涂麗英，張李琛，張進萍，鄒云蓮,#

1昆明理工大學醫(yī)學院，昆明 650500

2云南省第一人民醫(yī)院/昆明理工大學附屬醫(yī)院血液疾病臨床醫(yī)學中心，昆明 650032

惡性腫瘤因其高發(fā)病率和病死率已成為世界三大疾病之一。腫瘤免疫療法是應(yīng)用免疫學的方法，結(jié)合多種技術(shù)抑制腫瘤生長的新療法[1]，因其顯著的抗腫瘤效應(yīng)，被列為十大科學突破之首[2]。細胞因子是不同類型細胞之間交流的主要調(diào)節(jié)因子，由體內(nèi)多種免疫細胞如單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等合成、分泌。它們通過協(xié)調(diào)各種促炎和抗炎細胞群之間的平衡，參與免疫細胞的增殖、分化和成熟[3]。近些年來細胞因子已經(jīng)成為腫瘤免疫治療的熱點之一。白細胞介素-12（interleukin-12，IL-12）是IL-12家族中第一個被發(fā)現(xiàn)的細胞因子，由于顯著的抗腫瘤潛能，已成為近年來腫瘤免疫治療中研究最為廣泛的細胞因子之一。本文從抗腫瘤作用機制及臨床轉(zhuǎn)化研究兩方面對IL-12的研究進展進行綜述，旨為梳理IL-12的前沿研究方向。

1 IL-12的生物結(jié)構(gòu)與功能

IL-12是由p40和p35兩個亞基構(gòu)成的異二聚體，主要由抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）產(chǎn)生。IL-12具有種屬特異性，而其種屬特異性取決于p35的種類。當p35是鼠源，則無論對鼠還是對人的淋巴細胞，均有增殖作用，但當p35是人源時，只對人淋巴細胞有效應(yīng)，而p40的種屬并不起決定作用。在功能方面，p40刺激CD4+T細胞促進γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和IL-17的合成和分泌[4]，上調(diào)腫瘤相關(guān)巨噬細胞的抗腫瘤作用[5]。而p35可以抑制淋巴細胞增殖，誘導(dǎo)IL-10和IL-35表達的B細胞擴增[6]。IL-12常被認為是炎性細胞因子參與機體免疫反應(yīng)，但是Balasubbramanian等[7]的研究表明IL-12并不是一直為促炎狀態(tài)，其促炎性或是抗炎性取決于血壓。在抗腫瘤研究中，IL-12不僅通過激活被動免疫和天然免疫抑制腫瘤生長，還可通過抑制腫瘤新生血管生成、促進細胞凋亡等方式抑制腫瘤進展。在臨床研究中，IL-12常通過單獨應(yīng)用或與多種治療方式（包括抗體、抗血管生成劑、放療、過繼治療和抗腫瘤疫苗）聯(lián)合應(yīng)用的方式提高療效，并在動物模型中取得了可觀的治療效果，是近年來腫瘤免疫療法的研究熱點[8]。IL-12本身及其組合的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性機制仍在探索之中。

2 IL-12的抗腫瘤作用機制及其臨床前研究進展

2.1 間接促進相關(guān)免疫細胞激活及增殖

細胞毒性T細胞（cytotoxic T cell，CTL）活化是機體抗腫瘤免疫反應(yīng)的首要步驟。CTL細胞間通訊依賴于細胞小泡，尤其是外泌體。Li等[9]研究表明，使用IL-12刺激CTL可以影響外泌體的大小，并導(dǎo)致某些外泌體蛋白的選擇性富集，外泌體會使初始CD8+T細胞在不存在抗原的情況下產(chǎn)生IFN-γ和顆粒酶B，并且增強弱抗原刺激對CTL的影響。

自然殺傷（natural killer，NK）細胞是人體重要的天然免疫細胞，它們主要參與識別和破壞被病原體（病毒、細菌和寄生蟲）感染的細胞或腫瘤細胞[10-13]。殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR）組成主要組織相容性復(fù)合體-Ⅰ（major histocompatibility complex-Ⅰ，MHC-Ⅰ）結(jié)合受體家族，對調(diào)節(jié)人NK細胞和部分T細胞的活化閾值起重要作用。Ewen等[14]的研究表明，用IL-12刺激NK細胞會使外周血NK細胞表面殺傷細胞免疫球蛋白樣受體，兩個Ig結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)長尾2（killer cell immunoglobulin like receptor,two Ig domains and long cytoplasmic tail 2，KIR2DL2）、KIR2DL3、KIR2DL1以及 KIR3DL1表達下調(diào)，從而降低了抗體介導(dǎo)的KIR參與的抑制作用，并增加了CD16的依賴性毒性，KIR2DL2/KIR2DL3表達下調(diào)的NK細胞對表達同源人白細胞抗原 1（human leukocyte antigen 1，HLA1）分子的腫瘤細胞毒性增強。IL-12主要通過誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ促進先天性和獲得性細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。IL-12可增強T細胞和NK細胞的細胞毒性，并誘導(dǎo)NK細胞產(chǎn)生IFN-γ，促使吞噬功能增強和局部炎癥，并且驅(qū)動輔助性T細胞1（helper T cell 1，Th1）型反應(yīng)和阻礙Th2的分化[15-16]。

效應(yīng)記憶T細胞（effector memory T cell，Tem）在感染早期可以快速產(chǎn)生針對特定抗原的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，CD8+T細胞可以通過雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）途徑分化為Tem，而MTOR途徑與轉(zhuǎn)錄因子T-bet和脫中胚蛋白（eomesodermin，EOMES）的表達有關(guān)。Wang等[17]的研究證實，利用IL-12可以增強MTOR途徑的活性，進而影響T-bet與EOMES轉(zhuǎn)錄因子的表達，從而促進CD8+Tem細胞的分化以及IFN-γ表達增加，增強了其抗腫瘤作用。

2.2 直接激活免疫細胞促進抗腫瘤作用

樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是最強有力的APC，能攝取、加工及呈遞抗原，啟動T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。彭維[18]的研究證實，IL-12可以使免疫耐受的DC細胞產(chǎn)生抗腫瘤作用，提高DC細胞刺激淋巴細胞增殖以及殺傷腫瘤的能力，但是具體的作用機制尚不明確，可能與促進核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的活化從而上調(diào)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子4（signal transduction and activator of transcription 4，STAT4）的表達有關(guān)。

單核細胞是腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞和DC的主要來源。在腫瘤進展過程中，它們通過分化為免疫調(diào)節(jié)細胞參與腫瘤免疫逃逸。單核細胞可以連接先天性和獲得性免疫反應(yīng)，并可以通過誘導(dǎo)免疫耐受、血管生成和增加腫瘤細胞擴散等各種機制影響腫瘤微環(huán)境。馬婷婷等[19]的研究表明，用過表達人IL-12腺病毒載體感染THP-1細胞時可促進單核細胞向巨噬細胞分化，這為臨床治療單核細胞白血病提供了新的方向。巨噬細胞可分化成兩種常見表型，即M1型和M2型。M2極化的巨噬細胞主要通過誘導(dǎo)精氨酸酶1和IL-10相關(guān)網(wǎng)絡(luò)參與組織重塑、修復(fù)和血管生成過程；在泛癌分析中，腫瘤微環(huán)境中M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞的出現(xiàn)通常與不良預(yù)后相關(guān)[20]。M1極化的巨噬細胞因表達高水平的炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、一氧化氮和活性氧，被歸類為抗腫瘤效應(yīng)細胞，它們能夠直接殺死腫瘤細胞并刺激抗腫瘤T細胞反應(yīng)[21]。吳碧濤[22]通過攜載人IL-12的腺病毒證實，過表達IL-12可促使M2型巨噬細胞向M1型轉(zhuǎn)化。此外，IL-12還通過上調(diào)腫瘤細胞上的MHC-Ⅰ來促進抗原呈遞，有利于M1型巨噬細胞的極化，并通過增強CXC趨化因子配體9（C-X-C chemokine ligand 9，CXCL9）、CXCL10和CXCL11的產(chǎn)生來吸引效應(yīng)免疫細胞[23-26]。

基因修飾T細胞的能力是許多免疫治療研究的重要組成部分，但是現(xiàn)階段的方法都受轉(zhuǎn)染效率的限制。Andrijauskaite等[27]發(fā)現(xiàn)，在T細胞培養(yǎng)基中加入IL-12進行7天的預(yù)培養(yǎng)后進行T細胞轉(zhuǎn)染實驗時，與對照組相比表現(xiàn)出更強的轉(zhuǎn)染效率，這種效率增強可能與IL-12調(diào)節(jié)B細胞淋巴瘤/白血病-3（B cell lymphoma/leukemia-3，Bcl-3）的mRNA表達有關(guān)，這為提高轉(zhuǎn)染效率提供了新的思路。

2.3 利用新載體攜載IL-12發(fā)揮抗腫瘤作用

在應(yīng)用IL-12治療惡性腫瘤的傳統(tǒng)治療方案中，大劑量IL-12直接輸注造成的極大機體不良反應(yīng)嚴重限制其在臨床的應(yīng)用轉(zhuǎn)化。近年來基因工程載體的迅速發(fā)展使得IL-12能借助病毒、質(zhì)粒、細胞等多種載體將其定點導(dǎo)入腫瘤局部后釋放，從而減少不良反應(yīng)，已成為IL-12臨床應(yīng)用研究的新方向。

嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）是現(xiàn)階段最常用的新型治療方法之一，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到具有“開關(guān)”模塊并可以攜載相應(yīng)因子的第五代，只有當T細胞激活時才會分泌相關(guān)因子。第五代CAR-T的出現(xiàn)降低了IL-12的全身毒性，并且IL-12又可以促進CAR-T細胞增殖。Kueberuwa等[28]的研究表明，分泌IL-12的CAR-T療法能夠根除免疫健全小鼠中已建立的B細胞淋巴瘤，其長期存活率為25%，并且表達IL-12的CAR-T細胞不僅直接殺死CD19+細胞，而且還將宿主免疫細胞募集到抗腫瘤免疫應(yīng)答中，這為第五代CAR-T的臨床轉(zhuǎn)化研究提供了有利的實驗依據(jù)。雖然以CAR-T細胞作為載體攜載IL-12在動物實驗中取得了較好的實驗結(jié)果，但由于臨床應(yīng)用較少，不良反應(yīng)尚不明確。

RheoSwitch?系統(tǒng)（RheoSwitch? system，RTS）是一種新型基因表達控制開關(guān)，由多個相互依賴的功能組件組成。該RTS“基因開關(guān)”的功能可以由小分子配體Veledimex來控制轉(zhuǎn)基因表達啟動子，Veledimex是一種專有的基因療法啟動子系統(tǒng)的口服激活劑配體，是細胞色素P450家族3亞家族A成員4/5（cytochrome P450 family 3 subfamily A member 4/5，CYP3A4/5）的中度抑制劑和底物。在沒有Veledimex的情況下，RTS誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達“關(guān)閉”，而通過施用Veledimex，轉(zhuǎn)基因表達被“打開”。Barrett等[29]將RTS系統(tǒng)與IL-12聯(lián)合應(yīng)用以克服神經(jīng)膠質(zhì)瘤的先天免疫抑制，從而通過增加腫瘤細胞毒性T細胞和減少調(diào)節(jié)性T細胞（regulating T cell，Treg）來達到平衡，從而在原位神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中延長生存期并且沒有明顯的不良反應(yīng)。在第85天（研究終止時），超過95%的Ad-RTSIL-12+Veledimex處理的動物依舊保持了無瘤狀態(tài)，這也為RTS系統(tǒng)與IL-12在臨床中的聯(lián)合應(yīng)用提供了有力證據(jù)。

Ku?ach 等[30]用間充質(zhì)基質(zhì)細胞（mesenchymal stromal cell，MSC）作為IL-12的載體來治療患有原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的小鼠，在給藥MSC/IL-12后，小鼠的腫瘤生長受到抑制，轉(zhuǎn)移數(shù)量顯著減少。MSC/IL-12可降低治療組小鼠腫瘤血管密度，增加抗腫瘤M1型巨噬細胞和CD8+細胞毒T細胞的數(shù)量。MSC是一種有效、安全的IL-12細胞因子載體。Kim等[31]研究表明，在小鼠模型中，共表達IL-12和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GMCSF）的溶瘤病毒HSV-1可以引發(fā)針對侵襲性和高免疫原性黑色素瘤的抗腫瘤免疫反應(yīng)，并且與表達單個細胞因子的Δ6/GM或Δ6/IL-12治療相比，Δ6/GM/IL-12治療可抑制腫瘤生長并延長生存期。因此，來自工程溶瘤單純皰疹病毒的IL-12和GM-CSF具有協(xié)同作用，可促進免疫反應(yīng)，增強其抗腫瘤作用。Mansurov等[32]向黑色素瘤小鼠靜脈注射融合了IL-12的膠原結(jié)合區(qū)域（collagen-binding domain fused to IL-12，CBD-IL-12）后，CBD-IL-12誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)持續(xù)的IFN-γ水平，顯著降低IFN-γ全身水平和器官損害，并顯示卓越的抗腫瘤效果。此外，CBD-IL-12與檢查點抑制劑（checkpoint inhibitor，CPI）有協(xié)同作用，根除了大型已建立的黑色素瘤，誘導(dǎo)了抗原特異性免疫記憶，并控制了黑色素瘤基因工程小鼠模型中的腫瘤生長。CBD-IL-12可加強免疫冷腫瘤的CPI免疫治療。

3 IL-12的臨床研究進展

3.1 IL-12的臨床前研究

IL-12首先被證實在黑色素瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌以及肉瘤的小鼠模型中具有抗腫瘤活性，后被應(yīng)用于各種腫瘤模型中。李焱等[33]將急性髓系白血病患者骨髓來源CD34+白血病細胞用IL-12誘導(dǎo)5周后發(fā)現(xiàn)，CD34+白血病細胞可在體外誘導(dǎo)分化為NK細胞，且具有殺傷活性，并且TNF-α和IFN-γ基因表達水平也顯著增加。Cemazar等[34]結(jié)合電化學療法和IL-12基因電轉(zhuǎn)移治療犬類肥大細胞瘤，其中72%的犬只在接受治療后完全緩解（complete response，CR），并且腫瘤體積＜2 cm3的犬只達到100%的CR率。Gao等[35]構(gòu)建了一種基于兩親性聚磷腈的重組鼠IL-12質(zhì)粒（pmIL-12）系統(tǒng)遞送的多聚體囊泡系統(tǒng)來傳遞IL-12以避免其全身毒性，結(jié)果表明，靜脈注射pmIL-12聚合物囊泡可顯著抑制攜帶CT-26結(jié)腸癌細胞的BALB/c小鼠的腫瘤生長，這與有效轉(zhuǎn)染pmIL-12聚合體誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)有關(guān)。Shen等[36]對模型小鼠進行化療以抑制其免疫反應(yīng)，隨后使用IL-12發(fā)現(xiàn)，使用化療對細胞因子產(chǎn)生的抑制作用被解除，并且恢復(fù)了CD4+和CD8+T細胞中IFN-γ的表達。多個臨床前研究表明，腫瘤注射表達IL-12的載體以及表達IL-12的骨髓DC在小鼠中都沒有產(chǎn)生明顯毒性，這也使其成為臨床前研究和臨床研究中應(yīng)用廣泛的細胞因子。Agliardi等[37]研究發(fā)現(xiàn)，IL-12不僅能增強CAR-T細胞的細胞毒作用，而且還能重塑腫瘤微環(huán)境，促進CD4+T細胞腫瘤浸潤，減少Treg的數(shù)量，激活髓系細胞。重要的是，IL-12的免疫治療益處是以最小的全身影響實現(xiàn)的。因此，局部注射IL-12可能是CAR-T細胞治療多形性膠質(zhì)母細胞瘤的一種有效輔助手段。

3.2 IL-12的臨床研究

IL-12在臨床前的廣泛研究及顯著療效促使其向臨床研究快速轉(zhuǎn)化。目前，IL-12常與CAR-T細胞或者其他療法聯(lián)合應(yīng)用來治療惡性腫瘤。Zhang等[38]利用誘導(dǎo)分泌IL-12的質(zhì)粒（NFAT）改造了人類腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL），給予33例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者劑量遞增的注射治療，其中有11例患者通過實體瘤療效評價標準（response evaluation criteria in solid tumor，RECIST）評價為客觀緩解，在接受0.1×109或更少細胞治療的17例患者中，僅觀察到1例患者（5.9%）客觀緩解，與較低細胞劑量下的結(jié)果相反，用（0.3～3.0）×109NFAT-IL-12細胞培養(yǎng)物治療的16例患者中有10例（62.5%）表現(xiàn)出客觀緩解（P=0.0008）；9例患者表現(xiàn)出部分消退，但是這些患者中只有2例持續(xù)進行治療（12個月和27個月），1例患者表現(xiàn)出完全消退。這表明使用更高數(shù)量級的NFAT-IL-12-TIL細胞注射治療可以有效提高自體細胞移植（autologous cell transplantation，ACT）的有效性，這為后續(xù)的臨床試驗提供了有效數(shù)據(jù)。Koneru等[39]在一項正在進行的Ⅰ期臨床試驗中，使用劑量遞增的方式，首次將分泌IL-12的MUC16-CAR-T細胞通過腹膜直接注射到了人腹部的卵巢癌病變部位。You等[40]構(gòu)建了一種包含SM3單鏈可變片段（scFv）序列的CAR-T細胞，該序列專門靶向MUC1抗原并共表達IL-12（SM3-CAR）以及一種攜帶經(jīng)修飾的SM3 scFv序列但未表達IL-12的CAR-T細胞系（pSM3-CAR）。然后將這兩種類型的CAR-T細胞瘤內(nèi)注射到同一MUC1陽性的精囊癌患者的兩個獨立轉(zhuǎn)移性腫瘤中，初步結(jié)果表明，靶向MUC1的CAR-T細胞方法無不良反應(yīng)，并且患者血清細胞因子反應(yīng)為陽性，進一步評估表明，pSM3-CAR有效導(dǎo)致了腫瘤消退。但近兩年的相關(guān)臨床試驗數(shù)據(jù)大多并未公開，暫無法獲取更多臨床試驗數(shù)據(jù)。近年來開展的應(yīng)用IL-12治療惡性腫瘤的相關(guān)臨床研究詳見表1。

表1 IL-12治療惡性腫瘤的相關(guān)臨床研究

4 小結(jié)與展望

IL-12是腫瘤免疫治療中重要的細胞因子，具有較強的抗腫瘤作用，不僅可以調(diào)節(jié)Th細胞的平衡，促使DC細胞成熟，促進CIK細胞增殖并增強其殺傷能力，誘導(dǎo)NK細胞產(chǎn)生，還可以以CAR-T細胞作為載體或者與其他療法聯(lián)合應(yīng)用治療惡性腫瘤。多種IL-12遞送系統(tǒng)在臨床前模型中已經(jīng)證明了強大的抗腫瘤效應(yīng)并可減少不良反應(yīng)的發(fā)生，分子工程方法在有效性和安全性方面改進了IL-12的治療效果。目前，治療惡性腫瘤依然是一個巨大的挑戰(zhàn)。雖然IL-12是一種效應(yīng)性細胞因子，可在腫瘤部位招募各種效應(yīng)性免疫細胞，但它也可能誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。因此，未來的研究，特別是涉及臨床試驗的研究，在將IL-12用于腫瘤患者的免疫治療時，應(yīng)考慮與其相關(guān)的炎癥反應(yīng)，不斷完善IL-12與新型平臺結(jié)合的技術(shù)，保持免疫細胞的持久性、功能活性，以更好地應(yīng)用于腫瘤的臨床治療中。