劉 攀，姜 徽，巨 星，王 丹，田月珍，付雪峰，李媛媛，茍穆榮，王 震，樊 琛，布佐拉姑麗?庫爾班，黃錫霞*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院，新疆烏魯木齊 830000）

新疆褐牛是我國經(jīng)長期選育而成的耐粗飼、耐寒、放牧性能優(yōu)良的乳肉兼用品種牛，是新疆地區(qū)特有的品種資源。同時具有乳成分中乳脂率高、乳蛋白率高、乳房炎抗性性狀中體細胞數(shù)低等優(yōu)良特性，深受新疆本地農(nóng)牧民青睞，在北疆廣大牧區(qū)中得到廣泛推廣。乳房炎是危害奶牛業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一，發(fā)病率極高，對奶牛業(yè)造成的經(jīng)濟損失也最大，一直困擾著奶牛業(yè)發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計，國外奶牛乳房炎的發(fā)病率一般為25%～60%，國內(nèi)發(fā)病率達20%～70%，個別牛群發(fā)病率更高。因此牛乳房炎的防治問題亟待解決。在乳品安全備受關(guān)注的今天，通過遺傳育種技術(shù)選育乳房炎抗性強的個體來降低乳房炎的發(fā)生以減少抗生素等藥物的應(yīng)用尤為重要。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子5（Signal Transducer and Activator of Transcription，STAT5）包括5A和5B 2種亞型，和基因主要是由其基因調(diào)控元件決定轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的差異，基因最初是在綿羊的乳腺中作為催乳素誘導(dǎo)劑被分離得到，后來在小鼠、大鼠和人的乳腺、脂肪、肝臟、卵巢等組織器官中都可以檢測到基因，并且參與催乳素和生長激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在組織細胞和生物體的生長、發(fā)育、繁殖等過程中起著非常重要的作用，對家畜生長、生產(chǎn)影響很大。

李勝等人在研究中首次分離到全長的（2 502 bp）和（2 515 bp）基因編碼序列，在水牛乳腺中發(fā)現(xiàn)和基因表達量最高，在水牛腦中發(fā)現(xiàn)基因表達量最高，其試驗結(jié)果表明和基因主要表達于水牛乳腺上皮細胞；敲除基因?qū)е氯橄偕掀ぜ毎˙uMECs）的功能受到抑制，乳蛋白基因的表達也顯著降低，而基因的過量表達則導(dǎo)致乳蛋白基因的表達顯著升高。He等利用PCR-SSCP技術(shù)發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性與荷斯坦奶牛體細胞評分和產(chǎn)奶性能有顯著關(guān)聯(lián)。

本實驗在前期課題組研究的基礎(chǔ)上運用RTqPCR技術(shù)對基因在患乳房炎和健康的新疆褐牛血液中的mRNA表達量進行研究，并且采用生物信息學(xué)分析法對基因進行分析；通過NCBI獲得牛和不同物種的基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，利用多種在線分析軟件對基因編碼的蛋白進行結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測，并對STAT5B蛋白的亞細胞定位、信號肽的預(yù)測和跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)進行分析，旨在為后續(xù)研究新疆褐?；虻墓δ艿於ɡ碚摶A(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 實驗動物來自烏魯木齊新疆褐牛繁育中心統(tǒng)一飼養(yǎng)條件下的2～3胎次新疆褐牛（6頭），進行尾根靜脈采血用于RNA提取。根據(jù)國際奶業(yè)聯(lián)合會（IDF）制定的牛奶中體細胞數(shù)推薦分級標(biāo)準(zhǔn)，將6頭新疆褐牛按照不同體細胞數(shù)分成2組：I組健康組（n=3，SCC<50萬個/mL），II組乳房炎組（n=3，SCC>100萬個/mL）。

1.1.2 主要試劑和儀器 主要試劑包括血液RNA保存管（BioTeke公司）、血液總RNA提取試劑盒（BioTeke公司）、5×All-In-One RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ABM公司）、EvaGreen Express2×qPCR MasterMix-Low Rox熒光定量試劑盒（ABM公司）、無水乙醇、氯仿、異丙醇、瓊脂糖。主要儀器包括超微量分光光度計（P100+，Pultton公司）和實時熒光定量PCR儀（LightCycler 9600，羅氏公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI收錄的牛與基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計定量引物，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列信息見表1。

表1 引物信息

1.2.2 血液總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 按照BioTeke血液總RNA提取試劑盒步驟進行RNA提取。先對RNA進行濃度檢測，純度在1.8～1.9之間，之后進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄步驟根據(jù)ABM說明書進行，實驗步驟均在冰上操作，去除基因組DNA反應(yīng)體系10.0 μL：RNA 6.0 μL，4×AccuRT Reaction Mix 4.0 μL，將反應(yīng)液放置于PCR擴增儀中，溫度42℃，時間2 min。

反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系20.0 μL：步驟一反應(yīng)液8.0 μL，5×AccuRT Reaction Stopper 2.0 μL，5×All-In-One RT Master Mix 4.0 μL，RNase Free ddHO 6.0 μL，將上述 反應(yīng)混合液放置于PCR擴增儀中，反應(yīng)程序：25℃ 10 min，42℃ 50 min，85℃ 5 min，待反應(yīng)結(jié)束后，置于冰上降溫，將獲取的cDNA迅速保存于-20℃冰箱中，用于后續(xù)熒光定量實驗。

1.2.3 PCR反應(yīng) 以健康新疆褐牛和患乳房炎新疆褐牛血液反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，按照實時熒光定量PCR試劑盒（ABM）進行擴增反應(yīng)。實時熒光定量PCR的擴增體系20.0 μL：cDNA 1.0 μL，TB Green Premix Ex Taq II（2×）10.0 μL，上、下游引物（濃度均為10 μmol/L）各1.0 μL，RNase Free ddHO 7.0 μL。擴增程序：95℃ 3 min；95℃ 5 s，60℃ 3 min，95℃ 1 min，40個循環(huán)；4℃保存。擴增結(jié)束后分析熔解曲線。

1.3 統(tǒng)計與分析 本實驗采用2方法計算基因在不同乳房健康程度新疆褐牛中的相對表達量，以基因為參照基因，而后利用SPSS19.0軟件中的獨立樣本T檢驗法分析，比較2組不同乳房健康程度新疆褐牛目的基因表達量差異分析。

1.4 生物信息學(xué)分析

1.4.1 不同物種基因序列的獲取 利用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫獲得牛（）、山羊（）、野豬（）、單峰駱駝（）、非洲野驢（）、普氏野馬（）、彎角大羚羊（）、水牛）、家貓（）的基因序列，登錄號分別為（NM_174617.4、XM_018065117.1、XM_021066239.1、XM_031468752.1、XM_014833666.1、XM_023652509.1、XM_040245263.1、XM_025280122.1、XM_023244609.1）。

1.4.2 生物信息學(xué)分析軟件 利用線上軟件Expasy的ProtParam tool模塊（https://web.expasy.org/protparam/）對蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和一級結(jié)構(gòu)進行分析。利用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）對蛋白質(zhì)的親水性與疏水性進行預(yù)測?；蚓幋a蛋白的二級結(jié)構(gòu)使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）在線軟件對其進行預(yù)測；運用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）在線軟件對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。運用MEGA 7.0軟件構(gòu)建牛、山羊、野豬、單峰駱駝、非洲野驢、普氏野馬、彎角大羚羊、水牛、家貓共9個物種的基因同源序列的系統(tǒng)進化樹。采用TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析工具進行蛋白質(zhì)跨膜域分析，用SignalP-5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析工具進行蛋白信號肽的預(yù)測，用WoLF PSORT（https://psort.hgc.jp/）分析工具進行蛋白亞細胞定位。

1.4.3基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和一級結(jié)構(gòu)預(yù)測蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指的是蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列序列，蛋白質(zhì)的氨基酸序列測定對理解其結(jié)構(gòu)與功能以及生物進化遺傳變異的關(guān)系具有重要意義。利用線上軟件Expasy的ProtParam tool模塊對蛋白質(zhì)進行物理性質(zhì)及一級結(jié)構(gòu)的分析，運用該軟件ProtScale模塊預(yù)測STAT5B編碼蛋白的親水性與疏水性。

1.4.4基因蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是指周期性地出現(xiàn)在蛋白質(zhì)肽鏈上的連續(xù)氨基酸片段，主要指-螺旋和-轉(zhuǎn)角?；蚓幋a蛋白的二級結(jié)構(gòu)使用SOPMA在線軟件對其進行預(yù)測；運用SWISS-MODEL在線軟件對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。

1.4.5基因系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建 系統(tǒng)進化樹是描述生物有機體形成或進化順序的拓撲結(jié)構(gòu)，以及被認為具有共同祖先的各物種相互進化關(guān)系的樹形。因此構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對各物種親緣關(guān)系的對比具有更直觀的體現(xiàn)。通過在NCBI網(wǎng)站上下載?；虻暮怂嵝蛄校⑹褂么司W(wǎng)站上的BLAST進行牛與其同源動物基因序列相似性比對分析，最終選擇下載牛、山羊、野豬、單峰駱駝、非洲野驢、普氏野馬、彎角大羚羊、水牛、家貓共9個物種該基因同源序列，再將序列導(dǎo)入MEGA 7.0軟件以構(gòu)建基因的系統(tǒng)進化樹，從而獲得各物種之間的親緣關(guān)系。

1.4.6基因編碼蛋白的亞細胞定位、信號肽的預(yù)測和跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)分析 蛋白質(zhì)功能與亞細胞定位具有密切聯(lián)系，蛋白質(zhì)只有在特定的亞細胞中才可以發(fā)揮正常功能，蛋白質(zhì)亞細胞定位信息可以為蛋白質(zhì)功能預(yù)測提供有用的線索。信號肽在外源蛋白質(zhì)的表達中具有重要作用，信號肽的提出為下一步研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能奠定了一定的基礎(chǔ)。通過分析工具TMHMM Server v.2.0、SignalP-5.0 Server、WoLF PSORT對STAT5B蛋白進行分析，可以檢測出STAT5B蛋白是否含有跨膜區(qū)；進行信號肽的預(yù)測，該蛋白是否存在信號肽，是否能引導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜運輸；進行亞細胞定位，預(yù)測STAT5B蛋白表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的具體存在部位。

2 結(jié)果

2.1 熔解曲線及擴增曲線的分析 采用實時熒光定量PCR對基因在不同乳房健康程度的新疆褐牛血液中的表達量進行分析，結(jié)果顯示，目的基因和內(nèi)參基因的擴增曲線都呈現(xiàn)出S型熒光定量動力學(xué)曲線，擴增曲線集中且流暢，重復(fù)性高，Ct值間隔均勻，擴增指數(shù)基本一致。

基因與內(nèi)參基因的熔解曲線清晰流暢且曲線集中，各基因的熔解峰有且只有一個，表明未出現(xiàn)引物二聚體，熔解溫度相對較高且基本一致，結(jié)果真實可靠。擴增曲線圖、熔解曲線與熔解峰圖見圖1A、圖1B、圖1C和圖2A、圖2B、圖2C。

圖1 A STAT5B擴增曲線

圖1 B STAT5B熔解曲線

圖1 C STAT5B溶解峰

圖2 A GAPDH擴增曲線

圖2 B GAPDH熔解曲線

圖2 C GAPDH溶解峰

2.2 新疆褐牛乳房炎抗性相關(guān)基因的相對表達量結(jié)果分析 根據(jù)牛奶中體細胞數(shù)推薦分級標(biāo)準(zhǔn)，將6頭新疆褐牛按照不同體細胞數(shù)分成健康組和患乳房炎組（各3頭）。通過SPSS19.0分析后，表明基因在檢測的2組新疆褐牛的血液中均有表達，基因?qū)δ膛Ｈ榉垦子绊懖伙@著。但基因在健康新疆褐牛血液中的表達量高于患乳房炎的新疆褐牛（圖3），表明基因可能對新疆褐牛乳房炎抗性有一定的作用。

圖3 STAT5B基因在健康和患乳房炎牛中的相對表達量分析圖

2.3基因編碼蛋白的理化性質(zhì)和氨基酸組成通過ExPASy網(wǎng)站分別分析基因編碼蛋白的理化性質(zhì)及一級結(jié)構(gòu)結(jié)果（表2）、氨基酸組成結(jié)果（圖4）?；蚓幋a蛋白的分子式CHNOS，總共12 602個原子，分子量為89 943.02，由787個氨基酸共同編碼，其中95個為帶負電荷氨基酸（Asp+Glu），79個為帶正電荷氨基酸（Arg+Lys），不穩(wěn)定參數(shù)高達51.52，結(jié)果表明該蛋白為較不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為86，總平均親水性為-0.472，氨基酸組成分析表明：含量最高的是亮氨酸（10.5%），其次是谷氨酰胺（9.7%），含量最低的是半胱氨酸（1.1%）。

表2 STAT5B基因編碼蛋白的理化性質(zhì)

圖4 STAT5B基因編碼蛋白的氨基酸組分

2.4基因編碼蛋白二、三級結(jié)構(gòu)分析 利用在線軟件對基因編碼蛋白進行蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果見圖5。該蛋白質(zhì)中-螺旋高達50.95%，無規(guī)則卷曲占比34.69%，延伸鏈占比11.69%，-折疊的含量僅占2.67%。結(jié)果顯示-螺旋及無規(guī)則卷曲是整體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的主要組成結(jié)構(gòu)元件，最后利用SWISS-MOLD在線工具對基因編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)進行建模預(yù)測（圖6）。

圖5 STAT5B基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)

圖6 STAT5B基因編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)

2.5基因編碼蛋白疏水性/親水性分析 由圖7可知，小于0的數(shù)值（位于第二象限）稍多于大于0的數(shù)值（位于第一象限），且該蛋白的最高值2.944，在第466個氨基酸處，此處疏水性最強；最低值-3.100，在第388個氨基酸處，此處親水性最強。綜上可得，STAT5B蛋白是一種親水性蛋白。

圖7 STAT5B基因編碼蛋白的親水性/疏水性預(yù)測

2.6基因編碼蛋白的同源性分析 通過使用在線軟件BLAST進行?；虻暮怂嵝蛄斜葘?，搜索與其同源性較高的物種，進行同源性分析和比較。下載該基因同源物的核酸序列后再用MEGA7.0軟件構(gòu)建基因的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示：?；蚺c水牛（）親緣關(guān)系最近，同源性為98.80%，其次與彎角大羚羊（）親緣關(guān)系較近，同源性為97.80%。在哺乳動物中家貓（）跟牛基因親緣關(guān)系較遠，同源性為92.72%（圖8）。

圖8 9個物種的STAT5B基因編碼產(chǎn)物的系統(tǒng)進化樹

2.7 STAT5B蛋白的亞細胞定位、信號肽的預(yù)測和跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)分析

2.7.1 STAT5B蛋白亞細胞定位 通過對STAT5B蛋白進行亞細胞定位，得到結(jié)果顯示：蛋白主要位于細胞質(zhì)，可能性為52.2%，其次小部分存于細胞核和線粒體，其可能性分別為26.1%和13.0%，位于細胞骨架和細胞膜的STAT5B蛋白含量可能性相等，均為4.3%。因此，推測該蛋白主要在細胞質(zhì)中發(fā)揮其性能。

2.7.2 STAT5B蛋白信號肽的預(yù)測 對STAT5B蛋白進行信號肽預(yù)測，結(jié)果顯示：基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸殘基信號肽最大分值為0.001，表明該蛋白不是分泌蛋白，從而不能進行跨膜轉(zhuǎn)移或定位。

2.7.3 STAT5B蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)分析 對STAT5B蛋白進行跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)分析，結(jié)果表明：基因編碼蛋白沒有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)（圖9），表明STAT5B蛋白不存在信號肽序列，可以高效表達。

圖9 STAT5B基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析

3 討 論

3.1 不同乳房健康程度新疆褐牛基因的表達量分析 目前，基因與新疆褐牛乳房炎和泌乳性狀關(guān)系的研究較少，通過查閱資料發(fā)現(xiàn)，基因參與調(diào)節(jié)GH引起的脂肪分解，活化的二聚體能夠在細胞核內(nèi)調(diào)節(jié)一系列與脂代謝相關(guān)的基因表達，而在和敲除的小鼠體內(nèi)，GH引起的脂解作用消失。Urioste等研究發(fā)現(xiàn)，奶牛測定日SCC的標(biāo)準(zhǔn)偏差與臨床乳腺炎密切相關(guān)。Tahir等通過候選基因法在基因檢測到2個SNPs，其中基因的SNP1的野生型AA基因型與低水平的SCC、SCS和IL4顯著相關(guān)；SNP2與血清細胞因子和奶牛乳房炎顯著相關(guān)。何陽花等研究發(fā)現(xiàn)荷斯坦奶?；虻腟NP可能對乳蛋白量、對乳脂率、產(chǎn)奶量和SCS有顯著影響。本研究通過RT-qPCR分析基因在不同乳房健康程度的新疆褐牛中的表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因?qū)δ膛Ｈ榉垦子绊懖伙@著，但基因在健康新疆褐牛血液中的表達量高于患乳房炎的新疆褐牛，推測該基因的存在可能起著抑制新疆褐牛乳房炎發(fā)生的作用。對于新疆褐?；蚴欠駞⑴c新疆褐牛乳房炎炎癥抗性的生物學(xué)過程，還需要進一步研究。

3.2基因生物信息學(xué)分析 蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體的重要組成之一，是生物體發(fā)揮正常功能的基礎(chǔ)，通過了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，可以理解生命中許多本質(zhì)問題。具有廣泛的生物學(xué)作用，主要參與催乳素和生長激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與免疫炎癥反應(yīng)，參與調(diào)控組織細胞的增殖、分化和凋亡。姜徽等研究發(fā)現(xiàn)，基因可能通過調(diào)節(jié)IL-2的合成來間接影響牛乳房炎。通過對基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行分析，能夠確認功能單位或者結(jié)構(gòu)域，從而指導(dǎo)設(shè)計進行功能確認的生物學(xué)實驗，為遺傳操作提供目標(biāo)，為新疆褐牛乳房炎抗性的機制研究提供可靠依據(jù)。

本實驗通過對下載的基因序列進行生物信息學(xué)分析，推測STAT5B蛋白可能對新疆褐牛乳房炎抗性具有調(diào)控功能。生物信息學(xué)分析表明：STAT5B編碼787個氨基酸，脂肪系數(shù)為86，總平均親水性為-0.472（<0），不穩(wěn)定參數(shù)高達51.52，推測STAT5B蛋白是一種親水性蛋白，其半衰期較短，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，是在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進一步盤繞、折疊形成的。-螺旋及無規(guī)則卷曲占STAT5B蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的絕大部分，成功的預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)有助于正確建立序列對比關(guān)系?；虻腄NA序列系統(tǒng)進化樹顯示?；蚺c水牛的親緣關(guān)系最為接近，其次與彎角大羚羊的親緣關(guān)系較為接近，說明該基因在不同物種上可能存在著一定的差異。對基因編碼蛋白的亞細胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，蛋白主要分布在細胞的細胞質(zhì)內(nèi)，研究表明，STAT5B蛋白是胞質(zhì)蛋白質(zhì)的可能性較大。進行信號肽和跨膜區(qū)分析發(fā)現(xiàn)，此蛋白的N端均無信號肽，因此推測這些蛋白為非分泌蛋白質(zhì)，沒有明顯跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)，從而不能進行跨膜轉(zhuǎn)移或定位。對STAT5B編碼蛋白進行生物信息學(xué)分析，為進一步了解和分析STAT5B的結(jié)構(gòu)與功能提供了理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本實驗通過生物信息學(xué)分析的方法對?；蚓幋a的蛋白進行分析及功能預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因編碼蛋白的分子式為CHNOS，總共12 602個原子，分子量為89 943.02，由787個氨基酸共同編碼，屬不穩(wěn)定的親水性蛋白；基因的DNA序列系統(tǒng)進化樹顯示?；蚺c水牛的親緣關(guān)系較為接近，與家貓關(guān)系較遠。RT-qPCR結(jié)果表明，基因?qū)δ膛Ｈ榉垦子绊懖伙@著。本研究結(jié)果為后期進一步研究和驗證基因的結(jié)構(gòu)和功能提供了一定的理論參考。