王興寧，李 志，唐亞峰，李 巧，戴 唯，李 潔，朱 明

(貴陽海關綜合技術中心，貴州 貴陽 550081)

0 引言

除草劑是指用來防治雜草和有害植物的藥劑，按照化學結構可分為磺酰脲類、咪唑啉酮類、三嗪類、酰胺類、二硝基苯胺類、芳氧苯氧丙酸酯類、二苯醚類、環(huán)己烯酮類、硫代氨基甲酸酯類等[1]。GB 2763-2021規(guī)定了564種農(nóng)藥10 092項最大殘留限量，其中除草劑類農(nóng)藥占據(jù)著重要比例，如氟吡禾靈等在果蔬中殘留限量為0.02～1 mg/kg[2]。除草劑的使用大大提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率，但也存在一些問題，如作物品種的敏感性、雜草抗藥性和殘留藥害等負面影響，如磺酰脲類除草劑土壤濃度在達到1 g/hm時即可對后茬敏感作物產(chǎn)生藥害。雖然除草劑及其代謝降解產(chǎn)物對哺乳動物、魚類、鳥類和人類毒性很低，但攝人一定量的除草劑可引起腹瀉、食欲減退、抑郁，出現(xiàn)肺、肝臟、脾臟和腦膜的嚴重充血等毒性反應[3]。當前，中國、日本和美國等許多國家和地區(qū)已對其在農(nóng)產(chǎn)品中的除草劑殘留規(guī)定了嚴格限量。因此，建立操作簡單、快速、準確的對果蔬中多種類除草劑的殘留量快速檢測方法迫在眉睫。

當前檢測除草劑的方法主要有氣相色譜-質譜法[4-5]、高效液相色譜法[6]、高效液相色譜-串聯(lián)質譜法[7-8]和高分辨質譜法[9-10]，但上述方法存在檢測的除草劑種類單一、樣品前處理操作繁瑣、檢測通量低、對復雜基質的抗干擾能力弱，易出現(xiàn)假陽性等缺點。QuEChERS方法是美國農(nóng)業(yè)部Anastassiades等人于2003年開發(fā)的一種基于固相萃取和基質固相分散技術的預處理方法，具有簡單、快速，用時短，受到廣大食品安全檢測人員的喜愛[11-12]。靜電場軌道離子阱(Orbitrap)高分辨質譜具有靈敏度高、選擇性好、抗干擾能力強和高通量等優(yōu)勢，已經(jīng)被分析工作者逐漸應用到了多種類、高通量農(nóng)藥殘留的快速篩查工作中[13]。當前采用同位素內標-QuEChERS結合高分辨質譜檢測果蔬中多種類除草劑殘留的研究報道甚少。

本文建立了一種同位素內標、優(yōu)化QuEChERS前處理條件，結合超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜檢測果蔬中84種除草劑的方法。并對實驗室日常檢測的50批水果蔬菜中84種除草劑殘留進行檢測，方法具有靈敏度高、雜質干擾少、準確度高等特點，可為果蔬中除草劑殘留的風險篩查提供技術支撐。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

UHPLC-Q Exactive 超高效液相色譜-質譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；分析天平PB1502-L(瑞士Metter Toledo公司，感量10 mg)和XP205DR(瑞士Metter Toledo 公司，感量0.01 mg)；移液器(美國Thermo公司)；Elix/Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

乙腈、甲醇、甲酸銨、甲酸(上海安譜有限公司)；無水硫酸鎂(MgSO4)和乙酸鈉均為農(nóng)殘級(山東西雅試劑)；N-丙基乙二胺(PSA，40～60 μm)，石墨化炭黑(GCB，30～90 μm)，C18(50 μm，60 ?)農(nóng)殘級(上海安譜有限公司)；多壁碳納米管(MWCNTs，長度10～30 μm，外徑 10～20 nm，內徑 5～10 nm，純度>95% ，比表面積>200 m2/g，南京先豐納米材料科技有限公司)；緩沖鹽試劑包：含有6 g無水硫酸鎂和1.5 g乙酸鈉(天津艾杰爾公司)。84種除草劑標準品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；同位素內標(±)氟吡禾靈-d4(純度99.0%)(加拿大Toronto Research Chemical公司)。

單個標準儲備溶液：稱取84種除草劑標準品各10 mg，分別用乙腈或甲苯溶解并定容至10 mL，配制成1 000 μg/mL的標準儲備溶液，于-20 ℃避光保存?；旌蠘藴嗜芤海涸儆靡译媾渲瞥?0 μg/mL的混合標準溶液和氟吡禾靈-d4的內標溶液，于-4 ℃避光保存。標準工作溶液：取適量的混合標準溶液和內標溶液用乙腈稀釋，配置成5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL(含內標50 ng/mL)標準工作溶液，于-4 ℃避光保存。

果蔬樣品(白菜、柑橘、獼猴桃、馬鈴薯、結球甘藍、甜椒、洋蔥、芹菜、菠菜、蘿卜等)均來自實驗室日常抽檢的樣品。

1.2 儀器工作條件

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC HSS- T3(2.1×50 mm,1.7 μm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；流動相A為5 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液，流動相B為5 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸甲醇溶液。二元梯度洗脫程序：0 min時，B保持為8%；0～9 min時，B由8%升至95%；9～11 min時，B由95%升至100%；11～14 min時，B由100%降至8%；12～15 min時，B保持在8%。

質譜條件：噴霧電壓為 3.5 kV；輔助氣加熱源溫度：350 ℃；金屬毛細管溫度：320 ℃；鞘氣壓力：4.55 L/min(35 arb)；輔助氣壓力：3 L/min(10 arb)；掃描范圍(m/z)：100～700 Da；管狀透鏡電壓：50 V；包含模式：開；運行時間：15 min。一級質譜全掃描(Full scan)分辨率：R=70 000；自動增益控制目標離子數(shù)(AGC target)：3e6；最大注入時間：250 ms。數(shù)據(jù)依賴二級離子全掃描(data-dependent Full MS2，ddMS2)分辨率：R=35 000；歸一化碰撞能(NCE)：20、45和70 eV；自動增益控制目標離子數(shù)(AGC target)：2e5；最大注入時間：120 ms；動態(tài)排除：10 s;循環(huán)次數(shù)(Loop count):5；隔離寬度(Isolation width):m/z4.0。84種除草劑的質譜信息見表1。

表1 84種除草劑的CAS號、分子式、離子類型、保留時間、精確質量數(shù)、質量數(shù)測定值、二級碎片離子Tab.1 CAS no., molecular formula, ion formation,retention time,accurate mass,Mass determination and product ion of the 84 herbicides

續(xù)表1

續(xù)表1

1.3 樣品的制備

果蔬樣品粉碎后，準確稱取10 g(精確到0.01 g)于50 mL聚丙烯離心管中，依次加入內標50 μL(10 μg/mL)、10 mL含1%乙酸乙腈溶液，渦旋5 min。加入6 g無水硫酸鎂和1.5 g 乙酸鈉，劇烈震蕩2 min使之混合均勻，5 000 r/min離心5 min。取上清液1.5 mL至預裝有150 mg 無水硫酸鎂、25 mg C18和25 mg MWCNTs的微型螺旋蓋聚丙烯離心管中，渦旋混合2 min，68 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm 濾膜，待UHPLC-Q-Orbitrap HRMS測定。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化和譜庫的建立

根據(jù)84種除草劑的分子結構和性質，選擇Full MS模式進行一級質譜母離子全掃描，設置質量范圍m/z80～1 100、分辨率(FWHM)70 000，對100 ng/mL混合標準溶液進行檢測，依據(jù)每個化合物的理論質量數(shù)提取一級母離子色譜圖，得到保留時間和精確質量數(shù)，84種除草劑母離子的實際質量數(shù)偏差均小于5×10-6，符合定性要求[14]。選擇二級質譜Full MS/dd MS2模式，在包含列表(Inclusion list)中輸入每個化合物的母離子精確質量數(shù)，依據(jù)保留時間設置掃描時間段，使質譜有針對性的掃描和裂解，并優(yōu)化碰撞能量得到最佳二級碎裂子離子質譜圖。選擇一級質譜全掃描的母離子作為定量離子，至少選擇2個具有代表性的二級質譜碎裂離子作為定性離子。結果表明，大多數(shù)除草劑在ESI+模式具有較好的響應強度，因此，選擇[M+H]+離子峰的精確質量數(shù)。同時建立包括名稱、保留時間、化學式、精確質量數(shù)及特征碎片離子等信息的一級和二級質譜掃描數(shù)據(jù)庫。84種除草劑的質譜參數(shù)信息見表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

除草劑多屬于中等極性和弱極性化合物，在弱極性的T3柱和C18柱上均具有較好的保留。試驗中比較Waters ACQUITY UPLC HSS- T3(2.1×50 mm，1.7 μm)和Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 × 150 mm，4.6 μm)，結果表明，ACQUITY UPLC HSS-T3柱對中等極性化合物的保留要優(yōu)于Agilent ZORBAX SB-C18柱。因此，選擇ACQUITY UPLC HSS-T3柱獲得更為優(yōu)異的分離效果。

流動相添加劑如甲酸銨和甲酸可顯著改善色譜峰的分離度與靈敏度。試驗中以甲醇-水和乙腈-水為流動相均不能得到良好的峰形，并對甲醇-水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、5 mmol/L甲酸銨的水溶液-5 mmol/L甲酸銨的甲醇溶液、5 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液-5 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸甲醇溶液的4種流動相進行比較。結果表明，使用5 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液-5 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸甲醇溶液84種類除草劑均獲得理想分離度和靈敏度。在確定的色譜-質譜條件下，84種除草劑混標(100 ng/mL)總離子流圖見圖1；獼猴桃樣品總離子流圖見圖2；甲草胺、銹去津、敵草凈、乙羧氟草醚的一級全掃描色譜圖見圖3。由圖3可知目標物響應強度高、無干擾、分離度高、峰形良好。

圖1 84種除草劑混標(100 ng/mL)總離子流圖Fig.1 The total ion chromatogram of 84 herbicide mixtures (100 ng/mL)

圖2 獼猴桃樣品總離子流圖Fig.2 The total ion chromatogram of kiwifruit samples

圖3 甲草胺、銹去津、敵草凈、乙羧氟草醚的色譜圖和質譜圖Fig.3 The chromatograms and mass spectra of alachlor,atrazine,desmetryn and fluoroglycofen-ethy

2.3 內標物的選擇

考慮到不同種類除草劑的化學差異較大，且苯氧羧酸類除草劑較其他種類除草劑更難以被提取和凈化，因此，本文以屬于苯氧羧酸類除草劑的氟吡禾靈和氟吡禾靈d4同位素內標作為重點考察對象。結果表明，氟吡禾靈d4同位素內標具有離子化效果好、酸性環(huán)境穩(wěn)定性好、定量誤差小等優(yōu)勢，并適用于84種除草劑內標法定量。

2.4 提取溶劑的選擇

QuEChERS法集提取、凈化為一體的前處理方法，可針對樣品基質情況選擇不同吸附劑類型及組合，具有凈化效果好、操作靈活、準確度高等優(yōu)勢，已經(jīng)成為多批次、高通量農(nóng)藥殘留檢測較為理想的前處理手段[11]。由于部分除草劑含有羧基基團，在溶液中呈酸性，使用1%乙酸乙腈為提取溶劑可形成穩(wěn)定的緩沖體系，提高了酸性農(nóng)藥的離子化效率，同時樣品基質的共萃取成分較乙腈少。因此，選擇1%乙酸乙腈為提取溶劑。

2.5 凈化條件的優(yōu)化

試驗中選擇基質復雜的空白菠菜樣品添加9種不同種類除草劑進行處理，提取液轉入預裝有4種不同組合的吸附劑(MgSO4、C18、PSA、GCB和MWCNTs)的2 mL微型具螺旋蓋離心管中，評價回收率結果。優(yōu)化的吸附劑組合操作步驟如下：1)MgSO4150 mg和C1825 mg；2)MgSO4150 mg和PSA 25 mg；3)MgSO4150 mg和GCB 25 mg；4)MgSO4150 mg和MWCNTs 25 mg。結果表明：1)、3)和4)均獲得滿意的結果，除去色素、脂類等雜質能力排序為：4)>3)>1)，同時也表明PSA的吸附劑不能用于該方法，易導致含羧基基團如氟吡禾靈等目標物的損失。最終考慮適合于廣泛基質樣品凈化的吸附劑組合為MgSO4150 mg，C1825 mg和MWCNTs 25 mg。圖4為4種吸附劑組合對菠菜樣品中9種類除草劑的吸附效果比較。

注：吸附劑組合1～4指：1)MgSO4 150 mg和C18 25 mg；2)MgSO4 150 mg和PSA 25 mg；3)MgSO4 150 mg和GCB 25 mg；4)MgSO4 150 mg和MWCNTs 25 mg。圖4 不同吸附劑組合對菠菜樣品(添加0.05 mg/kg 9種不同種類除草劑)的回收率結果Fig.4 The effect of clean-up on nine herbicides with different sorbents for spinach samples(spiked at 0.05 mg/kg for nine herbicides)

2.6 基質效應

果蔬中色素、有機酸和脂類等雜質易引起基質增強或基質抑制效應，有關研究表明基質種類、基質數(shù)量和目標物化學性質對基質效應有一定影響[15]?；|效應的評估常采用不同基質代表性樣品，如菠菜(高色素)和獼猴桃(高酸樣品)來制備基質匹配標準曲線。

按照以下公式計算基質效應：

ME(%)=(m基質-m溶劑)/m溶劑×100%

其中ME表示基質效應，m基質和m溶劑表示為基質和溶劑匹配標準曲線的斜率，當ME為-20%～20%、-50%～-20%或20%～50%、<-50%或>50%時，分別表示輕微、中等和較強的基質效應。結果表明，在菠菜和獼猴桃基質中84種除草劑的ME為-16%～14%，其基質效應輕微可以忽略[16]。結果表明，同位素內標法定量和優(yōu)化的吸附劑組合凈化，不僅保證較高的回收率，還將基質效應的影響降至最低，無需采用基質匹配標準工作曲線的方式進行補償，縮短了樣品的前處理時間。圖5為84種除草劑的基質效應結果。

圖5 84種除草劑的基質效應結果Fig.5 Matrix effects(ME)of multiple herbicides

3 方法學考察

3.1 線性范圍

通過內標法(氟吡禾靈-d4作為內標，濃度為50 ng/mL)配置5.0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL系列溶劑匹配標準工作溶液進行UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析，以濃度范圍(x，ng/L)對分析物與內標峰面積比(y)來構建標準曲線。結果表明，84種除草劑的相關系數(shù)(r2)均大于0.99，能滿足分析要求，如表2所示。

表2 84種除草劑殘留的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)和定量限、加標回收率及精密度實驗結果(n=6)Tab.2 Linear ranges,Linear equation,correlation coefficients,limits of quantitation,spiked recoveries and precisions of 84 herbicides (n=6)

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

3.2 樣品回收率和精密度

取2種果蔬的空白樣品(菠菜和獼猴桃)，分別添加84種類除草劑標準溶液，添加水平為0.01 mg/kg、0.05 mg/kg和0.1 mg/kg，每個水平重復6次試驗。結果表明，添加84種除草劑的樣品的平均回收率在68.2%～109.4%，之間，精密度RSD在2.1%～16.2%之間，結果見表2。

3.3 定量限

在歐盟(EU)No396/2005法規(guī)及最新修改單中[16]，果蔬中除草劑的最大允許殘留限量(MRL)低至0.01 mg/kg，本方法的定量限(LOQ)采用加標回收的方法進行驗證，菠菜和獼猴桃基質樣品的定量限均能達到0.01 mg/kg，滿足國內外限量法規(guī)對除草劑殘留限量的檢測要求。

3.4 實際樣品測定

按照建立的方法對實驗室日常檢測的50批果蔬樣品進行檢測，包括白菜、柑橘、獼猴桃、馬鈴薯、結球甘藍、甜椒、洋蔥、芹菜、菠菜、蘿卜及蘋果等樣品。其中大多數(shù)的果蔬樣品未檢出除草劑殘留，僅有2批蘋果樣品檢出莠去津殘留，濃度分別為0.05 mg/kg和 0.07 mg/kg。結果表明，本方法適用于果蔬中84種除草劑殘留的檢測。

4 結論

本研究建立了同位素內標QuEChERS結合超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜法快速檢測果蔬中84種除草劑的方法。優(yōu)化QuEChERS前處理步驟可實現(xiàn)84種除草劑的完全提取與凈化；方法的線性關系良好r2大于0.99；以菠菜和獼猴桃2種基質樣品添加3水平的回收率試驗，回收率在68.2%～109.4%之間，相對標準偏差在2.1%～16.2%之間；大多數(shù)除草劑的定量限低至0.01 mg/kg，滿足國內外農(nóng)藥殘留限量法規(guī)需求。該方法實現(xiàn)果蔬中84種常見除草劑的分析檢測，具有靈敏度高、穩(wěn)健性好、專一性強、準確度高的優(yōu)勢，為日常除草劑殘留監(jiān)控檢測提供實用的技術手段。