李 雯，胡俊威，金 珠

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院,上海 200137；2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是2型糖尿病的并發(fā)癥之一，也是最常見的神經(jīng)病變原因。該病臨床癥狀包括感覺障礙和肢體改變，感覺障礙主要表現(xiàn)為麻木、疼痛、襪套樣感覺和四肢燒灼感等[1]。有學(xué)者對美國、英國等14個不同國家2型糖尿病患者的DPN患病率進(jìn)行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，DPN在不同國家的總體患病率約為26.71%[2]。DPN的發(fā)病機制尚不清楚且十分復(fù)雜，包括糖脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激反應(yīng)、微血管異常、免疫炎癥異常等，其中氧化應(yīng)激反應(yīng)是造成DPN等神經(jīng)病變的重要原因。有研究表明，高糖狀態(tài)可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡異常[3]，凋亡細(xì)胞中抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)減少，促凋亡基因Bax表達(dá)增加，而抑制細(xì)胞凋亡可以預(yù)防糖尿病氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)損傷[4]。文獻(xiàn)研究顯示，針灸治療是一種綜合療法，可改善DPN患者四肢麻木、疼痛、感覺紊亂、周圍神經(jīng)傳導(dǎo)速度，可促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后功能的恢復(fù)，且可以降低坐骨神經(jīng)中Bax表達(dá)和升高Bcl-2表達(dá)[5-7]。但關(guān)于針刺透穴法調(diào)節(jié)DPN大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡、修復(fù)坐骨神經(jīng)損傷的實驗研究較少，因此本實驗進(jìn)行了相關(guān)研究，旨在為針刺透穴法用于DPN的治療提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠18只，體重180～200 g，由北京維通利華實驗動物有限責(zé)任公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(京)2016-0011。大鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境安靜、清潔，室內(nèi)恒溫(22±2)℃，濕度60%～70%，每日光照12 h，自由攝水飲食。本實驗方案已通過上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會審查(PZSHUTCM201030022)，操作均符合實驗動物倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.2主要儀器與試劑 毫針(0.25 mm×25 mm，蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司)，華佗牌SDZ-V型電子針療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，血糖儀(德國羅氏公司)，脫水機、包埋機(JJ-12J、JB-P5，武漢俊杰電子有限公司)，病理切片機(RM2016，德國徠卡儀器有限公司)，可調(diào)型移液器(德國Eppendorf公司)，Nikon DS-U3成像系統(tǒng)、Nikon Eclipse C1光學(xué)顯微鏡(日本尼康儀器有限公司)，小垂直板電泳槽(美國bio-rad公司)，超靈敏多功能成像儀(美國GE公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、QuickBlock Western封閉液(中國碧云天公司)，RIPA裂解液、凝膠快速配制試劑盒(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；D12451高糖高脂飼料(北京科奧協(xié)力公司)，鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)，Anti-Bax抗體(250280，成都正能生物公司)，Anti-Bcl-2抗體(250198，成都正能生物公司)。

1.3實驗方法 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選取6只作為空白組，給予維持飼料喂養(yǎng)6周后腹腔注射緩沖液；其余12只大鼠參考Davidson等[8]和何姣等[9]的造模方法建立DPN模型，即給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周后，腹腔注射35 mg/kg的STZ緩沖液(pH 4.1)，注射后48 h隨機血糖大于16.7 mmol/L即認(rèn)為造模成功。將成模大鼠隨機分為模型組和電針組，每組6只。將電針組大鼠在自制鼠架上固定針刺，參照《實驗針灸學(xué)》[10]常用動物穴位定位法，將毫針從陰陵泉透刺到陽陵泉、內(nèi)關(guān)透刺到外關(guān)，并連接電針治療儀，波形選取疏密波，頻率2 Hz，電流強度以刺激部位皮肌微顫為度，20 min/次，隔日1次，共干預(yù)7次?？瞻捉M和模型組大鼠不予電針干預(yù)，僅同樣捆綁處理。

1.4觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1血糖水平 干預(yù)結(jié)束后，采用3%戊巴比妥鈉(0.1 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，尾靜脈取血用于檢測血糖水平。

1.4.2坐骨神經(jīng)病理形態(tài) 取部分左側(cè)坐骨神經(jīng)組織，固定在4%多聚甲醛溶液中，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制備5 μm切片。將切片放入2個裝有二甲苯的玻璃容器中各10 min，然后放入2個有水或無水乙醇的玻璃容器中各3 min，再放入95%無水乙醇和75%乙醇的玻璃容器中各3 min，用自來水沖洗。切片放入蘇木精染料中約10 min，自來水沖洗，75%鹽酸分化30 s，自來水沖洗至細(xì)胞核變藍(lán);用伊紅染色約5 min，用水輕度漂洗。將切片依次放入3個含75%乙醇、95%乙醇和無水乙醇的玻璃容器中各1 min，再放入2個含二甲苯的玻璃容器中各5 min。干燥后，用中性膠密封。最后在顯微鏡下采集并分析圖像。

1.4.3坐骨神經(jīng)中Bax和Bcl-2 表達(dá)情況

1.4.3.1Western blot法檢測 將保存在-80 ℃冰箱中的大鼠坐骨神經(jīng)組織粉碎，離心，加入RIPA裂解液。冰解后收集上清，離心提取，BCA試劑盒測定蛋白濃度。每孔取20 μg蛋白樣品，聚丙烯酰胺凝膠電泳(濃縮凝膠60 V電壓，120 min；分離膠120 V電壓，120 min)。將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(250 mA電流，60 min)。轉(zhuǎn)膜后，將膜面朝上，切膜后用TBS清洗1次。室溫密封1 h后，TBST清洗5次，每次3 min，加入抗Bax一抗(濃度約為1∶2 000)和抗Bcl-2一抗(濃度約為1∶800)，4 ℃孵育過夜。次日TBST清洗 5次，每次3 min后加入二抗(濃度為1∶500)。細(xì)胞在室溫下孵育1 h。TBST清洗5次，每次3 min。按說明配置ECL發(fā)光溶液，混合均勻后滴在膠片上，成像儀檢測并計算灰度值。

1.4.3.2免疫組化染色法檢測 石蠟切片脫蠟至水后進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻后PBS清洗，旋轉(zhuǎn)干燥后3%的BSA密封，取出BSA溶液。分別加入抗Bax一抗(濃度約為1∶200)和Bcl-2一抗(濃度約為1∶200)覆蓋組織，4 ℃孵育過夜。次日，PBS洗凈，加入相應(yīng)品種50～100 μL二抗，室溫孵育50 min。PBS清洗后，加入50～100 μL新鮮DAB溶液配制DAB溶液，顯微鏡控制顏色。完全顯色后，用流動水沖洗3次，梯度乙醇脫水。最后將薄膜密封，在顯微鏡下觀察并采集圖像。每只大鼠隨機選取3個切片，每個切片觀察3個區(qū)域，計算平均光密度值并取平均值。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量數(shù)據(jù)組間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血糖比較 空白組、模型組和電針組大鼠血糖水平分別為(5.64±0.29)mmol/L、(23.49±3.97)mmol/L、(24.15±4.06)mmol/L，模型組和電針組均明顯高于空白組(P均<0.05)，模型組和電針組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各組大鼠坐骨神經(jīng)組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 空白組大鼠坐骨神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)纖維排列緊密，髓鞘覆蓋；模型組大鼠坐骨神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)異常，大量神經(jīng)纖維水腫，髓鞘結(jié)構(gòu)脫落缺失成空泡狀；電針組大鼠坐骨神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)輕度異常，神經(jīng)纖維排列疏松，個別可見髓鞘缺失脫落。見圖1。

圖1 空白組和糖尿病周圍神經(jīng)病變各組大鼠坐骨神經(jīng)HE染色表現(xiàn)(×400)

2.3各組大鼠坐骨神經(jīng)中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)情況 與空白組比較，模型組大鼠坐骨神經(jīng)中Bax蛋白相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，電針組大鼠坐骨神經(jīng)中Bax蛋白相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 空白組和糖尿病周圍神經(jīng)病變各組大鼠坐骨神經(jīng)中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況

2.4各組大鼠坐骨神經(jīng)中Bax和Bcl-2免疫組化表達(dá)情況 與空白組比較，模型組大鼠坐骨神經(jīng)中Bax平均光密度值明顯升高(P<0.05)，Bcl-2平均光密度值明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，電針組大鼠坐骨神經(jīng)中Bax平均光密度值明顯降低(P<0.05)，Bcl-2平均光密度值明顯升高(P<0.05)。見圖3及圖4。

圖3 空白組和糖尿病周圍神經(jīng)病變各組大鼠坐骨神經(jīng)中Bax免疫組化表達(dá)情況(×400)

圖4 空白組和糖尿病周圍神經(jīng)病變各組大鼠坐骨神經(jīng)中Bcl-2免疫組化表達(dá)情況(×400)

3 討 論

DPN因發(fā)病機制不明，目前治療效果不理想，因此尋找治療DPN的有效方法具有重要意義。糖尿病屬于中醫(yī)“消渴”范疇，DPN屬于“痹證”和“痿證”范疇。糖尿病患者腎陰虧虛已久，陰損及陽，腎之陰陽兩虛，進(jìn)而導(dǎo)致氣血運化失司，水液代謝失調(diào)，氣滯、血瘀、痰邪阻滯經(jīng)絡(luò)而發(fā)病[11]。導(dǎo)師陳躍來教授從《素問·陰陽應(yīng)象大論》“故善用針者，從陰引陽，從陽引陰”理論出發(fā)，結(jié)合經(jīng)穴的特異性，形成了以內(nèi)關(guān)透外關(guān)、陰陵泉透陽陵泉為主的針刺透穴法，在針刺陰經(jīng)穴位的同時，透刺到陽經(jīng)穴位，激發(fā)陰陽兩經(jīng)氣血，使機體經(jīng)脈氣血通暢，達(dá)到“從陰引陽，陰中求陽”的目的，并使針感傳導(dǎo)以達(dá)氣至病所，臨床治療DPN收獲良效[12]。但該療法治療DPN的機制尚不明確，本實驗從細(xì)胞凋亡角度探討了該療法的作用機制。

細(xì)胞凋亡是機體調(diào)控細(xì)胞過度增殖以維持平衡的一種細(xì)胞功能，而DPN的發(fā)病與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[13]。長期的高糖狀態(tài)會導(dǎo)致細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的破壞，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，而氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)[14]。細(xì)胞凋亡可引起DNA氧化損傷和蛋白表達(dá)異常。Bcl-2原癌基因位于細(xì)胞線粒體膜上，其高表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡；促凋亡蛋白Bax主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，介導(dǎo)下游凋亡分子的釋放，可直接抑制Bcl-2蛋白的抗凋亡作用，阻止Bax同源寡聚體的形成，觸發(fā)細(xì)胞凋亡[15]，Bcl-2表達(dá)減少和Bax表達(dá)增加可導(dǎo)致坐骨神經(jīng)髓鞘損傷和痛覺過敏[16]。

本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠血糖水平和坐骨神經(jīng)中Bax蛋白相對表達(dá)量及平均光密度值均明顯升高，坐骨神經(jīng)中Bcl-2蛋白相對表達(dá)量及平均光密度值均明顯降低，坐骨神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)缺失異常,說明抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax相互作用，參與DPN大鼠坐骨神經(jīng)損傷的病理過程；與模型組比較，電針組血糖水平變化不明顯，坐骨神經(jīng)中Bax蛋白相對表達(dá)量及平均光密度值均明顯降低，坐骨神經(jīng)中Bcl-2相對表達(dá)量及平均光密度值均明顯升高，坐骨神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)損傷程度較輕，說明電針可通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)和下調(diào)Bax的表達(dá)，抑制坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡，與高睿琦等[17]研究結(jié)果一致。

綜上，針刺透穴法可修復(fù)DPN大鼠坐骨神經(jīng)損傷，作用機制與上調(diào)Bcl-2的表達(dá)和下調(diào)Bax的表達(dá)，抑制細(xì)胞過度凋亡相關(guān)，一定程度上為臨床針刺透穴法治療DPN提供了指導(dǎo)。但本研究存在以下局限性：未設(shè)陽性藥物對照組，有待比較針刺與藥物治療DPN的療效；神經(jīng)細(xì)胞受損后發(fā)生凋亡的機制涉及眾多途徑，如PI3K/AKT、MAPK、JAK/STAT信號通路等，因此可考慮在下一步實驗中將凋亡相關(guān)蛋白與信號通路相聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)針刺介導(dǎo)坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡的信號通路，更深入探討針刺抗凋亡繼而修復(fù)坐骨神經(jīng)損傷的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。