王偉霞,李舒格,張之麒 ,陳金日,吳少杰，李福后

(江蘇海洋大學(xué) a.江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實驗室；b.江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室；c.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005)

三苯甲烷類染料是一類芳香族異源化合物，具有色譜范圍廣、著色力高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于紡織、印染、醫(yī)藥等行業(yè)[1-2]。該類染料以三苯甲烷為母體，結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，生物可降解性低，并且對動物細(xì)胞具有毒性，可產(chǎn)生致癌、致畸、致突變等作用[3-7]?？兹甘G屬于三苯甲烷類染料，除了作為染料外，曾經(jīng)廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，對環(huán)境和人類健康造成極大危害[8-10]。

目前，主要通過傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法來進(jìn)行染料處理，如吸附、沉淀、光解、氧化還原反應(yīng)、電化學(xué)處理等。然而，這些傳統(tǒng)方法成本非常昂貴且可能帶來二次污染[11-12]。作為傳統(tǒng)物理化學(xué)方法的替代，生物降解具有成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，正在成為一種有效的、可持續(xù)的處理方法。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種微生物對三苯甲烷類染料具有脫色和降解能力，包括細(xì)菌、白腐真菌、放線菌和藻類等[13]。生物降解的研究主要集中于染料的脫色還原過程，如孔雀石綠和結(jié)晶紫被轉(zhuǎn)化為無色衍生物的機(jī)制等[14]。

白腐真菌具有較強(qiáng)的染料脫色和降解能力，這得益于它們能夠產(chǎn)生一系列的降解相關(guān)酶類，包括漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和細(xì)胞色素P450單加氧酶等[15-17]。漆酶是一類含銅的多酚氧化酶，具有廣泛的底物特異性，其不僅能夠利用氧作為電子受體來氧化木質(zhì)素，還能夠氧化多種芳香族化合物[15]。木質(zhì)素過氧化物酶作為一種含血紅素輔基的氧化還原酶，通過自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，實現(xiàn)染料的脫色和降解過程[16]。在土生真菌綺麗小克銀漢霉(Cunninghamellaelegans)中，細(xì)胞色素P450單加氧酶系統(tǒng)通過介導(dǎo)還原和N-脫甲基反應(yīng)，實現(xiàn)孔雀石綠的生物轉(zhuǎn)化[17]。

工業(yè)染料廢水成分復(fù)雜，處理成本高。而將白腐真菌用于工業(yè)廢水處理具有明顯的優(yōu)勢，它們的菌絲體可以固定化，實現(xiàn)體系的連續(xù)循環(huán)處理，另外，處理后的菌絲體也方便回收，避免二次污染?；?Pholiotanameko)屬球蓋菇科鱗傘屬，作為一種白腐真菌，它可以引起木材腐朽等[18]。對于滑菇的研究，多數(shù)學(xué)者關(guān)注的是栽培技術(shù)的開發(fā)和多糖的利用等，而在染料脫色和降解方面的研究尚不多見[19-20]。本文以孔雀石綠、結(jié)晶紫、堿性品紅等三苯甲烷類染料為底物，首先檢測了滑菇菌絲體在含染料PDA培養(yǎng)基上的生長能力，然后研究了滑菇菌絲體在液體條件下對3種染料的脫色能力，同時，監(jiān)測其產(chǎn)生漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶以及錳過氧化物酶的能力。該研究可為滑菇的工業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株 滑菇菌株SP02，保存于江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院農(nóng)業(yè)資源開發(fā)與農(nóng)產(chǎn)品加工實驗室。

1.1.2 試劑 ① 孔雀石綠、結(jié)晶紫、堿性品紅、2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、黎蘆醇等均為國產(chǎn)分析純，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。② 染料母液：稱取50 mg染料(孔雀石綠、結(jié)晶紫、堿性品紅)，溶于10 mL去離子水，配置成5 g/L母液。

1.1.3 培養(yǎng)基 ① 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。② 馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB培養(yǎng)基)：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH自然。③ 含染料PDA培養(yǎng)基：取500 mL滅菌后的PDA培養(yǎng)基，加熱融化，待冷卻至50 ℃左右時，分別加入5 mL不同類型的染料母液，混合均勻后倒至平板，制成含50 mg/L染料的PDA培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 滑菇菌種活化 無菌操作條件下，從保藏的滑菇斜面菌種中挑取一小塊直徑約5 mm的菌塊，接種于PDA平板培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)8 d，備用。

1.2.2 滑菇在含染料PDA培養(yǎng)基上的生長試驗 利用打孔器，從活化的PDA平板菌落近邊緣處選取菌種塊(直徑5 mm)，分別接種于含有不同染料的PDA培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)，并觀察拍照，測量菌落直徑。以不含染料的PDA培養(yǎng)基作為對照。

1.2.3 滑菇對染料的脫色試驗 從活化的PDA平板菌落近邊緣處選取菌種塊(直徑5 mm)，接種于含有100 mL PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，每瓶接種5塊。25 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，此為種子液。取12.5 mL種子液，接種于含有250 mL PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，接種量為5%。25 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，此為菌絲體發(fā)酵液。

在滑菇菌絲體對染料的脫色試驗中，首先取培養(yǎng)7 d的20 mL菌絲體發(fā)酵液，然后分別加入80 mL含有1 mg不同染料(孔雀石綠、結(jié)晶紫、堿性品紅)的蒸餾水，使染料的終質(zhì)量濃度均為10 mg/L。脫色試驗的體系為100 mL，將脫色體系置于恒溫?fù)u床，25 ℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)，檢測滑菇24 h的脫色能力。

1.2.4 滑菇的連續(xù)脫色試驗 以孔雀石綠為滑菇的連續(xù)脫色對象。取培養(yǎng)7 d的20 mL菌絲體發(fā)酵液，加入80 mL含有1 mg孔雀石綠的蒸餾水，使孔雀石綠終質(zhì)量濃度為10 mg/L。連續(xù)脫色試驗的體系為100 mL，將脫色體系置于恒溫?fù)u床，25 ℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔24 h，添加10 mg/L孔雀石綠，連續(xù)添加3次，檢測滑菇的連續(xù)脫色能力。

1.2.5 脫色率測定 從上述脫色體系中，取1 mL菌絲體染料混合液，12 000 r/min離心5 min，保留上清液。取上清液300 μL于96孔板中，利用酶標(biāo)儀，掃描其在300～800 nm范圍內(nèi)的吸光度值(OD)。

孔雀石綠、結(jié)晶紫、堿性品紅的最大吸收波長分別為615，584和542 nm[21]。在最大吸收波長處，測定上清液的OD值；At為染料脫色t時刻的OD值，A0為染料脫色零時刻的OD值，脫色率DR=(A0-At)/A0×100%。

1.2.6 滑菇漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶的活力測定 取25 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d的菌絲體發(fā)酵液，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，上清液即為粗酶液。

漆酶酶活測定：1 mL反應(yīng)體系中，含10 mmol/L ABTS 100 μL，50 mmol/L乙酸緩沖液(pH 5.0)880 μL，粗酶液 20 μL。反應(yīng)溫度為25 ℃，3 min后在420 nm處測定OD值[22]。420 nm處ABTS氧化產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)(ε420 nm)為36 000 L/(mol·cm)，以每min內(nèi)1 μmol ABTS被氧化所需的酶量為1個酶活單位(U)。

木質(zhì)素過氧化物酶酶活測定：1 mL反應(yīng)體系中，含20 mmol/L藜蘆醇 100 μL，50 mmol/L酒石酸緩沖液(pH 3.5)870 μL，粗酶液 20 μL，10 mmol/L H2O2溶液10 μL。反應(yīng)溫度為25 ℃，3 min后在310 nm處測定OD值[22]。310 nm處藜蘆醛的摩爾消光系數(shù)(ε310 nm)為9 300 L/(mol·cm)，以每min內(nèi)1 μmol藜蘆醇被氧化所需的酶量為1個酶活單位(U)。

錳過氧化物酶酶活測定：1 mL反應(yīng)體系中，含8 mmol/L 愈創(chuàng)木酚 50 μL，50 mmol/L乳酸鈉緩沖液(pH 4.5)870 μL，10 mmol/L MnSO450 μL，粗酶液 20 μL，10 mmol/L H2O2溶液10 μL。反應(yīng)溫度為25 ℃，3 min后在465 nm處測定OD值[23]。465 nm處四鄰甲氧基連酚的摩爾消光系數(shù)(ε465nm)為26 600 L/(mol·cm)，以每min內(nèi)1 μmol愈創(chuàng)木酚被轉(zhuǎn)化所需的酶量為1個酶活單位(U)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 各組實驗數(shù)據(jù)重復(fù)3次，利用SPSS 26 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，利用Excel 2021進(jìn)行圖譜繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 滑菇在含染料PDA培養(yǎng)基上的生長結(jié)果

由圖1可知，滑菇菌絲體在不同培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)不同。在PDA培養(yǎng)基上(對照組)，菌絲體生長旺盛，菌絲較稠密，一般于14 d即可長滿整個平板(90 mm)。在含有孔雀石綠和結(jié)晶紫的培養(yǎng)基上，菌絲體生長較緩慢，表明孔雀石綠和結(jié)晶紫具有較強(qiáng)的殺真菌能力。50 mg/L的孔雀石綠和結(jié)晶紫能夠抑制菌絲的生長，培養(yǎng)14 d時，菌落直徑一般為45～50 mm，且菌絲稠密。與孔雀石綠和結(jié)晶紫相比，品紅對滑菇菌絲體的生長抑制能力較弱，培養(yǎng)14 d時，菌落直徑一般為80～85 mm，且菌絲較稀疏。

圖1 滑菇SP02在含染料PDA培養(yǎng)基上的生長結(jié)果

2.2 滑菇對染料的脫色試驗結(jié)果

孔雀石綠在615 nm和425 nm處有兩個特征吸收峰，經(jīng)過24 h 的脫色，這兩個吸收峰基本消失(如圖2a所示)。結(jié)晶紫和堿性品紅的最大吸收波長分別為584 nm和542 nm，經(jīng)過24 h 的脫色，300～800 nm范圍內(nèi)的吸收峰也基本消失(如圖2b和圖2c所示)?；骄闟P02對孔雀石綠、結(jié)晶紫和堿性品紅等染料具有較強(qiáng)的脫色能力，24 h 脫色率分別達(dá)到92.9%，89.6%和83.9%(如圖2d所示)。

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2.3 滑菇的連續(xù)脫色試驗結(jié)果

以孔雀石綠為滑菇的連續(xù)脫色對象，在100 mL脫色體系中每隔24 h添加10 mg/L孔雀石綠，連續(xù)添加3次，檢測滑菇的脫色能力。由圖3可知，滑菇菌株SP02能夠很好地對孔雀石綠進(jìn)行連續(xù)脫色，具有良好的生產(chǎn)應(yīng)用價值。

圖3 滑菇SP02的連續(xù)脫色試驗結(jié)果

白腐真菌主要通過生物吸附和生物降解兩個過程對染料進(jìn)行色度脫除。生物吸附主要通過菌絲體與染料相互作用所致，而生物降解主要涉及3種木質(zhì)素降解酶系，包括漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶等[24]。滑菇菌株SP02能夠?qū)兹甘G進(jìn)行連續(xù)脫色，表明生物降解作用可能在染料脫色過程中起重要作用。

2.4 滑菇漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶的活力分析

白腐真菌主要通過分泌漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶等來氧化芳烴類化合物，使芳烴類化合物開環(huán)并實現(xiàn)完全降解[25]。測定了滑菇菌株SP02培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液中3種木質(zhì)素降解酶的活力，結(jié)果見圖4。在培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液中，漆酶的活力最高，為224 U/mL；其次為木質(zhì)素過氧化物酶，為58 U/mL；錳過氧化物酶的活力最低，只有6 U/mL。在滑菇脫色體系中，推測漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶起協(xié)同作用，共同促進(jìn)孔雀石綠的降解。Kang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在血紅密孔菌IUM0032(Pycnoporuscoccineus)降解孔雀石綠的過程中，木質(zhì)素過氧化物酶在降解初期起著關(guān)鍵作用，而漆酶進(jìn)一步促進(jìn)了孔雀石綠的降解。

圖4 滑菇SP02漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶的活力分析

3 討論與結(jié)論

利用白腐真菌進(jìn)行染料的脫色具有明顯的優(yōu)勢，通過菌絲體與染料大分子相互作用，以及菌絲體分泌的木質(zhì)素降解酶系，不僅可以實現(xiàn)生物吸附，且能夠?qū)崿F(xiàn)良好的生物降解[24]。據(jù)報道，黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus)、落葉松附毛孔菌(Trichaptumlaricinum)、裂褶菌(Schizophyllumcommune)等具有較強(qiáng)的染料脫色能力[26-29]。以黃孢原毛平革菌為例，該菌能夠降解多種染料類型，包括三苯甲烷類、偶氮、蒽醌等[30]。韓啟燦等[28]發(fā)現(xiàn)，落葉松附毛孔菌對孔雀石綠有較強(qiáng)的脫色作用，在適宜條件下脫色1 h，脫色率可達(dá)92.6%。裂褶菌cfcc7252在好氧和厭氧條件下均能高效降解孔雀石綠，48 h內(nèi)降解率可達(dá)98%以上[29]。滑菇菌株SP02 對孔雀石綠也有較強(qiáng)的脫色和降解能力，24 h內(nèi)其脫色率為92.9%。不同的菌株類型對孔雀石綠等染料的降解和脫色能力略有差異，這可能與菌株的培養(yǎng)條件、產(chǎn)降解酶水平密切相關(guān)。

漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶是參與染料降解的主要作用酶類，優(yōu)化產(chǎn)酶條件，提高酶的產(chǎn)量并進(jìn)行大規(guī)模推廣應(yīng)用是研究的重點(diǎn)方向之一。尚曉靜等[25]發(fā)現(xiàn)，裂褶菌菌株G18的漆酶在液體培養(yǎng)的第6天達(dá)到峰值，為1 830 U/mL，而木質(zhì)素過氧化物酶在第2天即達(dá)到峰值。在毛木耳菌株AC5培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液中，漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶的活性分別為321 U/mL和121 U/mL，此時菌株對染料的降解率最高[31]?；骄闟P02能夠分泌漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶等，在發(fā)酵培養(yǎng)7 d時，酶活性分別為224 U/mL和58 U/mL。與上述裂褶菌和毛木耳菌株相比，滑菇菌株SP02的產(chǎn)降解酶水平較低，這可能與菌種類型、培養(yǎng)條件等相關(guān)，需要進(jìn)一步優(yōu)化產(chǎn)酶條件，提高酶的表達(dá)水平。

劉曉雪等[32]以平菇680為研究材料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)條件，結(jié)果表明響應(yīng)面設(shè)計對于優(yōu)化液體培養(yǎng)基組成以提高漆酶活性切實可行。利用基因工程手段，克隆表達(dá)白腐真菌漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶基因，以提高酶的表達(dá)量并改善酶學(xué)性質(zhì)，將進(jìn)一步推動木質(zhì)素降解酶類的工業(yè)化應(yīng)用[33-34]。

本研究以孔雀石綠、結(jié)晶紫、堿性品紅為底物，發(fā)現(xiàn)滑菇菌株SP02能夠有效降解這3種三苯甲烷類染料，同時，菌株SP02能夠?qū)兹甘G進(jìn)行連續(xù)脫色，表明該菌具有良好的生產(chǎn)應(yīng)用前景。白腐真菌在降解染料過程中易受到溫度、pH、金屬離子等多種環(huán)境因素的影響，需要進(jìn)一步評估這些影響因素并優(yōu)化其脫色工藝，以期推動生物脫色的理論創(chuàng)新和實際應(yīng)用。