陳 旭，黃淑娟，曾 焱，鄒水洋，朱 杰，李 琳*

（1 東莞理工學(xué)院化學(xué)工程與能源技術(shù)學(xué)院 食品營養(yǎng)健康工程與智能化加工研究中心 廣東東莞 523808 2 東莞理工學(xué)院 中國輕工業(yè)健康食品開發(fā)與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室 廣東東莞 523808）

近幾十年，全球患糖尿病的人數(shù)增長速度加快。根據(jù)最新一項流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，中國大陸糖尿病患者總數(shù)估計為1.298 億，中國成人糖尿病患病率高達(dá)12.8%，中國成人糖尿病前期比例高達(dá)35.2%[1]。在多相、多組分和多尺度同時存在的復(fù)雜食品體系中，食物組分之間的相互作用機(jī)制與糖尿病患者的糖代謝和血糖應(yīng)答水平有著密不可分的關(guān)系?？煜矸酆吭诤艽蟪潭壬蠜Q定餐后血糖應(yīng)答，含有較高抗性淀粉或慢消化淀粉的食物屬低血糖生成指數(shù)（GI）食品，可保證人體的餐后血糖穩(wěn)定，改善餐后血糖負(fù)荷，增加人體對胰島素的敏感性。食物組分間的相互作用及其對淀粉消化性的影響已成為國際食品科學(xué)界的研究熱點。

淀粉與蛋白質(zhì)是食物體系中的兩大典型組分?；诘矸酆偷鞍谆旌象w系，國內(nèi)外學(xué)者研究表明內(nèi)源蛋白質(zhì)和外源蛋白質(zhì)均會對淀粉的消化酶解特性產(chǎn)生影響[2-3]。內(nèi)源蛋白影響淀粉的消化，主要歸因于內(nèi)源蛋白可以附著在淀粉顆粒表面或者鑲嵌在淀粉之中，阻礙淀粉酶對淀粉的酶解作用從而降低淀粉的消化率和預(yù)期血糖生成指數(shù)[4-6]。此外，淀粉-蛋白質(zhì)的相互作用會導(dǎo)致血糖反應(yīng)速率和淀粉消化率降低[7-8]。內(nèi)源蛋白質(zhì)可能阻礙酶在淀粉顆粒表面的催化活性[9]。外源蛋白對淀粉的體外消化性也有很大影響：外源蛋白在淀粉顆粒表面形成吸附或者包埋，進(jìn)而降低酶對淀粉的接觸和酶解[10-12]；蛋白與淀粉非共價結(jié)合降低了淀粉的消化性[13-14]；蛋白以非催化的方式與淀粉酶分子結(jié)合，抑制了酶對淀粉的催化酶解能力[15]。

Aravind 等[16]研究淀粉體外消化水解率的影響因素，即意大利面中硬質(zhì)小麥淀粉和蛋白組成。研究表明，面筋蛋白、麥谷蛋白和高分子質(zhì)量的麥谷蛋白亞基使面團(tuán)更難被α-淀粉酶酶解，歸因于三者使面團(tuán)的結(jié)構(gòu)更加致密強(qiáng)勁。與之形成對比的是，麥醇溶蛋白和低分子質(zhì)量的麥谷蛋白亞基則使面團(tuán)更容易被α-淀粉酶水解，歸因于其通過二硫鍵的作用可以削弱面團(tuán)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使面團(tuán)的結(jié)構(gòu)更加疏松。前期的抑制動力學(xué)研究表明，小麥面筋蛋白對豬胰α-淀粉酶（Porcine pancreatic αamylase，PPA）存在較強(qiáng)的抑制作用，且屬于混合型競爭性抑制[15]。面筋蛋白中有兩個重要組分，分別為麥谷蛋白（Glutenin，Glu）（30%～40%）和麥醇溶蛋白（Gliadin，Gli）（40%～50%）[17]。面筋蛋白的混合型競爭性抑制作用可能歸因于其中的不同蛋白組分，然而其對淀粉酶的抑制機(jī)制尚待明確?；诖耍疚耐ㄟ^半抑制濃度（IC50）來研究面筋蛋白中麥谷蛋白和麥醇溶蛋白對PPA 的抑制活性。結(jié)合Dixon 方程和Cornish-Bowden 方程探究其抑制類型及抑制機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米淀粉（食用級），杭州普羅星淀粉有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、碳酸鈉，天津大茂化學(xué)試劑廠；PAHBAH、PBS 緩沖液、面筋蛋白、麥醇溶蛋白、豬胰α-淀粉酶，美國Sigma-Aldrich公司（≥1 000 units/mg）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 設(shè)備與儀器

恒溫水浴鍋（HH-6 型），江蘇環(huán)宇科學(xué)儀器廠；立式電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9420A 型），上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；電子分析天平（FA2204 型），常州市衡正電子儀器有限公司；臺式高速離心機(jī)（TG20-WSI），湘麓離心機(jī)儀器有限公司；磁力加熱攪拌器（Hei-Tec），德國Heidolph公司；超聲波清洗器（WD-9415B 型），上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；紫外分光光度計（UV-3200），深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司；水分測定儀（MA35），賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 面筋蛋白中麥谷蛋白的分離 稱取100 g面筋蛋白置于1 L 燒杯中，加入300 mL 蒸餾水溶解，攪拌混勻后加入α-淀粉酶溶液（Dry protein basis，1%），在60 ℃條件下水浴恒溫反應(yīng)1.5 h，酶解反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫。酶解液在4 000 r/min條件下離心20 min 以沉降蛋白質(zhì)，除去上層水液。重復(fù)3 次離心，即可基本除去全部淀粉。取出沉降蛋白質(zhì)，在低溫條件下干燥后保存。稱量已除淀粉的面筋蛋白100 g 于1 L 燒杯中，加入體積比為115∶25 的乙醇和異丙醇的混合溶液600 mL。用磁力加熱攪拌器在60 ℃條件下攪拌4 h 后，用離心機(jī)在5 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心20 min。取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，在30 ℃環(huán)境下干燥，完成后稱量并保存。再用蒸餾水反復(fù)洗滌溶液沉淀后，進(jìn)行冷凍干燥，完成后稱量并保存[18]。

1.3.2 麥谷蛋白和麥醇溶蛋白對PPA 半抑制濃度（IC50）的測定 將20 mL PBS 緩沖液加入到50 mL 帶蓋離心管中，再加入準(zhǔn)確稱量的玉米淀粉，使溶液質(zhì)量濃度為1 mg/mL，隨后分別加入準(zhǔn)確稱取的麥谷蛋白/麥醇溶蛋白，淀粉和麥谷蛋白的質(zhì)量比分別設(shè)定為：1∶2.5，1∶5，1∶10，1∶15 和1∶20。用渦旋機(jī)混勻后放入燒杯中100 ℃水浴，讓淀粉糊化30 min 后取出，在室溫冷卻后置于37 ℃恒溫水浴中進(jìn)行磁力攪拌。準(zhǔn)確移取1 mL PPA（3 U/mL）到離心管中，充分渦旋，置于37 ℃恒溫水浴中進(jìn)行酶解反應(yīng)并準(zhǔn)確計時。分別于4，8，12 min后，移取300 μL 酶解液到1.2 mL 0.3 mol/L 的Na2CO3溶液中并充分渦旋混勻以終止酶解反應(yīng)。在4 000×g 條件下將酶解液離心10 min，得到上清液。

上清液中的還原糖含量通過PAHBAH 的方法來測定。PAHBAH 顯色劑的配制方法如下：首先用5 mL 0.5 mol/L 的HCl 溶液溶解250 mg PAHBAH，繼續(xù)添加45 mL 0.5 mol/L NaOH 溶液，以保證PAHBAH 能夠完全溶解，顯色劑需要現(xiàn)配現(xiàn)用。100 μL 不同時間點的酶解液與1 mL 的PAHBAH 試劑混合，置于100 ℃水浴加熱5 min，經(jīng)冷卻后在410 nm 波長處測定吸光度。采用麥芽糖溶液（0.01～0.9 mm，100 μL）來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以100 μL 去離子水作為對照。利用麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線將吸光度值轉(zhuǎn)換為還原糖濃度。初始反應(yīng)速度（v）由反應(yīng)溶液中還原糖濃度與時間曲線的斜率決定，PPA 的抑制率I（%）按照公式（1）計算。

式中，v 和v0——存在和不存在蛋白質(zhì)時的初始反應(yīng)速度（mg/mL·min）。

繪制抑制率與抑制劑濃度的比值曲線。

式中，I——抑制劑質(zhì)量濃度（mg/mL）；Imax——最大抑制百分比（%）。

運用SPSS 采用非線性回歸方法擬合計算式（2），計算IC50，設(shè)置不同濃度條件下蛋白的抑制率為響應(yīng)頻率，蛋白濃度為協(xié)變量[19]。

1.3.3 麥谷蛋白和麥醇溶蛋白的PPA 抑制動力學(xué)試驗 麥谷蛋白/麥醇溶蛋白的PPA 抑制動力學(xué)試驗是通過設(shè)計不同濃度底物（煮熟的玉米淀粉）在不同濃度麥谷蛋白/麥醇溶蛋白中存在的情況下進(jìn)行的。將10 mL PBS 緩沖液（pH 7.2）加入到50 mL 帶蓋離心管中，再準(zhǔn)確稱取適量的玉米淀粉和麥谷蛋白/麥醇溶蛋白加入離心管中，得到一系列的麥谷蛋白/麥醇溶蛋白溶液 （2.5～20 mg/mL）和玉米淀粉溶液（2.5～20 mg/mL）。待充分渦旋混勻后置于100 ℃的水浴鍋中恒溫水浴蒸煮糊化30 min，取出后在37 ℃水浴中以160 r/min 進(jìn)行磁力攪拌。加入1 mL PPA（3 U/mL），充分渦旋，在恒定溫度（37 ℃）水浴中進(jìn)行酶解反應(yīng)，并準(zhǔn)確計時。分別于4，8，12 min 后，移取300 μL 的混合酶解液加入到裝有1.2 mL 0.3 mol/L 的Na2CO3的離心管中，充分渦旋混勻以終止酶解反應(yīng)。5 000×g 離心10 min 以得到上清液。上清液中的還原糖含量用PAHBAH 的方法測定，參照1.3.2 節(jié)的方法。

運用Dixon 方程和Cornish-Bowden 方程來分析闡釋蛋白質(zhì)對PPA 的抑制機(jī)理和抑制類型。以時間為橫坐標(biāo)，還原糖含量為縱坐標(biāo)得到的圖像的斜率為初始反應(yīng)速率（v）。

為了描述蛋白質(zhì)對α-淀粉酶的抑制機(jī)理，采用Dixon 方程分析初始反應(yīng)速度（v）與抑制劑濃度（i）的關(guān)系。以還原糖含量為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)做圖，通過斜率可以得到初始反應(yīng)速率（v）。通過Dixon 方程計算Kic和Kiu。

混合型抑制的Dixon 方程如式（3）。

式中，Vmax——最大初始速度 （mg/mL·min）；a——淀粉質(zhì)量濃度 （mg/mL）；Km——米氏常數(shù)；i——抑制劑質(zhì)量濃度（mg/mL）；v——初始反應(yīng)速度（mg/mL·min）。

對Dixon 方程兩邊同時取倒數(shù)得式（4），通過多個淀粉濃度，可以推導(dǎo)出Kic=-i，即Kic為不同淀粉底物濃度所對應(yīng)的各條曲線的交點的橫坐標(biāo)絕對值。

通過多個淀粉濃度值繪制a/v 與i 的關(guān)系來建立Cornish-Bowden 圖。

混合型抑制的Cornish-Bowden 方程如式（5）。

將方程兩邊同時取倒數(shù)如式 （6），Cornish-Bowden 方程可以繪制成以i 為橫坐標(biāo)，a/v 為縱坐標(biāo)的線性圖。使用上述計算方法，可以得出方程的Kiu=-i，式中Kiu于不同淀粉底物濃度所對應(yīng)的各條曲線的交點的橫坐標(biāo)絕對值。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥醇溶蛋白和麥谷蛋白對PPA 的抑制作用

麥醇溶蛋白對PPA 抑制作用曲線如圖1（a，c，e）所示。添加不同質(zhì)量濃度的麥醇溶蛋白的體系與未添加蛋白的相對比，都可以降低淀粉酶的初始反應(yīng)速率。同時，隨著麥醇溶蛋白質(zhì)量濃度的增加，淀粉酶的初始反應(yīng)速率逐漸降低，抑制作用逐漸增強(qiáng)。不同質(zhì)量比（1∶2.5，1∶5，1∶0，1∶15 和1∶20）的麥醇溶蛋白對PPA 的抑制率分別為：6.31%±1.96%，17.65%±1.05%，27.89%±2.46%，28.69%±0.978%和39.04%±0.811%。通過SPSS 軟件進(jìn)行回歸得到麥醇溶蛋白的IC50為 （33.193±0.621）mg/mL。

麥谷蛋白對PPA 抑制作用曲線如圖1（b，d，f）所示。與麥醇溶蛋白出現(xiàn)相似的趨勢，添加了不同質(zhì)量濃度的麥谷蛋白的體系與未添加蛋白的相對比，均可以降低淀粉酶的初始反應(yīng)速率。同時隨著麥谷蛋白質(zhì)量濃度的增加，淀粉酶的初始反應(yīng)速率逐漸降低，抑制作用逐漸增強(qiáng)。淀粉和麥谷蛋白在不同質(zhì)量比（1∶2.5，1∶5，1∶10，1∶15，1∶20）條件下的抑制率分別為：22.69%±2.15%，25.54%±2.35%，40.80%±4.31%，52.64%±1.35%和59.12%±0.186%。通過SPSS 軟件進(jìn)行回歸得到麥谷的IC50為（14.014±1.089）mg/mL。與麥醇溶蛋白相比，麥谷蛋白對PPA 表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用。

圖1 特定濃度淀粉在不同質(zhì)量濃度的蛋白抑制劑下的初始反應(yīng)速率（a，b）；α-淀粉酶在不同質(zhì)量濃度的蛋白抑制劑下的殘留活性曲線（c，d）；在不同質(zhì)量濃度的蛋白抑制劑下相同濃度的淀粉對α-淀粉酶下的抑制率（e，f）Fig.1 Initial reaction velocity of corn starch with a given concentration at different mass concentrations of protein inhibitors （a，b）；Residual activity curves of PPA at different mass concentrations of protein inhibitors （c，d）；Inhibition of PPA on starch at different mass concentrations of protein inhibitors （e，f）

2.2 α-淀粉酶抑制動力學(xué)分析

麥谷蛋白和麥醇溶蛋白對PPA 抑制作用的反應(yīng)曲線如圖2和圖3所示。在蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度一定的條件下，增加底物淀粉的濃度，體系的反應(yīng)速率也隨之增加。與不含蛋白的體系相比，添加了不同質(zhì)量濃度的麥谷蛋白和麥醇溶蛋白均可造成PPA 初始反應(yīng)速率降低，即降低PPA 對淀粉的酶解速率。此外，淀粉酶對淀粉的初始反應(yīng)速率隨著添加麥谷蛋白和麥醇溶蛋白質(zhì)量濃度增加而逐漸

圖2 麥谷蛋白對PPA 抑制作用曲線Fig.2 The inhibitory effect of glutenin from wheat on PPA

圖3 麥醇溶蛋白對PPA 抑制作用曲線Fig.3 The inhibitory effect of gliadin from wheat on PPA

降低，表明抑制作用在逐漸增強(qiáng)。

不同質(zhì)量濃度的淀粉在不同蛋白濃度條件下的反應(yīng)初始速率如圖4所示。麥谷蛋白和麥醇溶蛋白對PPA 抑制的Dixon 方程和Cornish-Bowden方程如圖5和6所示。麥谷蛋白和麥醇溶蛋白對PPA 抑制的Dixon 方程和Cornish-Bowden 方程特征值如表1所示。

圖4 不同質(zhì)量濃度的淀粉在不同質(zhì)量濃度的麥谷蛋白（a）和麥醇溶蛋白（b）下的初始反應(yīng)速率Fig.4 Initial reaction velocity of starch with different mass concentrations in glutenin （a） and gliadin from wheat （b）with different mass concentrations

圖5 麥谷蛋白（a）和麥醇溶蛋白（b）對PPA 抑制Dixon 方程Fig.5 Dixon （insets） curves for PPA inhibition by glutenin （a） and gliadin from wheat （b）

圖6 麥谷蛋白（a）和麥醇溶蛋白（b）對PPA 抑制Cornish-Bowden 方程Fig.6 Cornish-Bowden （insets） curves for PPA inhibition by glutenin （a） and gliadin from wheat （b）

表1 麥谷蛋白和麥醇溶蛋白對PPA 抑制的Dixon 方程和Cornish-Bowden 方程特征值Table 1 Characteristic value of Dixon and Cornish-Bowden equations for PPA inhibition by glutenin and gliadin from wheat

從麥谷蛋白的Dixon 方程和Cornish-Bowden方程可以看出有明顯的交點，這就表明，麥谷蛋白對PPA 的抑制既有競爭性抑制又有反競爭性抑制，即其類型屬于混合型競爭性抑制。經(jīng)計算得到麥谷蛋白的競爭性抑制常數(shù)（Kic）為（20.533±3.582）mg/mL，其反競爭性抑制常數(shù)（Kiu）為（49.358±9.779）mg/mL（表1）。對于麥谷蛋白而言，競爭性抑制常數(shù)比反競爭性抑制常數(shù)小，表明相對于它與游離PPA 的結(jié)合，它與淀粉和PPA 形成的中間產(chǎn)物的結(jié)合要更為緊密[20-21]。

從麥醇溶蛋白的Dixon 方程圖中可以看到有明顯的交點，而Cornish-Bowden 方程則是顯示相互平行的直線。因此表明，麥醇溶蛋白對PPA 的抑制作用類型屬于競爭性抑制。經(jīng)過公式計算得到麥醇溶蛋白的競爭性抑制常數(shù)（Kic）為（49.619±5.949）mg/mL（表1）。

2.3 抑制機(jī)理

抑制劑與酶結(jié)合，會抑制底物與酶的相互作用，從而對酶解反應(yīng)產(chǎn)生競爭性抑制；抑制劑只能和底物與酶相互作用產(chǎn)生的中間產(chǎn)物結(jié)合形成三元復(fù)合物，從而形成反競爭性抑制。在混合型競爭抑制模型中，無論淀粉是否與酶結(jié)合，抑制劑都會與酶結(jié)合。

在本試驗中，蛋白質(zhì)對PPA 的抑制作用可能存在以下幾種抑制機(jī)理。首先，蛋白質(zhì)可能通過非共價作用力，包括氫鍵、共軛作用和疏水作用力等與PPA 發(fā)生相互作用。PPA 的活性位點（Asp197，Glu233 和Asp300） 可能會通過氫鍵能與蛋白質(zhì)中含有的羥基結(jié)合[19]。蛋白中的C=O 雙鍵能夠通過電子云的離域來與苯環(huán)形成л-л 共軛增強(qiáng)共軛作用，可能改變酶的構(gòu)象，使酶中的活性位點不能結(jié)合淀粉。因此，蛋白質(zhì)對PPA 構(gòu)成競爭性抑制作用。其次，推測酶中還可能存在二級碳水化合物結(jié)合位點（非活性位點），這些非活性位點遠(yuǎn)離，并會進(jìn)一步與蛋白質(zhì)結(jié)合。已被證實這兩個非活性結(jié)合位點具有特殊的功能，能夠加強(qiáng)酶對淀粉的水解[22]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)發(fā)生變性之后可能與這些非活性位點結(jié)合，協(xié)同阻礙酶對淀粉的水解。再次，從反競爭性抑制的角度考慮，當(dāng)?shù)矸叟cPPA相互結(jié)合后，可能會改變酶的空間構(gòu)象，因此形成的淀粉酶-淀粉復(fù)合物會更易于與蛋白質(zhì)的某些部位結(jié)合。

麥谷蛋白是由多個亞基通過二硫鍵相互結(jié)合而組成的非均質(zhì)大分子聚合物，亞基包括高分子質(zhì)量和低分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基，分子質(zhì)量較大，約在十萬到數(shù)百萬之間[23]。而麥醇溶蛋白是一種單體蛋白，分子質(zhì)量較小，約在30～80 ku 之間，分子間的相互作用力也較小，分子內(nèi)通過氫鍵、疏水鍵和二硫鍵相互連接，形成比較緊湊的三維結(jié)構(gòu)，沒有亞基結(jié)構(gòu)和肽鏈間二硫鍵[24]。麥谷蛋白經(jīng)蒸煮后，蛋白分子展開，因各種分子間作用力即氫鍵、靜電引力、二硫鍵、疏水作用等形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，形成具有一定孔洞結(jié)構(gòu)的凝膠[25-26]。蒸煮之后的麥谷蛋白結(jié)構(gòu)變得松散，因而其內(nèi)部的疏水性基團(tuán)便暴露出來，從而增加了與豬胰α-淀粉酶相互作用的幾率。而麥醇溶蛋白在蒸煮過程中，由于其熱凝固性，變性后依然不易溶于水[27]。因此，蒸煮之后變性的麥谷蛋白更易與α-淀粉酶結(jié)合，即麥谷蛋白較麥醇溶蛋白對α-淀粉酶的抑制作用更強(qiáng)。

3 結(jié)論

本研究采用Dixon 方程和Cornish-Bowden 方程來探討麥谷蛋白和麥醇溶蛋白對PPA 的抑制動力學(xué)。研究表明，麥谷蛋白對PPA 的抑制作用類型是混合型競爭性抑制，包括競爭性抑制和反競爭性抑制。麥谷蛋白與游離的PPA 的結(jié)合相對于蛋白質(zhì)與淀粉和PPA 形成的中間產(chǎn)物的結(jié)合更加緊密。麥醇溶蛋白對PPA 的抑制作用屬于競爭性抑制。麥谷蛋白和麥醇溶蛋白均可以抑制PPA 的活性，延緩淀粉的消化，且麥谷蛋白的抑制作用更強(qiáng)。這些研究結(jié)果對于碳水化合物限制飲食體系低GI 食品開發(fā)和以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的功能食品的探究具有重要的實用價值。