孫亞瑞，張峰程，許彬，何俊，孟靜，3

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 園林園藝學院，云南 昆明 650201； 2.中國科學院昆明植物研究所，云南 昆明 650201；3.云南省極小種群野生植物綜合保護重點實驗室，云南 昆明 650201)

植物在自然環(huán)境里生長，容易受到不同因素的影響，特別是非生物因素。其中，干旱脅迫會影響植物的地理分布，限制植物產(chǎn)量，影響植物的觀賞價值，制約植物生態(tài)效益[1-3]。聚乙二醇(PEG-6000)是一種乙醇聚合物，具有較強的吸水性，可使植物細胞脫水，從而達到模擬干旱脅迫的目的[4]。許多高等植物在遭受干旱脅迫時，常通過調(diào)節(jié)其自身代謝機制、保護酶類來應(yīng)對干旱[5]。例如：通過氣孔調(diào)控來加強保水能力，通過促進根系生長以增加吸水能力，通過糖和脯氨酸等物質(zhì)的積累來提高滲透調(diào)節(jié)能力，通過活性氧清除酶以及抗氧化劑來降低干旱損害等[6]。這些調(diào)節(jié)機制僅能忍受輕度和中度干旱，無法應(yīng)對長時間的重度干旱。而一些通過獨特耐極端干旱的機制來適應(yīng)干旱的復(fù)蘇植物可以在極端缺水的條件生存，復(fù)水后可恢復(fù)正常的生長發(fā)育[7-9]。

彌勒苣苔(OreocharismileensisMich.M?ller & A.Weber)為苦苣苔科(Gesneriaceae)馬鈴苣苔屬(OreocharisBenth.)多年生耐蔭草本，無地上莖，葉片基生，有柄，呈圓卵形，花冠黃色唇形，可作為室內(nèi)觀賞花卉，具有較高的觀賞價值和開發(fā)潛力[10-11]。1906年法國傳教士在云南彌勒縣首次采集到該種，時隔百年后，該種的野生群在云南石林縣再次被發(fā)現(xiàn)[12]。彌勒苣苔多生長在石灰?guī)r地區(qū)，野生群僅在云南(彌勒、石林)、廣西(百色)、貴州(興義)分布，數(shù)目少，為極小種群，被列為珍稀瀕危植物[12-15]。因彌勒苣苔生長環(huán)境惡劣，能夠在極端干旱條件下生存，一旦恢復(fù)水分就可以迅速恢復(fù)正常的生長狀態(tài)，表明其為復(fù)蘇植物。Li等[16]研究了彌勒苣苔對極端干旱的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)它具有一種通過調(diào)節(jié)膜脂組成來應(yīng)對干旱的新的耐旱模式。目前，對于彌勒苣苔在干旱脅迫下形態(tài)和生理生化變化的研究還鮮有報道。因此，以2 a生彌勒苣苔植株為試驗材料，通過不同濃度的聚乙二醇(PEG-6000)模擬干旱脅迫，觀測其形態(tài)特征變化并測定生理指標，探討干旱脅迫對其生長的影響，為其引種栽培及保護提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇2 a生生長良好、無病蟲害的彌勒苣苔植株，栽植于規(guī)格16 cm×16 cm×12 cm的塑料盆中。栽培基質(zhì)采用草炭∶珍珠巖=1∶1。放置于溫室里統(tǒng)一管養(yǎng)。

1.2 試驗內(nèi)容與方法

采用不同濃度的PEG-6000溶液模擬干旱脅迫，共設(shè)置4個處理：0(CK)、5%(T1)、10%(T2)、15%(T3)。采用隨機區(qū)組設(shè)計，每個處理6盆，重復(fù)3次，共72盆。試驗前澆透水，3 d后用塑料袋包住栽植參試苗木的塑料盆底部，澆灌PEG-6000溶液，于干旱脅迫處理0 、4、8 d時分別觀測參試苗木形態(tài)指標及測定相關(guān)生理指標。

彌勒苣苔形態(tài)指標的觀測：每隔4 d記錄一次植株的生長表現(xiàn)(生長旺盛與否)、葉片狀況(色澤的變化、萎蔫與否)。采用3級分級標準綜合評定參試苗木的受害程度：-，無傷害；+，植株生長受到影響，出現(xiàn)葉片邊緣卷曲；++，植株停止生長，葉片失水全部卷曲[17]。

生理指標測定：每隔4 d，于8:30統(tǒng)一取樣，分別從植株基部葉片開始取樣[18]，每個處理設(shè)3個重復(fù)，所取葉片用錫箔紙包住，液氮速凍放入密封袋中，保存在-80 ℃的超低溫冰箱中，以待相對電導率(%)、葉綠素含量(mg/g)、丙二醛含量(nmol/g)、過氧化物酶〔U/(g·min)〕以及超氧化物歧化酶(U/g)等指標的測定。每個樣品測定重復(fù)3次。

相對電導率采用電導儀法測定；葉綠素含量和丙二醛(MDA)含量分別用分光光度計法、硫代巴比妥酸(TBA)法測定；過氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定分別采用愈創(chuàng)木酚法和氮藍四唑(NBT)光化還原法[19]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件統(tǒng)計分析，DPS 7.05進行方差及顯著性分析。

2 結(jié)果分析

2.1 干旱脅迫對彌勒苣苔形態(tài)特征的影響

不同濃度PEG-6000溶液處理后，T1、T2、T3處理隨時間的推移，葉片均表現(xiàn)出不同程度的萎蔫(表1)。第4 d，T2和T3處理葉片開始表現(xiàn)萎蔫，T1處理表現(xiàn)正常；第8 d時，T1、T2和T3處理葉片均表現(xiàn)萎蔫，T3處理的植株停止生長，葉片失水全部卷曲，受害最重。

表1 干旱脅迫下彌勒苣苔葉片形態(tài)變化Tab.1 The observation of leaf morphology of O.mileensis under drought stress

2.2 干旱脅迫下彌勒苣苔相對電導率的變化

由圖1可知，隨著脅迫時間增加，CK處理彌勒苣苔葉片的相對電導率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，于第4 d達到最大值。T1和T2、T3處理葉片的相對電導率均在第8 d達到最大值，與第0 d相比分別增加了24.61%、33.68%和26.57%。干旱脅迫第4 d，CK處理葉片的相對電導率與T2處理相比差異顯著(P<0.05)，CK處理與T1和T3處理比較差異不顯著(P>0.05)；干旱脅迫第8 d，T2、T3處理葉片的相對電導率與CK相比差異顯著(P<0.05)。

圖1 干旱脅迫下彌勒苣苔相對電導率的變化趨勢注：圖中數(shù)據(jù)為平均值，不同小寫字母表示同一時間處理間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同。Fig.1 The changes of relative conductivity of O.mileensis under drought stress

2.3 干旱脅迫對彌勒苣苔葉綠素含量的影響

由圖2可知，經(jīng)不同濃度的PEG-6000處理后，T2和T3處理隨著脅迫時間增加，彌勒苣苔葉片葉綠素含量呈上升趨勢。干旱脅迫第8 d，T2、T3處理葉綠素含量分別比CK增加20.86%和17.02%，T1處理較CK減少了6.88%； T2處理與CK間差異不顯著(P>0.05)。

圖2 干旱脅迫下彌勒苣苔葉綠素含量的變化趨勢Fig.2 The changes of chlorophyll content in O.mileensis under drought stress

2.4 干旱脅迫對彌勒苣苔丙二醛含量的影響

由圖3可知，采用低濃度到高濃度的PEG-6000處理后，彌勒苣苔葉片的MDA含量呈現(xiàn)平穩(wěn)的上升趨勢。在脅迫第8 d時，T3處理葉片的MDA含量較CK、T1和T2分別增加了23.56%、26.27%、28.80%，存在極顯著差異(P<0.01)，CK、T1、T2處理之間差異不顯著(P>0.05)。

圖3 干旱脅迫下彌勒苣苔丙二醛含量的變化趨Fig.3 The changes of MDA content in O.mileensis under drought stress

2.5 干旱脅迫對彌勒苣苔過氧化物酶活性的影響

由圖4可以看出，各處理葉片POD活性隨脅迫時間的延長和脅迫時間的增加，均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，于干旱脅迫第4 d達峰值，其中T2處理POD活性最高為615.50 U/(g·min)，較同一時間的CK顯著增加了14.92%(P<0.05)。各處理在第8 d時，POD活性均降低，較第4 d分別減少了43.46%、65.30%、58.43%、61.85%，處理間差異不顯著(P>0.05)。

圖4 干旱脅迫下彌勒苣苔過氧化物酶活性的變化趨勢Fig.4 The changes of POD activity in O.mileensis under drought stress

2.6 干旱脅迫對彌勒苣苔超氧化物歧化酶活性的影響

由圖5可知，各處理彌勒苣苔葉片SOD活性隨干旱脅迫時間的延長和脅迫程度增加，均呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢。脅迫第8 d時，各處理SOD活性達到峰值，其中T3處理SOD活性最高；T1、T2、T3處理與CK處理SOD活性相比分別增加了49.19%、110.66%、141.76%，差異極顯著(P<0.01)。

圖5 干旱脅迫對彌勒苣苔超氧化物歧化酶活性的變化趨勢Fig.5 The changes of SOD activity in O.mileensis under drought stress

3 討論與結(jié)論

干旱脅迫下，植物的形態(tài)特征可直接反映植物受損害的程度，株高、莖粗、葉片形態(tài)、葉片數(shù)和葉面積等植物地上部會因干旱脅迫造成不同程度的影響[20]。通常植物會通過放慢生長速度或縮小葉面積來緩解水分虧缺造成的危害。本研究表明，PEG-6000濃度為5%對彌勒苣苔葉片生長無顯著影響，而隨著干旱脅迫的加劇，葉片出現(xiàn)不同程度的卷曲，與Li等[16]對彌勒苣苔、趙日成[17]對長瓣馬鈴苣苔(Oreocharisauricula)的研究結(jié)果相一致，表明彌勒苣苔可以通過葉片卷曲來適應(yīng)干旱環(huán)境。

植物在遭受干旱脅迫時，植株體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧，對細胞膜系統(tǒng)造成傷害,相對電導率可用于判斷細胞膜損傷程度。產(chǎn)生過量活性氧自由基也會引起細胞膜脂過氧化，MDA是細胞膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，它的大量累積是活性氧作用的表現(xiàn)。因此，MDA可用于表示細胞膜脂過氧化程度[19,21-22]。眾多研究者認為相對電導率與MDA含量呈正相關(guān)。本研究表明，彌勒苣苔葉片隨著干旱脅迫時間的延長,相對電導率和MDA含量呈上升趨勢，各處理間差異不顯著(P>0.05)，與張璐等[23]對文冠果(Xanthocerassorbifolium)在干旱脅迫下耐鹽性的研究結(jié)果一致。在脅迫4 d時，T1、T2、T3處理植株的MDA含量和相對電導率較CK差異不顯著(P>0.05)，推測在脅迫初期,彌勒苣苔植株有較強的抗旱性，未對細胞內(nèi)環(huán)境造成嚴重傷害，與劉凱月等[24]對荊芥(Nepetacataria)的研究結(jié)果一致。在脅迫8 d時，T3處理葉片的MDA含量極顯著高于CK(P<0.01)，其相對電導率卻與CK差異不顯著(P>0.05)，推測在脅迫后期彌勒苣苔植株受害較輕，這與張丹丹等[25]對大花旋蒴苣苔(Boeaclarkeana)的研究結(jié)果一致，表明彌勒苣苔具有一定的耐旱性。

光合作用是植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)，葉綠素是參與光合作用的一個重要因素，其含量能直接反映植物適應(yīng)、利用環(huán)境因子以及制造有機物的能力[26]。本研究表明，彌勒苣苔葉片中葉綠素含量整體呈上升趨勢，與羅孟容等[27]對梔子(Gardeniajasminoides)研究結(jié)果一致。而孔艷菊等[28]對黃櫨(Cotinuscoggygria)研究中表明干旱脅迫下，植物體內(nèi)葉綠素的合成和降解系統(tǒng)易受破壞，從而導致葉綠素含量降低。產(chǎn)生差異的原因可能是彌勒苣苔在干旱脅迫下具有抗旱性，能夠減輕干旱對葉綠素合成與降解系統(tǒng)的傷害。

POD是一種廣泛存在于植物細胞內(nèi)的氧化還原酶，可清除羥基自由基和H2O2，也在抗旱性中發(fā)揮重要作用[29]。本研究表明，彌勒苣苔葉片POD活性在干旱脅迫4 d時上升很快，推測彌勒苣苔為了適應(yīng)所處的脅迫環(huán)境，激發(fā)體內(nèi)保護機制，與高興國等[30]對光葉珙桐(Davidiainvolucratavar.vilmoriniana)的研究結(jié)果一致。但在干旱脅迫第8 d時POD活性開始下降，推測干旱脅迫強度達到一定程度，超氧陰離子大量積累破壞酶結(jié)構(gòu)，導致酶活性降低[31]。

植物受到干旱脅迫時，細胞內(nèi)產(chǎn)生和清除活性氧的平衡系統(tǒng)就會受到破壞，導致活性氧積累。SOD是一種清除活性氧自由基(O2-)的酶，可以猝滅O2-的毒性，維持活性氧代謝平衡、保護膜結(jié)構(gòu)，使植物在一定程度上可以抵御水分脅迫[32]。本研究表明，各處理隨著時間的增加，干旱脅迫第4 d，SOD活性呈緩慢上升趨勢，與阮凌暄等[33]對鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)的研究結(jié)果不一致，推測在干旱初期彌勒苣苔葉片能夠正常生長，體內(nèi)產(chǎn)生的O2-較少。在脅迫第8 d時，SOD活性達到最大值，T2、T3與CK、T1處理表現(xiàn)出極顯著差異(P<0.01)，與董晶晶等[34]對牛膝菊(Galinsogaparviflora)的研究結(jié)果一致，推測當干旱脅迫達到一定的積累，彌勒苣苔體內(nèi)可產(chǎn)生大量的酶進行自我保護。

綜上所述，在干旱脅迫后期，彌勒苣苔葉片出現(xiàn)不同程度的卷曲，來抵御干旱；相對電導率、MDA含量呈顯著上升趨勢，增加了彌勒苣苔葉片膜脂過氧化程度；在整個脅迫實驗過程中，POD活性呈先上升后下降的趨勢；SOD活性前期呈緩慢上升趨勢，后期各處理迅速升高，推測彌勒苣苔可以通過增強酶活性來保護其膜系統(tǒng)。