林書華，汪林蘭，羅 攀，張 斌，吳曉玉

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 江西農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實(shí)驗(yàn)室江西省果蔬采后處理關(guān)鍵技術(shù)及質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心 南昌 330045）

柑橘果肉組織柔嫩多汁且富含糖分，在貯藏和運(yùn)輸過(guò)程中果皮易受損而被病原菌侵染，引發(fā)采后柑橘病害。其中，柑橘綠霉病是引起柑橘果實(shí)腐敗的主要病害之一，其致病菌為指狀青霉（Penicillium digitatum）。目前，我國(guó)預(yù)防柑橘采后病害主要采用化學(xué)殺菌劑，如：鄰苯基苯酚鈉、噻苯咪唑、嘧霉胺等[1]。化學(xué)殺菌劑具有高效、廣譜和使用方便等優(yōu)勢(shì)，然而，其安全性問(wèn)題備受社會(huì)關(guān)注[2]。因微生物殺菌劑具有高效、低毒、無(wú)殘留等特點(diǎn)，故眾多學(xué)者正積極尋找能替代化學(xué)殺菌劑的采后柑橘生物防腐劑。

Liu 等[3]發(fā)現(xiàn)白色鏈霉菌（Streptomyces albμLus）發(fā)酵產(chǎn)物ε-聚賴氨酸（ε-PL）對(duì)指狀青霉具有顯著抑制效果，經(jīng)質(zhì)量濃度為200 mg/L 的ε-PL 處理后，對(duì)指狀青霉細(xì)胞膜有損傷作用，破壞膜結(jié)構(gòu)并誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化，從而降低綠霉病的發(fā)病率。Liu 等[4]從檸檬克勒克酵母（Kloeckera apiculata）34-9 中分離的2-苯基乙醇 （PEA），通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)苯丙氨酸-tRNA 合成酶的活性位點(diǎn)來(lái)控制柑橘青霉病發(fā)生。Ouyang 等[5]用質(zhì)量濃度為1.78 mg/mL 的植物精油——檸檬醛處理，導(dǎo)致指狀青霉細(xì)胞膜的一系列變化，包括麥角固醇含量減少以及大量羊毛甾醇積累，抑制麥焦固醇合成基因ERG7，ERG11，ERG6，ERG3，ERG5 的表達(dá)。Xin等[6]從直立白薇（Cynanchum atratum Bunge）中分離出生物堿安托芬。安托芬通過(guò)破壞指狀青霉細(xì)胞完整性，干擾能量代謝系統(tǒng)來(lái)抑制柑橘綠霉病菌。

本課題組從柑橘根系土壤中分離篩選到1 株柑橘綠霉病的拮抗菌，經(jīng)鑒定，命名為淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）X33。前期研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)酵液提取物對(duì)柑橘意大利青霉、白地霉、指狀青霉等病原菌等均有良好殺菌效果，且無(wú)毒、極性強(qiáng)，易溶于水[7]。在隨后的結(jié)構(gòu)解析中發(fā)現(xiàn)提取物的活性成分為低聚賴氨酸類化合物[8]。本研究以指狀青霉為研究對(duì)象，分析菌株X33 發(fā)酵提取物（Extract of fermentation broth from Streptomyces lavendulae X33，SLFE）對(duì)指狀青霉的抑制作用，為SLFE 作為柑橘采后防腐劑的研究開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 提取發(fā)酵液的菌株X33：淡紫灰鏈霉菌X33（Streptomyces lavendulae X33）。

采后柑橘綠霉病菌Pd165：指狀青霉Pd165（Penicillium digitatum Pd165）。

以上菌株均由江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)利用工程實(shí)驗(yàn)室分離、提供。

1.1.2 主要試劑、培養(yǎng)基 主要試劑：氯金酸、檸檬酸三鈉、乙醇、濃硫酸、乙酸鉛等試劑均為分析純級(jí)，BCA 含量測(cè)試盒、丙酮酸試劑盒，南京建成生物工程研究所；基因組DNA 提取試劑盒，康為世紀(jì)公司。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉20，牛肉膏3，魚粉蛋白胨10，NH4Cl 0.6，NaCl 10，CaCO30.02，初始pH 7.0。

PDA 培養(yǎng)基（g/L）：土豆200，葡萄糖20，瓊脂20，自然pH。

PDB 培養(yǎng)基：不含瓊脂的PDA 培養(yǎng)基。

1.1.3 主要儀器及設(shè)備 Quanta 250 掃描電子顯微鏡，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；SCIENTists-10N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；NanoDrop one 超微量分光光度計(jì)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Eclipse Ti-S 倒置熒光顯微鏡，日本尼康儀器有限公司；DXR 激光共聚焦顯微拉曼光譜儀，美國(guó)Thermo Scientificic 公司；T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SLFE 的提取與配制 基于課題組前期的提取方法，略有改進(jìn)[9]。將菌株X33 接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)96 h，離心、收集上清液；利用D101 大孔樹脂柱洗脫上清液，經(jīng)薄層檢測(cè)和抑菌活性追蹤后，收集抑菌活性物質(zhì)粗提液；粗提液再經(jīng)C18 柱層析，純水洗脫，將有抑菌活性的精提液冷凍干燥，獲得粉末狀物質(zhì)為淡紫灰鏈霉菌X33 發(fā)酵液提取物 （SLFE），SLFE 稱量后溶于無(wú)菌水，保存于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 病菌Pd165 孢子懸液制備 用生理鹽水將28 ℃培養(yǎng)5 d 的病菌Pd165 孢子洗入三角瓶，8 層無(wú)菌紗布過(guò)濾，除去菌絲，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子懸液濃度為107個(gè)/mL。

1.2.3 SLFE 處理對(duì)病菌Pd165 生長(zhǎng)的檢測(cè)

1） 對(duì)病菌Pd165 菌絲干重的影響 將1 mL菌株P(guān)d165 孢子懸液接入50 mL PDB 培養(yǎng)液，28℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（48 h），加入不同濃度的SLFE，以加等量無(wú)菌水為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)96 h，過(guò)濾，收集菌絲體，干燥至恒重后稱重。

2） 對(duì)病菌Pd165 產(chǎn)孢量的影響 參考曾志紅等[10]的方法。取200 μL 菌株P(guān)d165 孢子懸液，分別均勻涂布于含質(zhì)量濃度1.2，2.4，4.8 mg/mL的SLFE 的PDA 平板上，對(duì)照組涂布等量無(wú)菌水。置于28 ℃，培養(yǎng)5 d 后，0.85%生理鹽水將斜面孢子洗入三角瓶，8 層紗布過(guò)濾，制成孢子懸液，用血球計(jì)數(shù)板分別計(jì)算對(duì)照組（A1）、處理組（A2）的孢子數(shù)量，單位：個(gè)/mL。

1.2.4 SLFE 處理對(duì)菌株P(guān)d165 菌絲體形態(tài)的觀察 參考Ju 等[11]方法并略作修改。取200 μL 菌株P(guān)d165 孢子懸液均勻涂布在SLFE 質(zhì)量濃度為4.8 mg/mL 的PDA 平板上，對(duì)照組加入等量無(wú)菌水，取滅菌蓋玻片45°傾斜插入平板，28 ℃培養(yǎng)，待菌絲爬片長(zhǎng)滿蓋玻片時(shí)取出。將蓋玻片置于2.5%的戊二醛溶液中，4 ℃避光固定12 h；磷酸緩沖液（0.1 mol/L pH 7）漂洗3 次，每次10 min；進(jìn)行梯度脫水，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%，每個(gè)體積分?jǐn)?shù)處理6 min。

最后將處理好的蓋玻片置于冷凍干燥機(jī)中干燥，噴金后掃描電子顯微鏡觀察。

1.2.5 SLFE 處理對(duì)菌株P(guān)d165 菌絲細(xì)胞完整性的觀察 采用FDA-PI 雙色熒光法檢測(cè)指狀青霉細(xì)胞完整性[12]。在PDA 培養(yǎng)基中加入4.8 mg/mL的SLFE、插片培養(yǎng)指狀青霉（方法同1.2.4 節(jié)）。選取已長(zhǎng)滿病原菌的蓋玻片，加入二乙酸熒光素（FDA）2.5 μmol/L，避光反應(yīng)10 min，再加入10 μL 0.5 μmol/L 碘化丙啶（PI），避光反應(yīng)10 min。將其置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）在抑菌過(guò)程中的應(yīng)用

1.2.6.1 SERS 基底的制備 在250 mL 的燒杯中加入0.01%氯金酸溶液100 mL，超聲混勻，將其置于預(yù)熱好的電爐上加熱至沸騰。迅速加入0.7 mL 1%檸檬酸三鈉溶液，待其顏色變成紅棕色后，繼續(xù)加熱8 min，冷卻至室溫，避光保存?zhèn)溆肹13]。

1.2.6.2 SERS 對(duì)細(xì)胞外漏物質(zhì)的檢測(cè) 采用1.2.3 節(jié)的方法培養(yǎng)菌絲體，通過(guò)真空抽濾收集約1 g 2日齡的菌絲體，并重懸于20 mL 0.85%的生理鹽水中，4 ℃冷藏使菌絲饑餓24 h。分別加入質(zhì)量濃度1.2，2.4，4.8 mg/mL 的SLFE，對(duì)照組（CK）加入等量無(wú)菌水。SLFE 與CK 分別處理120 min 后，取1 mL 懸浮液轉(zhuǎn)移至EP 管中，并在12 000 r/min 冷凍離心5 min，收集上清液。將100 μL 上清液滴入含有400 μL 的膠體Au 納米顆粒中，并充分混合，置于共聚焦顯微拉曼光譜儀檢測(cè)[14]。

1.2.7 SLFE 處理對(duì)菌株P(guān)d165 菌絲內(nèi)容物的測(cè)定 采用1.2.3 節(jié)的方法，分別取對(duì)照組和處理組的菌絲各0.5 g，置于含pH 7.0 PBS 2 mL 的研缽中，加入適量石英砂，冰浴研磨成勻漿，4 ℃，10 000 r/min 冷凍離心20 min，取上清液，用于測(cè)定可溶性蛋白、還原糖和丙酮酸的含量。

分別采用蒽酮比色法[15]，二辛可寧酸法（Bicinchoninic acid method，BCA）法[16]和硫代巴比妥酸法[17]測(cè)定上述上清液中還原糖、可溶性蛋白和丙酮酸的含量。

1.2.8 SLFE 處理對(duì)與菌株P(guān)d165 遺傳物質(zhì)的影響

1.2.8.1 熒光光譜法檢測(cè)SLFE 對(duì)指狀青霉DNA含量的影響 采用康為世紀(jì)基因組DNA 提取試劑盒提取病菌Pd165 DNA。采用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)提取DNA 的純度和濃度。用0.01 mol/L Tris-HCl（pH 7.2）將真菌基因組DNA 稀釋至60 μg/mL。將不同質(zhì)量濃度的SLFE（0，1.2，2.4，4.8 mg/mL）加入到相同體積（60 μg/mL）的DNA 溶液中，黑暗處理1 h。采用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm 下，測(cè)量混合物從360～500 nm 波長(zhǎng)下的熒光光譜[18]。

1.2.8.2 SLFE 對(duì)細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)基因表達(dá)的影響根據(jù)有關(guān)絲狀真菌細(xì)胞應(yīng)答基因的報(bào)道[19-21]，本研究選擇并設(shè)計(jì)4 對(duì)熒光定量PCR 引物（表1）。提取處理組 （1.2 mg/mL） 和對(duì)照組菌絲體總RNA，經(jīng)完整性檢測(cè)合格后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進(jìn)行熒光定量PCR 試驗(yàn)。20 μL 反應(yīng)體系：2×T5 Fast qPCR 預(yù)混液10 μL、PCR 正向引物0.8 μL、PCR反向引物0.8 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 7.4 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，40 個(gè)循環(huán)；采用2-ΔΔCt法以actin 作為內(nèi)參來(lái)量化每個(gè)樣本的值。

表1 熒光定量PCR 基因擴(kuò)增的引物序列Table 1 Primer sequences for gene amplification by fluorescence quantitative PCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)設(shè)置3 組重復(fù)，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用Origin 9.0 作圖，DPS 7.05 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SLFE 對(duì)菌株P(guān)d165 菌絲干重與產(chǎn)孢量的影響

指狀青霉菌絲的生長(zhǎng)受到SLFE 顯著抑制（圖1）。不同質(zhì)量濃度SLFE 處理組的菌絲干重均顯著低于對(duì)照組 （菌絲干重3.82 mg/mL）；隨著SLEF 質(zhì)量濃度增大，對(duì)指狀青霉抑制作用增強(qiáng)；當(dāng)SLFE 的質(zhì)量濃度達(dá)到4.8 mg/mL 時(shí)，菌絲干重（2.13 mg/mL）較對(duì)照組（CK）降低1.69 mg/mL，降低了44.24%。

圖1 SLFE 對(duì)指狀青霉菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of SLFE on mycelial growth of P.digitatum

SLFE 處理菌株P(guān)d165 后，其產(chǎn)孢量明顯降低（表2）。與對(duì)照組（CK）相比，質(zhì)量濃度為1.2，2.4，4.8 mg/mL 的SLFE 處理組產(chǎn)孢量分別為2.09×108，1.27×108，9.4×107個(gè)/mL，產(chǎn)孢抑制率分別為94.9%，97.0%，97.8%；各處理組產(chǎn)孢量均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；且SLFE 濃度越高，對(duì)指狀青霉產(chǎn)孢能力的抑制更強(qiáng)。

表2 SLFE 對(duì)指狀青霉產(chǎn)孢量的影響Table 2 Effect of SLFE on sporulation quantity of P.digitatum

上述結(jié)果表明：SLFE 對(duì)指狀青霉的菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢能力具有較好的抑制效果。

2.2 SLFE 對(duì)菌株P(guān)d165 菌絲和孢子形態(tài)的影響

從圖2可知，經(jīng)SLFE 處理后的菌株P(guān)d165形態(tài)發(fā)生明顯改變。對(duì)照組的分生孢子為球形，形態(tài)規(guī)則且飽滿（圖2a），而處理組的分生孢子變形為不規(guī)則的橢圓，且孢子表面出現(xiàn)凹陷、皺縮（圖2b）；對(duì)照組的菌絲形態(tài)飽滿、生長(zhǎng)旺盛（圖2c），而處理組菌絲細(xì)、干癟，并發(fā)生折疊（圖2d）。

圖2 SLFE 對(duì)指狀青霉分生孢子和菌絲形態(tài)的影響Fig.2 Effect of SLFE on morphology of the conidia and hyphae of P.digitatum

2.3 SLFE 對(duì)菌株P(guān)d165 菌絲細(xì)胞完整性的影響

為探明SLFE 對(duì)指狀青霉菌絲體細(xì)胞活性狀態(tài)的影響，使用FDA-PI 雙染色法對(duì)菌株P(guān)d165菌絲體染色。當(dāng)細(xì)胞膜完整時(shí)，PI 無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞著色，F(xiàn)DA 在胞內(nèi)酯酶作用下形成熒光素，使完整細(xì)胞發(fā)出綠色熒光；當(dāng)細(xì)胞膜受損時(shí)，F(xiàn)DA 形成的熒光素?zé)o法在細(xì)胞內(nèi)積聚，無(wú)法發(fā)出綠色熒光，而PI可進(jìn)入細(xì)胞，與胞內(nèi)核酸物質(zhì)作用生成紅色熒光物，因而受損細(xì)胞呈紅色熒光。將染色后的菌絲體置于熒光顯微鏡下觀察。對(duì)照組菌絲體經(jīng)染色后細(xì)胞顯現(xiàn)綠色熒光（圖3a），僅有微弱的紅色熒光（圖3c），而SLFE 處理組菌絲細(xì)胞大部分呈紅色熒光（圖3d），少數(shù)為綠色熒光（圖3b）。結(jié)果表明：菌株P(guān)d165 菌絲體經(jīng)SLFE 處理后，細(xì)胞膜的完整性受到破壞。

圖3 熒光顯微鏡觀察指狀青霉菌絲細(xì)胞膜的完整性Fig.3 Observation of the integrity of pathogenic P.digitatum membrane by laser confocal microscope

2.4 SLFE 對(duì)病菌Pd165 菌絲細(xì)胞物質(zhì)外漏的影響

利用拉曼光譜進(jìn)一步研究了SLFE 對(duì)病菌Pd165 菌絲細(xì)胞物質(zhì)外泄的影響。與對(duì)照組相比，SLFE 處理后的菌株P(guān)d165 胞外液在400～1 800 cm-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)出顯著的特征峰變化（圖4）。其中，最明顯的特征峰1 330 cm-1（核酸特征峰）[22]、1 129 cm-1（脂肪酸特征峰）[23]、1 570 cm-1（蛋白質(zhì)酰胺II 特征峰）[24]在經(jīng)不同濃度的SLFE 處理后，較對(duì)照組的峰值明顯增強(qiáng)，且隨SLFE 質(zhì)量濃度增加，特征峰峰值增大。表明與對(duì)照組相比，SLFE 處理后胞外液中脂肪酸、蛋白質(zhì)及核酸等大分子物質(zhì)含量增加，推測(cè)可能是由于菌絲細(xì)胞膜受損，引發(fā)胞內(nèi)大分子物質(zhì)外泄。

圖4 不同質(zhì)量濃度SLFE 處理指狀青霉的SERSFig.4 SERS spectra of P.digitatum treated with different concentrations of SLFE

2.5 SLFE 對(duì)菌株P(guān)d165 菌絲內(nèi)容物的影響

2.5.1 對(duì)病菌Pd165 菌絲還原糖含量的影響 病菌Pd165 經(jīng)質(zhì)量濃度1.2，2.4，4.8 mg/mL 的SLFE處理后，病菌菌絲體內(nèi)還原糖含量分別為0.53%，0.39%，0.10%，均顯著低于對(duì)照組（0.87%，圖5a）；且SLFE 質(zhì)量濃度越高，菌絲還原糖含量越低；當(dāng)SLFE 質(zhì)量濃度為4.8 mg/mL 時(shí)，處理組菌絲總糖較對(duì)照組下降了81.13%。

2.5.2 對(duì)病菌Pd165 可溶性蛋白含量的影響 病菌Pd165 經(jīng)不同濃度SLFE 處理后，各濃度處理組（1.2，2.4，4.8 mg/mL SLFE）菌絲可溶性蛋白含量分別為0.09，0.07，0.04 mg/g（圖5b），較對(duì)照組（0.12 mg/g） 含量分別降低25.00%，41.67%，66.67%。SLFE 處理后菌株P(guān)d165 菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量顯著減少，SLFE 質(zhì)量濃度越高，可溶性蛋白含量下降越顯著。

2.5.3 對(duì)病菌Pd165 菌絲丙酮酸含量的影響 病菌Pd165 菌絲體內(nèi)丙酮酸含量隨著SLFE 處理濃度的升高呈下降趨勢(shì)（圖5c）。對(duì)照組菌絲體丙酮酸含量為2.74 mg/g，而經(jīng)4.8 mg/mL 的SLFE 處理后，菌絲體內(nèi)丙酮酸含量為1.61 mg/g，含量降低率達(dá)到41.41%。

圖5 SLFE 對(duì)指狀青霉菌絲內(nèi)容物的影響Fig.5 Effect of SLFE on mycelial ingredients of P.digitatum

2.6 SLFE 對(duì)菌株P(guān)d165 遺傳物質(zhì)的影響

2.6.1 對(duì)病菌Pd165 基因組DNA 的影響 采用熒光光譜技術(shù)分析SLFE 與DNA 的體外結(jié)合情況[25]。與對(duì)照組相比，隨著SLFE 質(zhì)量濃度的增加，各處理組中均表現(xiàn)出明顯的熒光猝滅 （圖6），表明SLFE 可與DNA 結(jié)合，導(dǎo)致DNA 的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象發(fā)生變化。

圖6 SLFE 對(duì)指狀青霉基因組DNA 的影響Fig.6 Effect of SLFE treatment on genetic DNA of P.digitatum

2.6.2 對(duì)細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)基因表達(dá)的影響 選取與細(xì)胞壁生物合成、能量代謝、氧化應(yīng)激與產(chǎn)孢等有關(guān)的4 個(gè)基因：cej60377.1 （編碼幾丁質(zhì)酶——CHI）、oko99898.1 （編碼?；o酶A 脫氫酶——ACAD）、crl18986.1（編碼過(guò)氧化物酶——POD）和kzn90160.1（編碼BRLA），熒光定量PCR測(cè)定其基因表達(dá)量，結(jié)果見表3。經(jīng)1.2 mg/mL SLFE 處理后，4 個(gè)基因的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組。

表3 SLFE 對(duì)指狀青霉細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)基因表達(dá)的影響Table 3 Effects of SLFE on the expression of response-related genes in P.digitatum

3 討論

與化學(xué)殺菌劑相比，SLFE 具有易溶于水、無(wú)毒、廣譜、抗菌性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。正常條件下，菌株P(guān)d165 在PDB、PDA 培養(yǎng)基中可快速生長(zhǎng)、產(chǎn)孢，而經(jīng)SLFE 處理后，菌株P(guān)d165 菌絲生長(zhǎng)量和產(chǎn)孢量明顯減少，且菌絲體和孢子形態(tài)被嚴(yán)重破壞，菌絲細(xì)而干癟，并發(fā)生折疊，分生孢子變形為不規(guī)則的橢圓，且孢子表面出現(xiàn)凹陷、皺縮。1.2 mg/mL的SLFE 對(duì)病菌Pd165 產(chǎn)孢抑制率高達(dá)94.86%，且SLFE 的抑菌效果呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。

為深入探討SLFE 對(duì)菌株P(guān)d165 的抑制機(jī)制，本研究使用FDA-PI 雙染色法對(duì)病菌Pd165菌絲體染色，SLFE 處理組菌絲細(xì)胞大部分呈紅色熒光，少數(shù)為綠色熒光，說(shuō)明經(jīng)SLFE 處理后的病菌Pd165 菌絲體細(xì)胞膜的完整性受到破壞。運(yùn)用拉曼光譜檢測(cè)SLFE 處理后的病菌Pd165 胞外液，其中代表脂肪酸、核酸和蛋白質(zhì)的吸收峰：1 129，1 330，1 565 cm-1同時(shí)增強(qiáng)。由此更進(jìn)一步證實(shí)由于細(xì)胞膜完整性被破壞，造成病菌Pd165胞內(nèi)脂肪酸、核酸和蛋白質(zhì)的外泄。這與黃飛[26]研究發(fā)現(xiàn)反式肉桂醛處理對(duì)意大利青霉菌絲體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)具有損傷作用的研究結(jié)果相似。

通過(guò)檢測(cè)菌株P(guān)d165 菌絲體胞內(nèi)的還原糖、可溶性蛋白、丙酮酸含量在添加不同質(zhì)量濃度SLFE 后的變化，發(fā)現(xiàn)三者含量均顯著降低，4.8 mg/mL 的SLFE 處理后，三者分別下降81.13%，66.67%和41.41%。還原糖和可溶性蛋白是細(xì)胞內(nèi)重要組成成分，丙酮酸是參與生物體基礎(chǔ)代謝的中間產(chǎn)物之一，在糖、脂肪、氨基酸的代謝聯(lián)系中起著重要的樞紐作用，這3 種胞內(nèi)物質(zhì)含量的下降表明菌絲體合成代謝出現(xiàn)紊亂，無(wú)法維持正常的生長(zhǎng)與生理功能。Chen 等[27]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)7-脫甲氧基酪氨酸處理后的意大利青霉菌體胞內(nèi)還原糖、可溶性蛋白含量顯著降低，這與本研究結(jié)果一致。

Parveen 等[28]研究表明酵母細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)CHI的過(guò)量表達(dá)，進(jìn)而激活了細(xì)胞壁的代償機(jī)制以克服α-萜品烯的毒性；Guo 等[29]研究表明2-甲氧基-1，4-萘醌上調(diào)了與能量產(chǎn)生相關(guān)的蛋白——ACAD，從而擾亂病菌Pd165 的代謝過(guò)程，以發(fā)揮抑菌作用；Fan 等[30]研究表明，NO 通過(guò)誘導(dǎo)抗氧化酶（SOD 和POD）基因的過(guò)表達(dá)，以保護(hù)狗牙根免受冷脅迫；王明爽[31]報(bào)道BrlA 的過(guò)量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致病菌Pd165 菌絲停止生長(zhǎng)和菌絲尖端直接形成分生孢子。本研究的熒光定量PCR 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SLFE處理病菌Pd165 后，菌株顯著上調(diào)了上述4 種酶的基因表達(dá)量，推測(cè)病菌Pd165 受到SLFE 脅迫后，激活細(xì)胞壁代償機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)受損；?；o酶A 脫氫酶是參與催化脂肪酸與氨基酸分解代謝中的脫氫酶，其基因表達(dá)量上調(diào)加速了脂肪酸和氨基酸分解代謝，引起細(xì)胞合成代謝紊亂。過(guò)氧化物酶（POD）作為細(xì)胞內(nèi)重要的內(nèi)源活性氧清除劑，其基因的過(guò)表達(dá)可能是SLFE 處理激活了病菌Pd165 細(xì)胞內(nèi)防御酶系，以增強(qiáng)細(xì)胞清除活性氧能力，防止細(xì)胞損傷；BrlA 是調(diào)節(jié)分生孢子形成的重要元件，其基因的過(guò)量表達(dá)可能是造成菌絲生長(zhǎng)慢和分生孢子少的原因之一。此外，DNA結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SLFE 可與指狀青霉DNA 結(jié)合導(dǎo)致破壞其結(jié)構(gòu)與構(gòu)象。

綜上，SLFE 對(duì)柑橘病原菌菌株P(guān)d165 的抑菌作用主要是引發(fā)細(xì)胞完整性受損，擾亂細(xì)胞內(nèi)原有的穩(wěn)態(tài)，使核酸、糖類、可溶性蛋白等內(nèi)容物滲出；SLFE 可與DNA 結(jié)合，抑制DNA 功能的表達(dá)；同時(shí)誘導(dǎo)與細(xì)胞壁生物合成、能量代謝、氧化應(yīng)激與產(chǎn)孢等有關(guān)的基因的過(guò)表達(dá)，最終達(dá)到殺菌作用。一些活性抗菌成分也有相似的抑菌機(jī)制，如α-水芹烯和壬醛對(duì)圓弧青霉的抑菌機(jī)制是攻擊細(xì)胞膜和破壞菌絲結(jié)構(gòu)[32]。石竹烯對(duì)熱殺索絲菌的抑菌機(jī)理是攻擊病菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使胞內(nèi)物質(zhì)外泄，影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)代謝；且與基因組DNA 結(jié)合，破壞其結(jié)構(gòu)與構(gòu)象，抑制病菌生長(zhǎng)[33]。

4 結(jié)論

本研究將SLFE 作用于病菌Pd165，結(jié)果表明不同質(zhì)量濃度的SLFE 對(duì)菌株P(guān)d165 均有一定的抑制作用，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。SLFE 通過(guò)影響菌株P(guān)d165 細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，致使核酸、糖類、可溶性蛋白等細(xì)胞內(nèi)容物外滲，誘導(dǎo)參與細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的部分基因過(guò)量表達(dá)，從而達(dá)到抑菌、殺菌效果。SLFE 能抑制病菌Pd165 的生長(zhǎng)，可用于柑橘采后綠霉病的防治，有望開發(fā)為環(huán)境友好型的新型生物防腐劑。