張鵬飛，劉新奇，石 菲

(1.榆林市第一醫(yī)院普外科，陜西 榆林 719000;2.空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710032)

胃癌又稱胃腺癌，是世界上第四大癌癥類型，也是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。研究[1]表明，胃癌發(fā)生與性別、年齡有關(guān)，男性發(fā)病率高于女性。50歲以上人群中胃癌的發(fā)病率明顯升高[2-3]。胃癌在亞洲、拉丁美洲、中歐和東歐的發(fā)病率較高。由于在早期階段，胃癌沒有臨床表現(xiàn)，許多患者在疾病的晚期才被診斷，因此胃癌的治療效果欠佳[2]。雖然病理診斷和手術(shù)治療是提高胃癌患者生存率的有效手段，但由于胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，胃癌患者的5年生存率仍然很低[3]。微小RNA(microRNA,miRNA)在許多疾病和病理生理過程中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用如腫瘤發(fā)生、白血病、心肌重塑、胚胎發(fā)育和造血干細(xì)胞分化等[4-6]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA對胃癌發(fā)生發(fā)展的有著重要調(diào)節(jié)作用，miRNA代謝的紊亂可能是胃癌的潛在發(fā)病機制[4-6]。有研究[7-8]表明，miRNA-35(miR-35)在乳腺癌和黑色素瘤中發(fā)揮重要作用，而miR-35對胃癌的調(diào)控作用尚不明確。本研究擬探究miR-35對胃癌細(xì)胞凋亡的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 澳洲胎牛血清(美國Gibco公司，貨號10100147),低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(美國Gibco公司，貨號31330095),I型膠原(美國Gibco公司，貨號A1048301)；Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司，貨號11668030)；miRNA核苷酸序列(miR-35序列)(生工生物公司)；RNA抽提試劑盒(日本Takara公司，貨號639505)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司，貨號639549)、擴增試劑盒(日本Takara公司，貨號639503)；q-PCR引物由生工生物公司合成；Hoechst33342(南京舟達(dá)生物科技公司，貨號BN12457)、PI(南京舟達(dá)生物科技公司，貨號BN12624)、轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)分析試劑(美國Promega公司，貨號PNE0324)；抗Caspase 3抗體(美國Abcam公司，貨號ab32147)、抗Bax抗體(美國Abcam公司，貨號ab128873)、抗Bcl-2抗體(美國Abcam公司，貨號ab135745)、抗RhoA抗體(美國Abcam公司，貨號ab3547)和抗β-actin抗體(美國Abcam公司，貨號ab78453)；DNA內(nèi)切酶及連接酶(北京百奧萊博科技有限公司，貨號BTN130639、BTN130653)。實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司，型號ABI7500fast)；酶標(biāo)儀(上海沛歐分析儀器有限公司，型號SPS5845)；流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司，型號BEC2058)；顯微鏡(日本Olympus公司，型號CX21FS1)；電泳儀及發(fā)光儀(中國天能公司，型號天能EPS600)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和胃癌細(xì)胞系MNK-45、MGC803、SCG-7901、AGS購買自蘇州思瑞坦細(xì)胞庫。根據(jù)轉(zhuǎn)染寡核苷酸序列不同分為轉(zhuǎn)染miR-35陰性對照序列(5’-AGC AGC CUU GUA CAG GGC UAU GA-3’)對照組、轉(zhuǎn)染miR-35模擬序列(5’-AAU ACU GCC UGG UAA UGA U-3’)的模擬物組和轉(zhuǎn)染miR-35互補配對序列(5’-UUA UGA CGG ACC AUU ACU A-3’)的抑制劑組[7-8]。轉(zhuǎn)染時將普通培養(yǎng)基去除，換為低血清、不含雙抗的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h；在此期間，將Lipofectamine 2000和由生工生物公司合成的miRNA相關(guān)核苷酸序列混合均勻，室溫放置30 min，待脂質(zhì)體將核苷酸序列充分包裹；在培養(yǎng)6 h后將適量上述脂質(zhì)體混合液加入到上述低血清培養(yǎng)基中(miRNA相關(guān)核苷酸序列濃度為80 nmol/L)繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)6 h，隨后更換上述培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞[9]。

1.2.2 轉(zhuǎn)染效率檢測：將合成的miRNA相關(guān)核苷酸序列(帶有綠色熒光的對照序列)轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后，利用熒光顯微鏡檢測熒光物質(zhì)的分布情況，以此來判斷核苷酸的轉(zhuǎn)染效率[10]。

1.2.3 q-PCR檢測miRNA表達(dá)量：按照說明書利用RNAiso進(jìn)行細(xì)胞裂解，室溫裂解2 min后加入適量的三氯甲烷震蕩，待溶液完全乳化，室溫放置10 min后見萃取分層，高速離心后取無色上清加入等體積的異丙醇，充分混合后冰凍過夜。離心后棄去上清，加入無水乙醇充分洗滌沉淀，棄去上清，加入DEPC水溶解RNA。根據(jù)說明書配制反應(yīng)液，根據(jù)說明書內(nèi)容設(shè)置參數(shù)，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：37 ℃預(yù)熱15 min,42 ℃加熱15 min,85 ℃加熱5 s,反應(yīng)結(jié)束后得到的cDNA用于后續(xù)實驗。根據(jù)擴增試劑盒說明書配制反應(yīng)液，經(jīng)過預(yù)變性和擴增反應(yīng)等步驟完成擴增步驟,利用相對定量法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，具體擴增條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃維持5 s，60 ℃維持34 s,進(jìn)行40個循環(huán)[9]。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：利用緩沖液制備細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為1×106/ml)，按照Annexin-V/PI凋亡試劑盒說明，制備反應(yīng)用細(xì)胞懸液，然后利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況[10]。

1.2.5 形態(tài)學(xué)方法評估細(xì)胞凋亡：根據(jù)發(fā)生凋亡的細(xì)胞核形態(tài)不同，利用Hoechst33342和PI兩種細(xì)胞核染料對細(xì)胞進(jìn)行染色，染料濃度為5 μg/ml。完成染色后利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)和染色情況，根據(jù)以下分級對細(xì)胞進(jìn)行評估：正常細(xì)胞核(藍(lán)色染色質(zhì)有組織結(jié)構(gòu))、凋亡細(xì)胞核(發(fā)生濃縮或破碎的熒光染色質(zhì))和壞死細(xì)胞核(紅色熒光染色質(zhì))。每組隨機選取5～10個野(20～25個細(xì)胞/野)，根據(jù)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征，確定凋亡細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。每個培養(yǎng)皿中至少有1000個細(xì)胞被計數(shù)和定量。凋亡指數(shù)計算為凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%[10]。TUNEL染色：利用95%乙醇在緩沖液中室溫固定細(xì)胞系20 min。再利用1% Tritonx-100室溫下固定細(xì)胞1 h,利用過氧化物酶在緩沖液中孵育5 min,DNA碎片末端脫氧核苷酸混合物標(biāo)記TUNEL后在平衡緩沖液中混合90 min。穩(wěn)定的顯色劑二氨基聯(lián)苯胺和蘇木精復(fù)染細(xì)胞[10]。

1.2.6 Western blot技術(shù)檢測蛋白表達(dá)量：利用蛋白酶裂解液制備蛋白樣本；在蛋白樣本中加入緩沖液，利用煮沸方法制備蛋白樣品。按照以下參數(shù)將上述蛋白進(jìn)行電泳：95 V進(jìn)行30 min完成濃縮膠的電泳，隨后調(diào)整為120 V電泳90 min完成分離膠的電泳；繼續(xù)調(diào)整參數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，250 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h；按照Caspase 3(1∶3000稀釋)、Bax(1∶5000稀釋)、Bcl-2(1∶3000稀釋)、RhoA(1∶5000稀釋)和β-actin(1∶10000稀釋)抗體說明書配制一定濃度的一抗，室溫孵育一抗4 h，取出條帶后沖洗干凈，配制帶有辣根過氧化物酶的二抗孵育液，隨后室溫孵育1 h，進(jìn)行發(fā)光[10]。

2 結(jié) 果

2.1 miR-35在多種胃癌細(xì)胞系中的表達(dá) 與正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1相比，胃癌細(xì)胞系MNK-45、MGC803、SCG-7901和AGS中miR-35均低表達(dá)(均P<0.05)，見圖1。

2.2 miR-35寡核苷酸作用效率驗證 熒光miRNA序列在MNK-45細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率好(圖2A)；miR-35模擬物能夠上調(diào)MNK-45細(xì)胞內(nèi)miR-35的水平(P<0.05)，miR-35抑制劑能夠降低MNK-45細(xì)胞內(nèi)miR-35的水平(P<0.05)(圖2B)。

A：光鏡(Hoechst33342和PI細(xì)胞核染色，×200)和熒光顯微鏡(TUNEL染色，×200)下觀察寡核苷酸的轉(zhuǎn)染效率；B：胃癌細(xì)胞系MNK-45內(nèi)miR-35相對含量(與對照組比較，**P<0.01)

2.3 miR-35促進(jìn)胃癌細(xì)胞系MNK-45凋亡 和對照組相比，miR-35模擬物能夠促進(jìn)MNK-45細(xì)胞凋亡(P<0.05)，而miR-35抑制劑能夠抑制MNK-45細(xì)胞凋亡(P<0.05)(圖3A、B)。為了進(jìn)一步確認(rèn)miR-35對MNK-45細(xì)胞凋亡的影響，利用細(xì)胞核形態(tài)學(xué)方法評估細(xì)胞凋亡情況。正常細(xì)胞核形態(tài)為藍(lán)色染色質(zhì)有組織結(jié)構(gòu)，凋亡細(xì)胞核形態(tài)為發(fā)生濃縮或破碎的熒光染色質(zhì)(箭頭所指)，而壞死細(xì)胞核的形態(tài)為紅色熒光染色質(zhì)(圖3C)。棕色深染的細(xì)胞為發(fā)生凋亡的細(xì)胞(箭頭所指)(圖3D)；隨后根據(jù)染色結(jié)果對凋亡細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)發(fā)現(xiàn)，miR-35模擬物能夠促進(jìn)MNK-45細(xì)胞凋亡(P<0.05)，而miR-35抑制劑能夠抑制MNK-45細(xì)胞凋亡(P<0.05)。

2.4 miR-35對胃癌細(xì)胞MNK-45凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 見圖4。與對照組相比，模擬物組MNK-45內(nèi)Caspase 3和Bax表達(dá)增加(均P<0.05)，而Bcl-2表達(dá)減少(P<0.05)；抑制劑組MNK-45細(xì)胞內(nèi)Caspase 3和Bax表達(dá)減少，而Bcl-2表達(dá)增加(均P<0.05)。

A：流式細(xì)胞儀檢測凋亡示意圖;B：MNK-45細(xì)胞凋亡統(tǒng)計圖(與對照組比較，*P<0.05);C：Hoechst33342和PI細(xì)胞核染色(×200);D：TUNEL染色(×200)

A：蛋白灰度圖;B：蛋白相對表達(dá)量統(tǒng)計圖(與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01)

2.5 RhoA是miR-35的靶基因 利用Targetscan和MiRanda等靶基因預(yù)測軟件預(yù)測miR-35的潛在靶基因，發(fā)現(xiàn)RhoA基因的3’UTR上存在miR-35的潛在結(jié)合位點(圖5A)。繼而，利用熒光素酶報告基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-35能夠顯著抑制RhoA 3’UTR質(zhì)粒的熒光素酶活性(P<0.05)(圖5B)，說明RhoA是miR-35的直接作用靶基因。為了進(jìn)一步驗證RhoA是miR-35的靶基因，我們分別將miR-35對照序列、模擬序列和互補配對序列分別轉(zhuǎn)染至MNK-45細(xì)胞內(nèi)，隨后檢測細(xì)胞內(nèi)RhoA蛋白的表達(dá)量,和對照組相比，miR-35模擬序列抑制RhoA蛋白的表達(dá)(P<0.05)，而miR-35互補配對序列促進(jìn)RhoA蛋白的表達(dá)(P<0.05)(圖5C、D)。

3 討 論

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的胃腸道疾病之一，是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。由于胃癌在疾病的早期沒有明顯臨床表現(xiàn)，大多數(shù)患者在疾病的后期才被發(fā)現(xiàn)，不幸的是此時的康復(fù)機會較低[1-3]。故深入研究胃癌發(fā)病機制及尋求治療新靶點成為近年來的研究熱點。而miRNA研究較為深入，已有多種miRNA藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗[11]。文獻(xiàn)[7-8]回顧中發(fā)現(xiàn)miR-35在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展調(diào)控中發(fā)揮重要作用，而為miR-35在胃腸道腫瘤方面的報道甚少。故為探究miR-35在胃腺癌中的作用，我們首先在正常胃黏膜細(xì)胞(GES-1)和4種胃癌細(xì)胞系(MNK-45、MGC803、SCG-7901和AGS)中檢測了miR-35的含量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞系中miR-35含量明顯減低。上述結(jié)果暗示了，miR-35在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

細(xì)胞凋亡是受細(xì)胞自身調(diào)控的主動過程，該過程是一系列基因活動引起的級聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果。凋亡調(diào)控的紊亂會造成一系列的疾病，如感染、神經(jīng)退行性疾病、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫病和腫瘤等[12]。隨著對胃癌發(fā)病機制研究的不斷深入，細(xì)胞凋亡失衡成為胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子機制[13-14]。

A：miR-35和其潛在靶基因的互補序列示意圖;B：熒光素酶報告基因技術(shù)驗證miR-35和RhoA的靶向關(guān)系;C、D：Western blot檢測MNK-45細(xì)胞中RhoA含量(與對照組比較，*P<0.05)

為了驗證miR-35對胃癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，我們選取4種胃癌細(xì)胞系中應(yīng)用廣泛且較為穩(wěn)定的細(xì)胞系MNK-45作為研究對象[15]。我們首先利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)在體外成功過表達(dá)或敲低胃癌細(xì)胞系MNK-45中miR-35含量。隨后我們應(yīng)用包括流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)、Hoechst33342和PI細(xì)胞核染色技術(shù)和TUNEL染色技術(shù)等多種技術(shù)檢測miR-35對胃癌細(xì)胞系MNK-45凋亡的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-35可促進(jìn)胃癌細(xì)胞系的凋亡，這與之前學(xué)者報道一致[16-17]。有研究[16]表明，miR-35通過拮抗核心細(xì)胞凋亡途徑來降低秀麗隱桿線蟲的凋亡閾值。也有學(xué)者報道，miR-35家族通過MPK-1/ERK-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控秀麗隱桿線蟲DNA損傷誘導(dǎo)的凋亡[17]。凋亡失衡被認(rèn)為是腫瘤發(fā)病機制中的關(guān)鍵途徑，而Caspase 3作為凋亡過程中最重要的執(zhí)行者，在凋亡過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，Bax和Bcl-2作為研究最為明確的促凋亡和抗凋亡蛋白，對Caspase 3有著決定性影響，這些靶蛋白被認(rèn)為是腫瘤治療的重要靶點[18-19]。有研究[20-21]發(fā)現(xiàn)，胃癌組織或細(xì)胞中促凋亡基因Bax和凋亡執(zhí)行基因Caspase 3低表達(dá)，而抑凋亡基因Bcl-2高表達(dá)，這使得胃癌組織或細(xì)胞凋亡減少。為進(jìn)一步探究miR-35調(diào)控胃癌細(xì)胞凋亡的作用，我們驗證了miR-35對胃癌細(xì)胞系凋亡信號通路中關(guān)鍵分子表達(dá)的影響。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)miR-35增加了胃癌細(xì)胞系促凋亡蛋白Bax和凋亡執(zhí)行蛋白Caspase 3的表達(dá)，同時減少了抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。

明確miR-35促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象后，我們進(jìn)一步探究其促凋亡的分子機制。miRNAs作為重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控分子，對超過1/3的基因發(fā)揮調(diào)控作用，而miRNAs的5’端種子序列與靶基因3’端非編碼區(qū)的互補配對后對靶基因的沉默或降解是其對靶基因最主要的調(diào)控方式[7-9]。目前研究表明，在人類的多種腫瘤中RhoA基因被過度激活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長及侵襲[22]。已經(jīng)研究證實，抑制RhoA基因的活化可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抑癌作用[23-25]。為了探究miR-35促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的機制，我們首先利用生物信息學(xué)分析技術(shù)預(yù)測了miR-35可能的靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-35的5’端種子序列與RhoA基因的3’端非編碼區(qū)有著較高的匹配度。為了進(jìn)一步驗證miR-35與RhoA基因的直接調(diào)控作用，我們通過熒光素酶報告基因技術(shù)驗證了miR-35可以直接靶向作用于癌基因RhoA，這可能是miR-35發(fā)揮抑癌作用的重要方式。隨后我們又在蛋白水平驗證了上述結(jié)論，即過表達(dá)miR-35后RhoA蛋白表達(dá)降低，而調(diào)低miR-35表達(dá)后RhoA蛋白表達(dá)升高。

綜上所述，多種胃癌細(xì)胞系內(nèi)低表達(dá)miR-35，miR-35可通過靶向RhoA促進(jìn)胃癌細(xì)胞MNK-45的凋亡。后續(xù)研究我們將進(jìn)一步利用在體實驗驗證miR-35的抑癌作用及分子機制。