劉夢瑤，張賀芳，牛明明，申英鴿

(1. 河北中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，河北 石家莊 050013；2. 邯鄲市中西醫(yī)結合醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

2型糖尿病是臨床常見的內分泌疾病，中國成年人中其患病率已達12.8%[1]，自身胰島素分泌不足、胰島素抵抗是該病發(fā)生的重要機制。非酒精性脂肪肝病(NAFLD)以肝臟脂肪蓄積伴胰島素抵抗為特點，其與2型糖尿病存在相同或者相似病因，目前NAFLD尚無針對性療效確切的治療藥物。叉頭轉錄因子O1(FoxO1)是胰島素信號通路磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)的重要組成部分，廣泛存在于肝細胞和脂肪細胞中[2]。肝臟中胰島素與其受體結合，級聯相關胰島素通路激活[3]，肝臟糖脂異常代謝會損傷自身細胞，胰島素受體底物因肝細胞破壞而減少，其募集下游信號分子能力減弱，作為第二信使的PI3K活性減弱，活化Akt能力降低，FoxO1磷酸化作用減弱，FoxO1從細胞核移至細胞質受阻，未能封閉核定位信號[4]，自身轉錄活性增強[5]，繼而促進糖異生關鍵酶啟動子和轉錄因子葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)等表達[6]，G-6-Pase過度表達可使大量葡萄糖-6-磷酸轉化成葡萄糖釋放入血，升高血糖，加重胰島素抵抗，促進糖異生[7]。此外，激活狀態(tài)下FoxO1會增加肝細胞對脂肪酸的攝入，加重肝臟脂質沉積[8]。中醫(yī)認為脾虛瘀滯是NAFLD臨床常見證型，中醫(yī)藥治療2型糖尿病伴NAFLD顯示出較好療效。本實驗旨在通過觀察健脾理氣活血方對2型糖尿病伴NAFLD大鼠肝功能、糖脂代謝及FoxO1通路相關因子蛋白表達的影響，探究該方的作用及可能作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠30只，7周齡，體重(175±25)g，購于河北醫(yī)科大學動物實驗中心，許可證號：SCXK(冀)2013-1-003。飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學免疫教研室動物實驗中心，保持室內通風，溫度穩(wěn)定于20～25 ℃，濕度控制為56%，明暗各12 h交替，自由攝食飲水，墊料適時更換清理。普通飼料適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。實驗研究經河北省中醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核通過(2018-科研-80)。

1.2實驗藥物 健脾理氣活血方，組成：黃芪30 g、黨參15g、茯苓15g、炒白術12g、甘草6g、當歸12 g、川芎12 g、丹參12 g、柴胡12 g、蜈蚣2條、白豆蔻12 g、木香9 g、絞股藍12 g、五味子12 g、葛根9 g。上述藥材來自廣州市一方中藥材有限公司，購于河北省中醫(yī)院中藥房，批號：9020723，顆粒劑型。

1.3試劑及儀器 FoxO1(貨號：18592-1-AP)，G-6-Pase(貨號：bs-21524R)，胰島素受體底物1(IRS1，貨號：AF6273)，beta Actin 抗體(貨號：AF7018)，二抗[Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) HRP，貨號:S0001]；電泳槽(型號：JY-SCZ2+，北京君意)，電泳儀(型號：JY300HE，北京君意)，冷凍高速離心機(型號：Fresco17，德國Trermo Electron LED GmbH)，冷凍研磨機(型號：JXFSTPRP-CL-24，上海凈信)，化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(型號：MiNiChemi 610 Plus，北京賽智)，恒溫金屬浴(型號：HDB-1，北京昊諾斯)，恒溫培養(yǎng)振蕩器(型號：ZWY-200D，上海智城)，雪花制冰機(型號：DTY-ZBJ-85，上海金鵬)，搖床(型號：SK-R1807-E，美國賽洛捷克)。

1.4實驗方法 隨機選取10只大鼠作為正常組，全程以普通飼料喂養(yǎng)；余20只大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，禁食不禁水12 h，予30 mg/kg鏈脲佐菌素腹腔注射，正常組大鼠予同等劑量的0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。以空腹血糖(FPG)≥11.1 mmol/L且大鼠多飲多食多尿為2型糖尿病造模成功[9]。然后造模大鼠繼續(xù)予高糖高脂飼料喂至第8周末，隨機抽取1只造模大鼠處死，以HE染色見肝細胞出現腫脹變形且有廣泛大泡樣脂肪變性為2型糖尿病伴NAFLD造模成功。依隨機數字表法將成模大鼠分為模型組10只和中藥組9只。根據臨床成人用藥量和《中藥藥理研究方法學》[10]，計算大鼠健脾理氣活血方灌胃量為17.1 g/(kg·d)。從第9周開始，中藥組給予健脾理氣活血方灌胃，正常組和模型組給予同等劑量蒸餾水灌胃，均1次/d，連續(xù)灌胃16周。

1.5標本采集 末次灌胃后禁食不禁水12 h，次日測定各組大鼠體重和FPG，予10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉后腹主動脈取血，4 ℃離心機離心，取上清分裝并做好標記，-80 ℃冰箱保存，用于相關生化指標檢測；充分暴露腹腔，剪斷肝門靜脈，取出完整肝臟，剪下1～2 mm厚肝組織制作石蠟標本，用于HE染色，剩余組織立即裝入凍存管，移入提前準備的液氮中，轉至凍存盒再置于-80 ℃冰箱保存，用于油紅O染色和Western blot檢測。

1.6觀察指標與方法

1.6.1大鼠一般行為狀態(tài) 實驗過程中觀察記錄各組大鼠飲食、進水、排便情況及皮毛狀態(tài)、精神狀態(tài)等。

1.6.2肝功能、胰島功能、血脂指標 依據生化試劑盒說明依次檢測谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、FPG、空腹胰島素(FINS)、糖化血紅蛋白(HbAlc)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平，根據公式計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR，HOMA-IR=FPG×FINS/22.5)。

1.6.3肝臟組織中G-6-Pase、FoxO1、IRS1蛋白表達情況 于冰上操作，取相應肝臟組織進行研磨裂解，離心后取上清-20 ℃保存。BCA法測蛋白質濃度，96孔板上樣，酶標儀測定吸光度，波長設置為562 nm，依據標準曲線計算蛋白濃度，稀釋后配平。取干凈玻璃板配8%分離膠和5%濃縮膠，插入梳子。板、膠輕置于電泳槽中，倒入電泳液沒過梳齒，拔出梳子整理上樣槽，上樣Marker及蛋白，1xbuffer補齊。補電泳液，根據正負極連接電泳儀，電壓設置為80 V，約30 min后條帶到達濃縮膠與分離膠交界處，調整電壓為120 V，溴酚藍移動距膠底大約1 cm時停止電泳。切需要部分膠，裁剪PVDF膜，在夾板上按順序放置物品，于轉膜槽中加轉膜液，電流220 mA轉膜90 min。于5%脫脂奶粉中封閉2 h。稀釋一抗孵育過夜,TBST洗3次；稀釋二抗孵育2 h,TBST洗3次。準備好化學發(fā)光檢測的試劑，置PVDF膜于顯影液中反應，放入化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進行顯影、拍照，采用Image J軟件測定目標條帶的灰度值。

1.6.4肝臟組織HE染色觀察 取制備好的蠟塊切片，常規(guī)脫蠟沖洗，蘇木素染核，水洗后乙醇分化，流水沖洗，進行梯度脫水，伊紅染色數秒，再進行各梯度乙醇脫水，用二甲苯使之透明，滴樹膠于透明切片上，蓋片，鏡檢分析。

1.6.5肝臟組織油紅O染色觀察 使用冰凍切片機將冰凍肝組織切成6 μm厚切片，復溫干燥，固定液中固定15 min，自來水洗，晾干。油紅染液浸染8～10 min(加蓋避光)，蒸餾水洗。取75%乙醇稍予進行背景分化，蒸餾水洗。蘇木素染液染3～5 min，自來水洗；分化液進行分化，自來水洗；返藍液返藍，流水沖洗。從60 ℃烤箱中取出甘油明膠，對切片進行封片，顯微鏡下采集圖像分析。

2 結 果

2.1各組大鼠一般行為狀態(tài) 正常組大鼠一般狀態(tài)良好，正常飲食水，二便未見明顯異常，皮毛整潔柔順，爪甲顏色紅潤，活動靈敏。模型組大鼠體重先增加后減輕，伴隨多飲、多食，排泄次數增加且質溏，皮毛黃暗沉墜缺少光澤，精神狀態(tài)不佳，少動易驚，爪甲暗淡溫低，符合脾虛瘀滯的中醫(yī)辨證表現，其中1只大鼠于飼養(yǎng)第18周末死亡，推測原因可能是血糖過高引起臟器損傷。中藥組大鼠體重浮動較模型組小，多飲、多食、多尿、便溏癥狀減輕，皮毛白黃柔順，稍顯粗糙，精神狀態(tài)可。

2.2各組大鼠肝功能指標比較 模型組大鼠血清ALT、AST水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，中藥組大鼠血清ALT、AST水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 正常組和2型糖尿病伴非酒精性脂肪肝病各組大鼠血清肝功能指標比較

2.3各組大鼠胰島功能指標比較 模型組大鼠血清FPG、FINS、HbAlc、HOMA-IR均明顯高于正常組(P均<0.05)，中藥組大鼠血清FPG、FINS、HbAlc、HOMA-IR均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表2。

表2 正常組和2型糖尿病伴非酒精性脂肪肝病各組大鼠血清胰島功能指標比較

2.4各組大鼠血脂指標比較 與正常組比較，模型組大鼠血清TG、TC、LDL-C水平均明顯增高(P均<0.05)，HDL-C水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，中藥組大鼠血清TG、TC、LDL-C水平均明顯降低(P均<0.05),HDL-C水平明顯增高(P<0.05)。見表3。

表3 正常組和2型糖尿病伴非酒精性脂肪肝病各組大鼠血脂指標比較

2.5各組大鼠肝臟組織中G-6-Pase、FoxO1、IRS1蛋白表達情況 與正常組比較，模型組大鼠肝臟組織中G-6-Pase、FoxO1蛋白相對表達量均明顯增高(P均<0.05)，IRS1蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，中藥組大鼠肝臟組織中G-6-Pase、FoxO1蛋白相對表達量均明顯降低(P均<0.05),IRS1蛋白相對表達量明顯增高(P<0.05)。見圖1及表4。

圖1 正常組和2型糖尿病伴非酒精性脂肪肝病各組大鼠肝臟組織中G-6-Pase、FoxO1、IRS1蛋白表達情況

表4 正常組和2型糖尿病伴非酒精性脂肪肝病各組大鼠肝臟組織中G-6-Pase、FoxO1、IRS1蛋白相對表達量比較

2.6各組大鼠肝臟組織HE染色病理學形態(tài) 正常組大鼠肝臟細胞較圓，細胞核居中，細胞環(huán)繞中央靜脈呈放射狀排列，肝索條理清晰，肝小葉構成整齊；模型組大鼠肝臟細胞腫脹、體積增加，細胞核位置偏移、染色變淺或消失，胞漿中存在較多脂肪空泡與炎性浸潤，肝小葉失去原有結構；中藥組大鼠肝臟細胞腫脹較模型組輕，脂肪空泡散在于胞質中，炎性浸潤減少，肝小葉結構趨于正常。見圖2。

圖2 正常組和2型糖尿病伴非酒精性脂肪肝病各組大鼠肝臟組織HE染色病理形態(tài)(×200)

2.7各組大鼠肝臟組織油紅O染色病理學形態(tài)正常組大鼠肝細胞內未見明顯橘紅色脂滴；模型組大鼠肝細胞內可見廣泛分布的紅色脂滴，相近肝細胞內脂滴融合成大泡狀，肝臟脂肪變性明顯；中藥組大鼠肝細胞內紅色脂滴明顯較模型組少。見圖3。

圖3 正常組和2型糖尿病伴非酒精性脂肪肝病各組大鼠肝臟組織油紅O染色病理形態(tài)(×200)

3 討 論

在綜合生活環(huán)境改變的影響下，2型糖尿病合并NAFLD的發(fā)病率明顯增高，且有低齡化趨勢[11]。2型糖尿病合并NAFLD患者存在胰島素抵抗及多種代謝異常，其中NAFLD形成與胰島素抵抗和脂肪代謝異常相關，胰島素抵抗導致游離脂肪酸代謝異常，TG堆積形成單純性脂肪肝，病變部位在肝小葉；后期發(fā)展使更多脂肪聚積于肝臟，肝細胞水腫，肝細胞在一系列氧化應激過程中受到損傷而發(fā)生肝炎[12]，釋放大量ALT、AST入血[13]，導致肝功能異常，肝臟調控糖原合成分解及糖異生障礙，出現血糖升高等現象[14]。另外長時間肝脂肪變性降低自身對胰島素的敏感程度，胰島素分泌增加，導致高胰島素血癥。有實驗證實，敲除FoxO1基因可以降低小鼠發(fā)生糖尿病及脂肪肝的概率[15]。本實驗結果顯示，模型組大鼠血清ALT、AST、FPG、FINS、HbAlc、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C水平及肝臟組織中G-6-Pase、FoxO1蛋白相對表達量均明顯升高，血清HDL-C水平及肝臟組織中IRS1蛋白相對表達量均明顯降低；HE染色示肝細胞胞漿中有較多脂肪空泡，存在炎性浸潤；油紅O染色見肝細胞中存在大量紅色脂滴。說明2型糖尿病伴NAFLD大鼠存在糖脂代謝異常、胰島素抵抗及FoxO1通路相關因子表達異常。

中醫(yī)學認為糖尿病和NAFLD的病位在脾、在肝，脾陽虛不能運化水濕，生痰濁入絡而致瘀滯，阻遏氣機運行停滯于肝。健脾理氣活血方為多年臨床總結經驗方，組方以黨參、茯苓、白術為君藥，可益氣、健脾燥濕，鼓動中焦之氣機。臣藥黃芪補氣升陽，生津而又養(yǎng)血，行滯通痹以活經絡；當歸、川芎、丹參行氣通經，補血活血，通氣絡而不奪給養(yǎng)，消瘀滯又不傷肝脾；甘草補益脾胃，調和藥性。佐藥蜈蚣通經活絡，通達四肢經絡，可作載舟疏通全身經脈，予它藥通路；柴胡升陽舉氣，疏肝膽之經脈，助脾行運化；白豆蔻、木香辛溫發(fā)散，行氣化濕，溫中焦，調脾胃；絞股藍養(yǎng)陰補虛，益氣健脾；五味子可益氣生津。使藥葛根辛涼，可緩中焦瘀積之內火，生津升陽而通經絡。全方相輔相成，不離脾虛瘀滯之病機。現代藥理學研究表明，羧甲基茯苓多糖可改善肝損傷小鼠代謝障礙，促進肝細胞再生[16]；當歸注射液能顯著降低非酒精性脂肪肝大鼠血清ALT、AST水平，抑制肝臟脂肪沉積，可保肝抗炎[17]；丹參可以加速肝臟細胞修復[18]；黃芪多糖可減輕肝臟缺血再灌注損傷[19]，且有胰島素增敏作用[20]；黨參提取物可降脂控糖，減輕胰島素抵抗，延緩糖尿病進展[21-23]；白術糖復合物可以減少糖尿病大鼠飲水和耗食量，并在一定程度上抑制胰腺萎縮[24]；五味子多糖可改善大鼠胰島素抵抗[25]；葛根可降低血糖血脂，促進胰島素分泌，改善胰島素抵抗[26]。本實驗結果顯示，與模型組比較，中藥組大鼠血清ALT、AST、 FPG、FINS、HbAlc、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C水平及肝臟組織中G-6-Pase、FoxO1蛋白相對表達量均明顯降低，血清HDL-C水平及肝臟組織中IRS1蛋白相對表達量均明顯升高，且大鼠肝臟細胞腫脹減輕，脂肪空泡、炎性浸潤、胞漿內脂滴均明顯減少。提示健脾理氣活血方可改善2型糖尿病伴NAFLD大鼠糖脂代謝及胰島素抵抗，調節(jié)FoxO1通路相關因子表達，促進損傷肝細胞修復。

綜上所述，健脾理氣活血方能夠改善2型糖尿病伴NAFLD大鼠糖脂代謝，減輕脂肪肝病變，分析與該方可調控FoxO1相關通路、減輕胰島素抵抗有關。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。