+0.2×攻擊時間(s)+撕咬次數(shù)+0.2×攀爬時間(s)。

1.3.6 曠場行為測試(open-field test, OFT)

曠場實驗檢測動物在新異環(huán)境中的自主運動行為和焦慮程度[12]。 記錄6 min 內大鼠的運動總路程(total distance)、中央?yún)^(qū)停留時間(time in center area)和中央?yún)^(qū)進入次數(shù)(number of central district entry)。

1.3.7 高架十字迷宮行為測試(elevated plus maze,EPM)

高架十字迷宮評估動物焦慮樣行為[13]。 記錄5 min 內大鼠進入開放臂次數(shù)(open arm entry,OE)、進入開放臂時間(time in open arm, OT)、進入閉合臂次數(shù)(close arm entry, CE)、進入閉合臂時間(time in close arm, CT)。 公式:OE% =OE/(OE+CE)×1005,OT%=OT/(OT+CT)×100%。

1.3.8 分組、給藥

實驗1:統(tǒng)計術后第1 個R 期(receptive phases period)、NR 期(non-receptive phases period)居住鼠RIT 的攻擊得分差值,由低到高排序,將差值前30%的大鼠分為對照組,后30%為應激組并將其隨機均分為模型組、PBG 組、WIN 組、PBG+WIN 組、BXD組[14]。 灌胃給藥12 d,每天8:30 給藥,每只大鼠給藥量為1 mL/100 g[15]。 實驗所需藥物均使用0.5%CMC-Na 助溶,給予空白及模型組等體積的CMC-Na溶液。

實驗2:大鼠分組包括對照組、模型組、GRA 組、RIM 組、GRA+RIM 組、BXD 組。 其余方法同實驗 1。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用Graph Pad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析,以平均數(shù)±標準差()表示。 給藥前后組間比較用重復測量的雙因素方差分析,超過兩組間比較用單因素方差分析,兩組間比較用t檢驗,顯著性水平設定為P＜0.05。

2 結果

白香丹膠囊改善經前期焦慮癥的作用機制,結果如下。

2.1 特異性激動/拮抗劑和BXD 對PMDD 焦慮癥大鼠模型攻擊行為的影響

如圖2A、2C 所示,實驗1、2 基線期應激組的攻擊行為得分相較于對照組具有顯著差異(P＜0.0001)；如圖2B、2D 所示,給藥前各應激組的攻擊行為得分無顯著差異,給藥后PBG 組、RIM 組、BXD組的攻擊行為得分相較于模型組顯著降低(P＜0.001,P＜0.0001)。

圖2 特異性激動/拮抗劑、BXD 影響大鼠的攻擊行為得分(n=9)Note. A, Scores of aggressive behavior in the control group and the model group in the baseline period of experiment 1. B, Score of aggressive behavior in each group before and after administration in experiment 1. C, In experiment 2, the scores of aggressive behavior in the control group and the model group at baseline. D, Aggressive behavior scores of each group before and after administration in Experiment 2. Compared with the control group,****P＜0.0001. Compared with the model group,＃＃＃P＜0.001,＃＃＃＃P＜0.0001.Figure 2 Aggressive behavior scores of rats affected by specific agonists/antagonists and BXD

2.2 特異性激動劑和BXD 對PMDD 焦慮癥大鼠模型曠場測試的影響

2.2.1 給藥前后NR 期OFT 結果

如圖 3A、3B、3C 所示,實驗 1 給藥前各組的OFT 總路程無顯著差異,各應激組的中央?yún)^(qū)進入次數(shù)及停留時間相較于對照組顯著降低(P＜0.05)；如圖3D、3E、3F 所示,給藥后各組的 OFT 總路程無顯著差異,模型組的中央?yún)^(qū)進入次數(shù)及停留時間相較于對照組顯著降低(P＜0.05),PBG、BXD 組相較于模型組顯著升高(P＜0.05,P＜0.001)。

圖3 實驗1 給藥前后PMDD 焦慮癥大鼠模型NR 期OFT 測試結果(n=9)Note. A, Total distance of OFT before administration. B, Number of central area entry before administration. C, Time in center area before administration. D, Total distance of OFT after administration. E, Number of central area entry after administration. F, Time in center area after administration. Compared with the control group,*P＜0.05. Compared with the model group,＃P＜0.05.Figure 3 Test results of OFT in NR phase of PMDD anxiety rat model before and after administration of Experiment 1

2.2.2 給藥前后NR 期EPM 結果

如圖4A、4B 所示,實驗1 給藥前各應激組的EPM 開放臂進入次數(shù)及時間百分比相較于對照組顯著降低(P＜0.05)；如圖 4C、4D 所示,給藥后模型組的EPM 開放臂進入次數(shù)及時間百分比相較于對照組顯著降低(P＜0.05)；PBG、BXD 組相較于模型組顯著升高(P＜0.05,P＜0.01)。

圖4 實驗1 給藥前后PMDD 焦慮癥大鼠模型NR 期EPM 測試結果(n=9)Note. A, Percentage of EPM open arm entry times before administration. B, Percentage of EPM open arm entry time before administration. C,Percentage of EPM open arm entry times after administration. D, Percentage of EPM open arm entry time after administration. Compared with the control group,*P＜0.05. Compared with the model group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01.Figure 4 EPM test results in NR phase of PMDD anxiety rat model before and after administration of Experiment 1

2.3 特異性拮抗劑和BXD 對PMDD 焦慮癥大鼠模型曠場測試的影響

2.3.1 給藥前后NR 期OFT 結果

如圖 5A、5B、5C 所示,實驗 2 給藥前各組的OFT 總路程無顯著差異,各應激組的中央?yún)^(qū)進入次數(shù)及停留時間相較于對照組顯著降低(P＜0.05)；如圖5D、5E、5F 所示,給藥后各組的 OFT 總路程無顯著差異,模型組的中央?yún)^(qū)進入次數(shù)及停留時間相較于對照組顯著降低(P＜0.01,P＜0.05),RIM 組、BXD 組相較于模型組顯著升高(P＜0.05),GRA 組的中央?yún)^(qū)進入次數(shù)顯著降低(P＜0.05)。

圖5 實驗2 給藥前后PMDD 焦慮癥大鼠模型NR 期OFT 測試結果(n=9)Note. A, Total distance of oft before administration. B, Number of central area entry before administration. C, Time in center area before administration. D, Total distance of OFT after administration. E, Number of central area entry after administration. F, Time in center area after administration. Compared with the control group,*P＜0.05,**P＜0.01. Compared with the model group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01.Figure 5 Test results of OFT in NR phase of PMDD anxiety rat model before and after administration of Experiment 2

2.3.2 給藥后NR 期EPM 結果

如圖6A、6B 所示,實驗2 給藥前各應激組的EPM 開放臂進入次數(shù)及時間百分比相較于對照組顯著降低(P＜0.05)；如圖 6C、6D 所示,給藥后模型組的EPM 開放臂進入次數(shù)及時間百分比相較于對照組顯著降低(P＜0.05,P＜0.01),RIM 組、BXD 組相較于模型組顯著升高(P＜0.05,P＜0.01),GRA 組的開放臂進入次數(shù)相較于模型組顯著降低(P＜0.05)。

圖6 實驗2 給藥后PMDD 焦慮癥大鼠模型NR 期EPM 測試結果(n=9)Note. A, Percentage of EPM open arm entry times before administration. B, Percentage of EPM open arm entry time before administration. C,Percentage of EPM open arm entry times after administration. D, Percentage of EPM open arm entry time after administration. Compared with the control group,*P＜0.05,**P＜0.01. Compared with the model group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01.Figure 6 EPM test results in NR phase of PMDD anxiety rat model after administration in Experiment 2

3 討論

本研究利用居住入侵構建PMDD 焦慮癥大鼠模型,通過OFT 和EPM 行為學測評,比較了中藥白香丹膠囊對比5-HT3R 和CB1R 的拮抗劑和激動劑在改善該模型大鼠動情周期非接受期焦慮樣情緒的作用效果。 結果表明:中藥白香丹膠囊、5-HT3R激動劑 1-phenylbiguanide 和 CB1R 特異性拮抗劑Rimonabant 可有效糾正PMDD 焦慮癥模型大鼠的焦慮樣行為。 提示白香丹膠囊可能通過作用于5-HT3R 和CB1R 來發(fā)揮抗PMDD 焦慮樣情緒作用。

白香丹膠囊是根據(jù)我國第1 個針對PMS 肝氣逆證的中藥復方經前平顆粒化裁而來,由白芍、香附、丹皮的主要藥效組分芍藥苷、香附揮發(fā)油(以香附酮為主要成分)和丹皮酚等配伍組成,具有平肝理氣、抗焦慮、緩解憤怒情緒的作用[16]。 然而“肝氣逆證模型”的病因、癥候表現(xiàn)在動物體內很難模擬,本文通過大鼠卵巢摘除、激素誘導動情周期和居住入侵3 種復合因子制備PMDD 焦慮癥動物模型,且白香丹膠囊對其有顯著改善作用,故該模型可模擬PMDD 肝氣逆證。 本研究結果與尹征[17]、王帥等[18]有關白香丹藥效的研究結果一致,即白香丹膠囊可有效改善PMDD 焦慮癥動物模型大鼠的焦慮樣行為。 然而,由于白香丹膠囊成分的多樣性,在該藥物作用于PMDD 焦慮癥的微觀機制方面尚未得到明確。

通過系列行為學測評,我們發(fā)現(xiàn),白香丹膠囊與5-HT3R 激動劑 1-phenylbiguanide 和 CB1R 特異性拮抗劑Rimonabant 發(fā)揮了類似的抗焦慮效果。有研究表明,5-羥色胺(5-HT)受體參與調控多種情緒、應激反應[19],其異常信號轉導可引起神經內分泌紊亂,是 PMDD 發(fā)病的原因之一[20-21]。 5-HT3R屬于配體門控離子通道,5-HT 與5-HT3R 結合可促進GABA 的釋放,調節(jié)郁怒情緒的表達,其異常表達可影響多種神經遞質的代謝,進而影響人體的精神健康水平[22-23]。 而GABA 是廣泛存在于哺乳動物神經系統(tǒng)中的抑制性神經遞質,對于調控神經元的興奮程度具有重要影響。 GABA 及其受體水平調節(jié)紊亂與多種情志病發(fā)病機制密切相關[24-25]。 同時,黃體期5-HT 系統(tǒng)異常活動及類固醇孕酮代謝物四氫孕酮引起腦內 GABAA受體的改變,影響GABA 釋放進而導致PMDD 的發(fā)生[26]。

CB1R 是大麻素受體的主要亞型之一,以神經元的形式廣泛分布于前腦、基底核、小腦、海馬和大腦皮層等腦區(qū),與情緒反應、應激反應及穩(wěn)定內環(huán)境等方面密切相關[27-28]。 CB1R 可調節(jié)突觸傳遞和神經元的興奮性,突觸后神經元可釋放內源性大麻樣物質與 CB1R 結合,抑制 GABA 釋放[29-30]。 內源性大麻素和5-HT 可協(xié)同作用調節(jié)中樞神經系統(tǒng),具有調節(jié)疼痛、成癮性、抑郁、焦慮情緒等功能[31]。目前研究已經發(fā)現(xiàn)5-HT3R 與CB1R 介導情緒調控腦區(qū)GABA 釋放參與PMDD 焦慮癥發(fā)病,5-HT3R和CB1R 共表達于額葉皮層、海馬、杏仁核等情緒相關腦區(qū)GABA 能神經元的突觸前膜,兩者協(xié)同調控上述腦區(qū)GABA 釋放。 課題組前期研究結果亦表明,白香丹膠囊可以通過調節(jié)血清及大腦皮層中GABA 含量來發(fā)揮療效。 由此,我們有理由推測,白香丹膠囊可能通過作用于5-HT3R 與CB1R,促進相關腦區(qū)GABA 的釋放,發(fā)揮抗PMDD 焦慮癥的大鼠焦慮樣行為。 然而,本研究僅進行了行為藥效表型觀察和比較,并未從細胞、分子等微觀層面對PMDD的發(fā)病及治療進行深入機理探討。 今后的工作中我們將選取與這一機制密切相關的信號轉導通路深入探查PMDD 發(fā)病及中藥干預的可能分子機制。