毛永潔，趙德剛

(1.貴州大學 農(nóng)業(yè)生物工程研究院/生命科學學院/山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學院 貴州省植物保育技術應用工程研究中心，貴州 貴陽 550006)

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)又名膠木，是杜仲科(Eucommiaceae)杜仲屬(Eucommia)植物，在其葉、莖和果皮中能產(chǎn)生不溶于水的天然高分子化合物——杜仲膠(TPI)[1-2]，因其獨特的理化性質(zhì)而被高度重視。研究發(fā)現(xiàn)杜仲膠的合成前體是異戊烯基焦磷酸(Isopentenyl diphosphate，IPP)[3]，IPP與其同分異構(gòu)體生成牻牛兒基焦磷酸(Geranyl diphosphate，GPP)，進一步添加IPP生成法尼基焦磷酸(Farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP)。FPP被認為是橡膠生物合成的起始物[4]，由法尼基焦磷酸合酶(Farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)PS/FPPS)催化IPP和GPP共同合成橡膠。FPS是產(chǎn)膠植物直接參與橡膠生物合成的關鍵酶[5]，Mn2+或Mg2+作為酶促反應的必需輔助因子[6]，通過調(diào)節(jié)橡膠轉(zhuǎn)移酶活性來影響IPP多聚化反應[7]。一些二價陽離子被發(fā)現(xiàn)具有激活甜椒FPS的能力[8]，Mg2+或Mn2+存在時，F(xiàn)PS活性最大。在銀膠菊(PartheniumhysterophorusL.)中，橡膠轉(zhuǎn)移酶對Mg2+濃度的依賴與巴西橡膠樹橡膠轉(zhuǎn)移酶類似，但在程度上沒有那么明顯[9]。在巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)中，金屬離子還會影響橡膠的分子量[4]。在杜仲的生長發(fā)育和杜仲膠生物合成中，必需元素是生長發(fā)育的基礎營養(yǎng)物質(zhì)，也有可能是杜仲膠合成的相關酶類輔基。

本實驗室通過對杜仲組織培養(yǎng)再生體系優(yōu)化為杜仲功能基因的研究提供了技術支持[10]，克隆了橡膠合成相關基因[11]，但在缺素對杜仲幼苗及橡膠合成影響方面的研究較少。因此，本研究以Hoaglang營養(yǎng)液基本配方配制缺乏某一種必需元素的培養(yǎng)液，用于培養(yǎng)杜仲幼苗，分析杜仲幼苗的生長發(fā)育特征以及對杜仲膠含量及分子量的影響，為杜仲栽培管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用種子均為購自山西運城惠民苗木種子的‘華仲15號’，為2020年10月采集的當年生種子。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗用杜仲幼苗的培養(yǎng)

將種子浸泡過夜，用10%NaClO4消毒20 min，用無菌水清洗4～5次，種子兩側(cè)切掉約1 mm，放于鋪滿濕潤無菌紙的水培盆(245 mm×375 mm×93 mm)中培養(yǎng)，用保鮮膜封住盆口防止水分蒸發(fā)。參照杜仲適宜生長條件[12]，將上述種子放置于人工氣候室中，設置條件為溫度(22±2)℃、光周期16 L/8 D、濕度80%、光強2 000 Lx。每盆約300顆種子，預準備30余盆，種子密度約3 cm2/顆。待子葉全展，選擇一葉一心且生長一致的杜仲幼苗作為缺素培養(yǎng)試驗用苗。

1.2.2 營養(yǎng)液的配制

為防止沉淀，預先將各試劑配成一定倍數(shù)的濃縮液，現(xiàn)用現(xiàn)配，配方參照霍格蘭(Hoagland)營養(yǎng)液配方。以下用CK表示霍格蘭全營養(yǎng)液，每一種缺素營養(yǎng)液前以“-”表示以霍格蘭營養(yǎng)液為基礎營養(yǎng)液并缺少該元素(表1)。

表1 缺素及全營養(yǎng)液配方Tab.1 Nutrient deficiency and total nutrient solution formula mg/L

1.2.3 杜仲幼苗形態(tài)測定

測量葉片長和寬 幼苗在缺素溶液中培養(yǎng)40 d后，每組處理隨機取10株，測量自下而上第3片葉(即第一片真葉)的長和寬，葉長取葉尖到葉基之間的長度，葉寬量取葉片最寬部分。

測量根長莖長 用刻度尺和細線測量莖干長度和主根長度；分別測量地上、地下部分鮮重以計算根冠比。每組缺素處理選取10株幼苗，用濾紙吸干其根部的水分，分別稱取其地上部分(頂葉到莖的部分)和地下部分(根)的鮮重，計算其均重，根冠比=地下部分鮮重/地上部分鮮重[13]。

1.2.4 測定色氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性

參照上海酶聯(lián)生物有限公司的植物色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(TAA1)試劑盒的提取方法，任取9株杜仲幼苗測定整株色氨酸轉(zhuǎn)氨酶TAA1活性。以標準物濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度乘以稀釋倍數(shù)即為樣品實際濃度。

1.2.5 杜仲幼苗橡膠含量及其分子量測定

杜仲膠的提取及測定參照前人的方法做適當修改[14-15]，取分別用全營養(yǎng)液和13種缺素營養(yǎng)液培養(yǎng)40 d后的杜仲幼苗各50株，設置3次重復，分別對葉、莖、根3個部位進行烘干稱重提膠，并提取14種杜仲幼苗總含膠量，將提取所得的不同部位的膠用于分子排阻色譜儀測定分子量。

2 結(jié)果與分析

2.1 缺素培養(yǎng)對杜仲幼苗生長發(fā)育的影響

2.1.1 缺素培養(yǎng)對杜仲幼苗根和莖生長的影響

研究表明，必需元素的每一種元素缺乏都會對杜仲幼苗根和莖的生長產(chǎn)生影響。全營養(yǎng)條件下培養(yǎng)40 d，在13種必需元素中，缺Mg對莖長和根長影響最小，莖長比全營養(yǎng)液幼苗減少8.86%，差異達顯著水平(P<0.05)，根長減少29.14%，差異均達極顯著水平(P<0.01)；缺大量元素Ca對幼苗莖和根生長影響最大，分別比全營養(yǎng)液幼苗減少23.44%和41.84%，差異均達到極顯著水平(P<0.01)；缺乏微量元素Zn對杜仲幼苗莖和根生長影響最大，分別比全營養(yǎng)液幼苗的莖和根長減少23.23%和36.10%，差異均達極顯著水平(P<0.01)，見表2。

表2 缺素處理對杜仲幼苗莖和根生長的影響Tab.2 The effect of nutrient deficiency on the stem and root growth of E.ulmoides seedlings

2.1.2 缺素培養(yǎng)對杜仲幼苗葉片長和寬的影響

缺素處理下杜仲幼苗葉片長和寬均減小(表3)，缺N時葉片長僅為20.7 mm，減少17.86%，差異達極顯著水平(P<0.01)，葉寬為9.4 mm，較全營養(yǎng)液培養(yǎng)植株葉片減小11.32%，未達到顯著差異；缺Mg時對幼苗葉片生長影響最大，葉片長僅為14.3 mm，葉寬為5.8 mm，比全營養(yǎng)液培養(yǎng)植株葉片分別減小43.25%，44.53%，差異均達到極顯著水平(P<0.01)。

表3 缺素處理對杜仲幼苗葉片生長的影響Tab.3 The effect of nutrient deficiency on the leaf growth of E.ulmoides seedlings

2.1.3 缺素培養(yǎng)對杜仲幼苗根冠比的影響

在對杜仲幼苗分別進行13種必需元素缺素培養(yǎng)40 d發(fā)現(xiàn)，缺素導致杜仲幼苗地上部分鮮重減少，缺P、缺Ca、缺Mg、缺B培養(yǎng)時地上鮮重最低，為0.14 g，比全營養(yǎng)液培養(yǎng)減少22.22%，差異達極顯著水平(P<0.01)，見表4。

表4 缺素處理對杜仲幼苗地上部分和地下部分生長的影響Tab.4 The effect of nutrient deficiency on the growth of the aboveground and underground parts of E.ulmoides seedlings

缺Mg、缺S、缺Fe、缺Mn、缺B、缺Cu、缺Mo培養(yǎng)的幼苗均與全營養(yǎng)液培養(yǎng)的幼苗地下部分鮮重差異達顯著水平(P<0.05)。對照根冠比為0.28，缺素培養(yǎng)下幼苗的根冠比均較全營養(yǎng)液培養(yǎng)幼苗根冠比提高，除缺Fe、缺Mn、缺Mo、缺Cl培養(yǎng)時幼苗根冠比與全營養(yǎng)液培養(yǎng)的幼苗根冠比差異達顯著水平(P<0.05)外，其余缺素培養(yǎng)下幼苗的根冠比均與全營養(yǎng)液培養(yǎng)的幼苗根冠比差異達到極顯著水平(P<0.01)。缺N或缺Ca培養(yǎng)時幼苗根冠比最高，說明N元素與Ca元素的缺乏對莖與葉的生長起到嚴重抑制作用，使地上部分與地下部分生長不協(xié)調(diào)從而使根冠比提高。

2.2 杜仲幼苗缺素癥狀

杜仲幼苗在缺N營養(yǎng)液中培養(yǎng)第8 d時開始缺綠，真葉從葉尖沿葉脈向基部出現(xiàn)缺綠癥狀，有的缺綠出現(xiàn)在單側(cè)葉邊緣，呈灼燒狀，葉片先變黃后變白，在缺素第14 d即整葉白化。葉尖發(fā)白后逐漸變暗灰，最后葉尖焦枯變黑(圖1B和圖2B)。缺P營養(yǎng)液培養(yǎng)的杜仲幼苗葉片從中部邊緣缺綠，向葉脈和葉基部擴展，植株生長矮小，葉小，葉邊緣皺縮(圖1C和圖2C)。杜仲幼苗缺K癥狀在培養(yǎng)的第13 d時出現(xiàn)，從葉中部邊緣開始缺綠，逐漸向內(nèi)擴展，葉片表面變皺縮；也有的從葉尖開始變白，逐漸向葉基部擴展。整葉白化后，葉尖焦枯(圖1D和圖2D)。杜仲幼苗缺Ca癥狀出現(xiàn)較晚，嫩葉生長小，葉片中部及基部變黃，植株矮小(圖1E和圖2E)。杜仲幼苗缺Mg培養(yǎng)到第18 d時生長點壞死，葉片窄小，已長出的新葉從葉尖開始枯萎，葉片卷曲，缺綠從葉尖開始沿葉脈逐漸向基部擴展，葉尖狹長(圖1F和圖2F)。杜仲缺S癥狀出現(xiàn)較晚，在缺素培養(yǎng)第27 d后出現(xiàn)缺素癥狀，葉片畸形，葉基發(fā)黃(圖1G和圖2G)。杜仲幼苗缺Fe培養(yǎng)時，從葉尖或葉邊緣開始缺綠，向葉基部擴展直至全葉白化，有的葉片邊緣出現(xiàn)壞死斑點直至全葉焦枯(圖1H和圖2H)。杜仲幼苗在缺微量元素Mn時，葉生長不對稱，葉小，培養(yǎng)一段時間后葉尖出現(xiàn)黑點，植株矮小，葉脈發(fā)黃，葉片皺縮，葉尖焦枯(圖1I和圖2I)。缺B培養(yǎng)的杜仲幼苗葉片出現(xiàn)黑斑點，葉小，嫩葉變黑焦枯死亡(圖1J和圖2J)。缺Zn培養(yǎng)的幼苗矮小，葉片窄細狹長，葉片出現(xiàn)壞死斑點，葉色暗沉，卷曲，或葉尖焦枯(圖1K和圖2K)。杜仲幼苗缺Cu培養(yǎng)的癥狀出現(xiàn)較晚，在缺素培養(yǎng)第32 d后才出現(xiàn)缺素癥狀，葉尖出現(xiàn)黑斑點，葉色較深，葉小，葉面不平整(圖1L和圖2L)。缺Mo杜仲植株葉片畸形，缺綠呈灼燒斑狀從葉尖逐漸向基部擴展(見圖1M和圖2M)。杜仲缺Cl培養(yǎng)時從葉尖開始缺綠逐漸向基部擴展，葉片卷曲畸形，新葉縱向彎曲，葉不對稱且小(圖1N和圖2N)。

圖1 體視顯微鏡下杜仲缺素葉片注：A為CK，B為-N，C為-P，D為-K，E為-Ca，F(xiàn)為-Mg，G為-S，H為-Fe，I為-Mn，J為-B，K為-Zn，L為-Cu，M為-Mo，N為-Cl，Bar=1 cm。下同。Fig.1 E.ulmoides leaves under a stereo microscope

圖2 杜仲幼苗缺乏必需元素形態(tài)Fig.2 E.ulmoides seedlings lack essential element morphology

2.3 缺素培養(yǎng)對杜仲幼苗生長素合成關鍵酶活性的影響

在13種必需元素下，每一種缺素營養(yǎng)液培養(yǎng)的杜仲幼苗生長素合成關鍵酶——色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(TAA1)活性極顯著低于全營養(yǎng)液植株(P<0.01)(圖3)，所有缺素處理的TAA1酶活濃度均低于對照。全營養(yǎng)液培養(yǎng)下植株的TAA1活性為0.88 U/g，缺Mn營養(yǎng)液培養(yǎng)的杜仲植株TAA1酶活性最低，為0.39 U/g，較全營養(yǎng)液培養(yǎng)的植株減少55.68%。另外，缺P和缺Zn時TAA1活性也較低，分別為0.42 U/g和0.44 U/g，較全營養(yǎng)液培養(yǎng)植株降低52.28%、50.00%?？赡苁荕n、P、Zn的缺少影響了色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的合成，使其活性降低，Zn2+還是色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的輔基，對酶活性至關重要。

圖3 缺素處理對杜仲幼苗TAA1活性的影響注：**表示在α=0.01水平差異顯著；*表示在α=0.05水平差異顯著。Fig.3 Effects of different nutrient deficiency on water content of E.ulmoides seedlings

2.4 缺素培養(yǎng)對杜仲幼苗橡膠含量及分子量的影響

研究結(jié)果表明，杜仲幼苗缺少大量元素N、K、Ca、Mg、S以及微量元素Mn、B、Mo時其含膠量均有不同程度的減小。缺S營養(yǎng)液培養(yǎng)植株含膠量減少最多，為0.10‰，比全營養(yǎng)液培養(yǎng)的植株下降95.88%；缺Ca營養(yǎng)液培養(yǎng)的杜仲幼苗葉片含膠量減少最多，為0.01‰，比全營養(yǎng)液培養(yǎng)的植株下降99.42%；缺K營養(yǎng)液培養(yǎng)的杜仲幼苗幼莖含膠量減少最多，為0.01‰，比全營養(yǎng)液培養(yǎng)的植株下降97.06%；缺Mn營養(yǎng)液培養(yǎng)的杜仲幼苗根部含膠量減少最多，為0.01‰，比全營養(yǎng)液培養(yǎng)的植株下降95.45%(表5)。

表5 缺素處理對杜仲幼苗含膠量的影響Tab.5 The effect of nutrient deficiency on the gum content of E.ulmoides seedlings

杜仲幼苗缺大量元素K以及微量元素Fe、Mn、B、Zn、Cu、Cl時，杜仲膠分子量出現(xiàn)不同程度的減小，全營養(yǎng)液培養(yǎng)的杜仲幼苗葉、莖、根中橡膠的相對分子量分別為73.56×104、10.36×106、70.58×105Da；缺Mn時葉片中橡膠分子量最小，為0.10×104Da，下降99.86%；缺Fe時葉片橡膠分子量下降相對較少，為24.5×104Da，比對照下降66.69%。缺B時幼莖中橡膠分子量減小最大，為854 Da，下降99.99%；缺Fe時幼莖中橡膠分子量下降較小，為5.13×104Da，下降99.50%。缺B時根部分子量下降最大，為30.00×102Da，也下降99.96%，其他缺素植株橡膠分子量均有不同程度下降(表6)。

表6 缺素處理對杜仲幼苗橡膠分子量的影響Tab.6 The effect of nutrient deficiency on the rubber molecular weight of E.ulmoides seedlings

3 討論與結(jié)論

通過對13種必需元素分別缺素培養(yǎng)的缺素癥狀和橡膠生物合成進行分析，發(fā)現(xiàn)缺素處理影響杜仲幼苗的生長發(fā)育和形態(tài)，使植株生長受到抑制，變矮小，葉片減小，這可能與生長素合成的關鍵酶活性減小有關。缺素處理還使其中幾種缺素培養(yǎng)下的杜仲幼苗的膠含量或橡膠分子量降低。

在缺N培養(yǎng)14 d后杜仲幼苗整葉白化，這是由于葉綠素合成減少或光系統(tǒng)中現(xiàn)有葉綠素結(jié)合蛋白的分解，使得黃化病在整個葉片中傳播均勻[16]。缺N時使根冠比提高，是由缺N對植株地上部分生物量的抑制大于對地下生物量的抑制導致的，這與其他植物缺N植株表現(xiàn)特征的結(jié)果一致[17-18]，而缺Fe時杜仲幼苗全葉黃白化較缺N培養(yǎng)下速度更慢，并呈現(xiàn)葉片由上而下白化，葉尖最后焦枯。P是植物細胞內(nèi)重要化合物核酸、磷脂、輔酶、ATP等物質(zhì)的必需組分[19-20]。杜仲幼苗缺P時出現(xiàn)葉片暗綠、皺縮并伴有邊緣白化出現(xiàn)，這些缺P癥狀與其他植物的相同[20-21]。與油菜(BrassicachinensisL.)缺P時由于糖分運輸受阻，葉片積累大量糖分，有利于花色素苷的形成而葉片變紅不同[22]，在缺P營養(yǎng)液中培養(yǎng)40 d的杜仲幼苗葉片暫未出現(xiàn)發(fā)紅癥狀，這可能是由于缺素培養(yǎng)時間不夠。K元素主要集中在植物生命最活躍的部位，如生長點、幼葉、形成層的幼嫩組織。杜仲幼苗在缺K時表現(xiàn)出葉面皺縮，彎曲不平整，是缺K的顯著特征[23-24]。Mn在植物體中作為酶的輔助因子參與呼吸作用、光合作用中水光解等生理生化過程[19]，缺Mn時杜仲幼苗葉尖變黑壞死，色淡，葉脈變黃，這些缺Mn癥狀與‘南豐蜜橘’(Citrusreticulata‘Kinokuni’)、玉米(ZeamaysL.)缺Mn時相同[25-26]。

杜仲膠是在含膠細胞中合成[1]，生長素對細胞分裂、分化以及伸長等均有調(diào)控作用，可作為細胞增殖的信號決定器官的大少和形狀。吲哚-3-丙酮酸途徑是植物生長素合成的主要途徑之一，色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(tryptophan aminotransferase，TAA)是催化生長素合成的關鍵酶[27]。IAA的合成前體——色氨酸的合成需要鋅[28]，缺鋅時導致植物體內(nèi)生長素合成銳減；Mn能促進吲哚乙酸加速氧化，缺錳將導致IAA加快分解，阻礙植物體內(nèi)的IAA合成及極性運輸[29]。杜仲幼苗缺Mn后，生長素合成關鍵酶TAA1活性是所有缺素植株中最低，缺Mn時TAA1活性降低，影響生長素合成。此外，有研究證實，生長素促進植物生物量的積累[30]，當植物必需營養(yǎng)元素缺乏時，生物量和產(chǎn)量均受到較大影響[31-32]。缺素處理下杜仲幼苗的正常生長受到影響，主要表現(xiàn)為葉小和植株矮化，必需元素缺乏時，杜仲植株地上部分受抑制更加嚴重，使根冠比有所提高；缺N、缺K、缺Ca、缺Mg、缺S、缺Mn、缺B、缺Mo下培養(yǎng)的杜仲植株中橡膠含量均明顯減少，葉、莖、根含膠量減少最多的分別是缺Ca、缺K、缺Mn營養(yǎng)液培養(yǎng)的植株。研究發(fā)現(xiàn)EuREF1表達量越高，橡膠分子量越大[11]。缺K、缺Fe、缺Mn、缺B、缺Zn、缺Cu、缺Cl時培養(yǎng)的杜仲幼苗，其杜仲膠分子量均較全營養(yǎng)液培養(yǎng)的明顯減小，尤其是缺Mn時葉片中杜仲膠分子量最??；而缺B時莖與根中橡膠分子量最小，其中的內(nèi)在機理還有待深入研究。