馬澤彬，王書(shū)玉，閆 欣，許大慶

中國(guó)有45.4%的被調(diào)查者在過(guò)去1個(gè)月中曾經(jīng)歷過(guò)不同程度的失眠[1]。改善睡眠習(xí)慣可以使一部分人們改善失眠狀態(tài)，但是也有一部分人們即便改善了睡眠習(xí)慣，也依舊難以入睡。研究顯示睡眠時(shí)間過(guò)短、失眠或睡眠障礙與高血壓、糖尿病和肥胖具有一定的關(guān)聯(lián)性[2]。目前臨床治療失眠的藥物品種較多，但是長(zhǎng)期使用的風(fēng)險(xiǎn)有所增加，會(huì)造成失眠病人出現(xiàn)戒斷癥狀，如情緒激動(dòng)、易怒憂(yōu)郁、心跳加快，胃部不適，甚至產(chǎn)生健忘癥等，同時(shí)也逐漸增加了藥物的耐藥性，不斷增加藥量造成反復(fù)循環(huán)的過(guò)程，最后服用藥物也不能有效治療失眠癥。本文研究采用睡眠方丸劑治療失眠，將其制備成顆粒劑便于服用,觀察睡眠方顆粒劑的作用機(jī)制，并設(shè)置高、中、低劑量組，尋找合適的劑量，便于臨床使用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 動(dòng)物： SPF級(jí)雌雄各半健康SD大鼠60只，體重(180±20)g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)證號(hào)SCXK(寧)2020-0001，分籠進(jìn)行飼料喂養(yǎng)。室溫控制在20～22 ℃，相對(duì)濕度控制在45%～65%，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，便于實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展。

1.1.2 試藥：方劑由菟絲子、龍骨、香菇、藜蘆、青鹽、薰衣草、芒硝組成。本方所用藥物如下：菟絲子(批號(hào)：1911319)、龍骨(批號(hào)：2003259)、香菇、藜蘆(批號(hào)：1701155)、青鹽(批號(hào)：1807084)、薰衣草(批號(hào)：1906150)、芒硝(批號(hào)：5660018091)，(藥物換算單位：一兩約等于18 g，一錢(qián)約等于3 g)。均購(gòu)于銀川市第一人民醫(yī)院，且經(jīng)鑒定符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.3 試劑與儀器：5-HT Elisa試劑盒(產(chǎn)品批號(hào)：U4AQJA2PUG)、5-HIAA Elisa試劑盒(產(chǎn)品批號(hào)：BX9T335E23)、NA Elisa試劑盒(產(chǎn)品批號(hào)：7VEXVQE6QG)、 DA Elisa試劑盒(產(chǎn)品批號(hào)：IHUU7H8FAG)均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；PBS緩沖液(產(chǎn)品批號(hào)：0033519)購(gòu)自上海逍鵬生物科技有限公司；對(duì)氯苯丙氨酸(PCAP)(產(chǎn)品批號(hào)：S02S11Y123233)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。連續(xù)波長(zhǎng)及核酸蛋白微量檢測(cè)酶標(biāo)儀(產(chǎn)品型號(hào)：INFITEM200PRO)，購(gòu)自瑞士Tecan；微型高速離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 分組：將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照藥睡眠方丸劑組和睡眠方顆粒劑高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只大鼠。除正常組外，其余各組大鼠均建立失眠模型。

1.2.2 模型建立：每天上午9點(diǎn)開(kāi)始對(duì)大鼠腹腔注射對(duì)氯苯丙氨酸PCPA混懸液[350 mg/(kg·d)]，每日1次，連續(xù)注射3 d 進(jìn)行觀察，正常組大鼠腹腔注射等體積0.9%生理鹽水。于第1次腹腔注射PCPA混懸液30 h 后，除正常大鼠外，其他組大鼠出現(xiàn)異常興奮，大量活動(dòng)且不停，提示造模成功。

1.2.3 給藥方法：灌胃治療，每天1次，連續(xù)灌胃7 d。其中正常組、模型組大鼠各0.9%生理鹽水標(biāo)準(zhǔn)灌胃；陽(yáng)性對(duì)照藥睡眠方丸劑組3 g/kg標(biāo)準(zhǔn)灌胃；睡眠方顆粒劑高劑量組6 g/kg、中劑量組3 g/kg、低劑量組1.5 g/kg標(biāo)準(zhǔn)灌胃。

1.2.4 腦組織取材及處理：灌胃后第7天晚上開(kāi)始禁食供水12 h，于第8天上午腹腔注射水合氯醛麻醉后全程在冰面上操作，進(jìn)行斷頭處理，迅速取出大腦予以稱(chēng)重。后續(xù)工作在冰浴環(huán)境下進(jìn)行，避免組織壞死，加同等體積的PBS洗去血液后，手動(dòng)快速勻漿，待沒(méi)有組織塊后，按照Elisa試劑盒要求所有組織液離心10 min，取上清液根據(jù)各指標(biāo)檢測(cè)步驟進(jìn)行操作并測(cè)定。

1.2.5 檢測(cè)指標(biāo)：測(cè)定比較各組大鼠腦組織神經(jīng)遞質(zhì) 5-HT、5-HIAA、NA、DA含量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦組織5-HT和5-HIAA的含量情況：與正常組比較，模型組大鼠腦組織5-HT含量顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照藥睡眠方丸劑組，睡眠方顆粒劑高、中、低劑量組大鼠腦組織5-HT含量顯著升高(P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照藥睡眠方丸劑組比較，睡眠方顆粒劑高劑量組5-HT含量顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腦組織5-HT和5-HIAA的含量比較

2.2 各組大鼠腦組織DA和NA的含量情況：與正常組比較，模型組大鼠腦組織DA含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照藥睡眠方丸劑組、睡眠方顆粒劑高、中劑量組大鼠腦組織DA含量顯著降低(P<0.05)，睡眠方顆粒劑低劑量組含量降低(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腦組織DA和NA的含量比較

3 討論

《景岳全書(shū)》曰：“及別無(wú)所累而常多不寐者,總屬真陰精血不足,陰陽(yáng)不交,而神有不安其室耳”[3]，失眠的病位與腎相關(guān)。失眠的病位與心相關(guān)。睡眠方是治療失眠的經(jīng)典藥方[4]。本研究選擇睡眠方丸劑作為陽(yáng)性對(duì)照藥，一方面肯定了睡眠方丸劑在臨床中的作用；另一方面睡眠方顆粒劑是在原方的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)劑型改造后分為高、中、低劑量組進(jìn)行研究，研究要證實(shí)通過(guò)劑型改造后睡眠方顆粒劑的作用是肯定的，同時(shí)找出最佳劑量便于臨床劑量的確定。進(jìn)一步確定睡眠方顆粒劑對(duì)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響，探討其初步的作用機(jī)制。

睡眠與覺(jué)醒節(jié)律所涉及的神經(jīng)生理過(guò)程較為復(fù)雜[5]，很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)如5-HT、5-HIAA、NE/NA、DA等是參與睡眠-覺(jué)醒機(jī)制的經(jīng)典單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)。李恒飛等[6]學(xué)者用吳茱萸敷貼涌泉穴，觀察對(duì)失眠大鼠影響的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為，吳茱萸敷貼涌泉穴可通過(guò)興奮五羥色胺能神經(jīng)元，抑制藍(lán)斑改善失眠。胡金霞等[7]學(xué)者觀察景衣安神散穴位貼敷對(duì)失眠大鼠神經(jīng)遞質(zhì)影響的研究中發(fā)現(xiàn)，失眠與神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化有關(guān)。其中5-HT及其代謝產(chǎn)物5-HIAA可以幫助改善睡眠，而DA及NA/NE含量升高能夠引起覺(jué)醒，從而導(dǎo)致失眠的發(fā)生。胡文卓等[8]學(xué)者研究蛇床子中香豆素類(lèi)成分佛手柑內(nèi)酯對(duì)失眠大鼠神經(jīng)遞質(zhì)的影響認(rèn)為，佛手柑內(nèi)酯的催眠作用與升高腦干內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、5-HIAA含量，降低腦內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)NE和DA含量相關(guān)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)佛手柑內(nèi)酯可以通過(guò)調(diào)節(jié)腦內(nèi)興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的含量從而改善睡眠與覺(jué)醒周期，進(jìn)而改善睡眠質(zhì)量。本研究顯示，睡眠方顆粒劑對(duì)治療失眠大鼠具有一定的作用，但是劑量不同作用程度也不盡相同。與模型組相比，睡眠方顆粒劑高、中、低劑量組大鼠腦組織5-HT、5-HIAA含量呈升高趨勢(shì)，大鼠腦組織DA、NA呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明造模成功。但與陽(yáng)性對(duì)照藥睡眠方丸劑組相比，睡眠方顆粒劑高劑量組大鼠腦組織5-HT含量2.49 μg/g，5-HIAA含量1.60 μg/g，呈升高趨勢(shì)；NA含量1.66 μg/g呈降低趨勢(shì)；DA含量2.70 μg/g，證明睡眠方顆粒劑高劑量作用優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥睡眠方丸劑組。與陽(yáng)性對(duì)照藥相比，睡眠方顆粒劑中劑量組大鼠腦組織5-HT、5-HIAA、DA、NA含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。證明睡眠方顆粒劑中劑量作用與陽(yáng)性對(duì)照藥睡眠方丸劑組相似。與陽(yáng)性對(duì)照藥睡眠方丸劑組相比，睡眠方顆粒劑低劑量組大鼠腦組織5-HIAA、DA無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，5-HT含量下降、NA含量升高。證明睡眠方顆粒劑低劑量組作用劣于陽(yáng)性對(duì)照藥睡眠方丸劑組。由此可見(jiàn)，睡眠方顆粒劑高劑量組作用效果更好，更適合推薦臨床使用。其作用機(jī)制是通過(guò)升高5-HT、5-HIAA，降低DA、NA含量而發(fā)揮作用。

本方的君藥為菟絲子，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品[9]。菟絲子的功效為滋補(bǔ)肝腎，固精縮尿，安胎，明目，止瀉。用于陽(yáng)痿遺精，尿有余瀝，遺尿尿頻，腰膝酸軟，目昏耳鳴，腎虛胎漏，胎動(dòng)不安，脾腎虛瀉。劉海云等[10]通過(guò)對(duì)大鼠使用對(duì)氯苯丙氨酸進(jìn)行造模，研究菟絲子提取物對(duì)失眠大鼠神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響，發(fā)現(xiàn)菟絲子提取物可以改善大鼠失眠的情況，并通過(guò)改善失眠大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，升高血清中5-HT含量，降低DA含量發(fā)揮作用。菟絲煎由菟絲子、人參、山藥等組成，楊志敏教授研究菟絲子認(rèn)為：填精固腎，恢復(fù)腎主封藏的機(jī)能有益于部分慢性失眠患者康復(fù)[11]。菟絲子作為君藥發(fā)揮著補(bǔ)髓填精，補(bǔ)益脾腎從而改善睡眠的作用；龍骨作為重鎮(zhèn)安神藥，鎮(zhèn)靜安神，治驚癇癲狂，怔忡健忘，失眠多夢(mèng)[12]。《本草綱目》中認(rèn)為龍骨可以“益腎鎮(zhèn)驚”；香菇富含香菇多糖，具有多種藥理活性，藥用價(jià)值極高[13]，既具有抗抑郁、抗疲勞的作用，又可以間接保護(hù)長(zhǎng)期失眠患者的神經(jīng)系統(tǒng)；薰衣草很早就被用來(lái)提取制備成薰衣草精油從而起到治療失眠的作用效果，研究顯示[14]薰衣草精油起到安眠作用的是芳樟醇和其他幾種成分的協(xié)同結(jié)果，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的變化實(shí)現(xiàn)的。楊瑩等[15]研究證明通過(guò)嗅覺(jué)途徑吸入薰衣草精油就可以安全而有效地改善原發(fā)性失眠癥患者的失眠情況。本方多種藥物的作用機(jī)制都有不同程度改善睡眠的作用，說(shuō)明作者選擇使用該方作為研究方向是正確地，但是《名醫(yī)別錄》記載藜蘆其“味苦，微寒，有毒”，張子和《儒門(mén)事親》卷十四提到的十八反中指出“諸參辛芍叛藜蘆”，藜蘆的毒性作用大，應(yīng)盡量避免內(nèi)服。且本研究發(fā)現(xiàn)目前的藥方成分中大量使用芒硝和青鹽，口感偏咸的同時(shí)還會(huì)造成大鼠飲水量增加，間接說(shuō)明芒硝和青鹽會(huì)作用于腎臟，大量的鹽性成分有可能會(huì)傷及腎臟。上述這三味藥究竟發(fā)揮著怎樣的作用，其毒性是否對(duì)患者用藥產(chǎn)生作用，長(zhǎng)期服用本藥物是否發(fā)生毒性蓄積，等等，以上問(wèn)題有待于進(jìn)一步研究，這為本課題的研究提供了新的思路和方向，筆者會(huì)在此基礎(chǔ)上繼續(xù)研究，為失眠患者選擇合理藥物提供更多依據(jù)。