李晶晶，吳 丹，歐陽津，那 娜

（北京師范大學(xué) 放射性藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，化學(xué)學(xué)院，北京 100875）

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，其在生物檢測、臨床診斷中逐漸展示出巨大的應(yīng)用前景。通過對納米材料進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)和合成，可將目前臨床上的診斷和治療兩個(gè)分離的過程或功能匯集于同一納米材料中，構(gòu)成診療一體化納米平臺［1-4］。利用該平臺，可以實(shí)時(shí)、精確診斷病情并進(jìn)行同步治療，還可在治療過程中，監(jiān)控療效并隨時(shí)調(diào)整給藥方案，得到最佳治療效果，減少毒副作用［5-7］。這類納米材料由于具有良好的可修飾性和負(fù)載活性（或功能）物種的能力，非常有利于構(gòu)筑納米診療一體化平臺，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用價(jià)值［8-11］。其中，介孔二氧化硅納米顆粒（MSN）憑借其可控的介孔結(jié)構(gòu)、高的比表面積、良好的生物相容性和易化學(xué)修飾的優(yōu)點(diǎn)［12-13］，被認(rèn)為是制備零提前釋放、靶向釋放和時(shí)空可控釋放藥物的最有前途的候選藥物。到目前為止，已經(jīng)開發(fā)了大量基于MSN 的納米藥物系統(tǒng)，這些系統(tǒng)基于納米材料的合成，結(jié)合超分子組裝、聚合物多層膜包覆進(jìn)行構(gòu)建，并可以利用DNA 和蛋白質(zhì)作為藥物釋放“守門人”。進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或體內(nèi)后，基于氧化還原反應(yīng)、pH 值或溫度的變化、酶催化、競爭性結(jié)合或光輻射等作用，刺激觸發(fā)藥物釋放［3，14-15］，發(fā)揮治療作用。雖然這些釋放系統(tǒng)設(shè)計(jì)良好，但由于腫瘤細(xì)胞與周圍正常組織在溫度、pH值、化學(xué)成分、酶濃度等方面的差異不明顯，使得其在體外和體內(nèi)的實(shí)際應(yīng)用仍有很長的路要走［16-18］。因此，構(gòu)建對特定的內(nèi)源性刺激響應(yīng)的有效藥物釋放系統(tǒng)，特別是對腫瘤組織中異常表達(dá)的生物分子的響應(yīng)，仍然是人們關(guān)注的研究熱點(diǎn)之一。

核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA）是遺傳信息與蛋白質(zhì)之間的橋梁。經(jīng)研究，目前多種RNA 分子都可以作為腫瘤標(biāo)志物用于癌癥的早期診斷。作為RNA分子的一種，microRNA（miRNA）已經(jīng)成為一種新型的癌癥特異性生物標(biāo)志物。miRNA是較小（約22 bp）的高度保守非編碼RNA，在不同的細(xì)胞類型中進(jìn)行內(nèi)源性表達(dá)，可通過堿基互補(bǔ)配對的方式使基因沉默，從而起到基因表達(dá)關(guān)鍵調(diào)控因子的作用。與正常組織相比，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出特異的miRNA表達(dá)譜，因而miRNA可以作為新的生物標(biāo)志物指示不同的癌癥［13，19-20］，為潛在的靶點(diǎn)治療提供新的可能性［21-22］。其中，基于擴(kuò)增反應(yīng)使納米材料在細(xì)胞內(nèi)完成高效擴(kuò)增，從而放大細(xì)胞內(nèi)極低濃度RNA的響應(yīng)信號，是腫瘤標(biāo)志物高靈敏檢測的有效途徑之一。

本研究合成了一種基于適配體的發(fā)夾DNA 包封介孔二氧化硅納米材料，進(jìn)行癌癥診療試劑遞送。二氧化硅納米材料的高比表面積及吸附性，使之可有效負(fù)載擴(kuò)增檢測試劑及癌癥治療藥物，集miRNA擴(kuò)增檢測及可控藥物釋放于一體進(jìn)行疾病診療研究。該工作擴(kuò)充了基于納米材料的疾病診療研究，為硅基納米材料的應(yīng)用發(fā)展提供了數(shù)據(jù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

正硅酸乙酯（TEOS，Aldrich chemistry），十六烷基三甲基氯化銨（CTAC，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），三乙醇胺（TEA，98%）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，98%）（Alfa Aesar），水楊醛（99%，分子量122.12，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司），氯化鎂（分析純，分子量95.21，北京化學(xué)試劑公司）；阿霉素（Dox）、HG1（序列：5'-TCAGACTGATGTTCGTAGCTTATCAACA/iCy3dT/CAGTCTGATAAGCTATTTTT TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3'）、HG2（序 列：5' -TTCGTAGCTTATCAGACTGA/iCy5dT/GTTGATAAGCTACGAACATCAGTTTTTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3'）、miRNA-21（序列：5'-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3'）、TBE 緩沖劑（1×，17.05 g）均為上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品。PBS緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.2 ～7.4，Solarbio），瓊脂糖（Agarose B，BBI Life Sciences），4sgreen Plus 染色劑（BBI Life Sciences）。電泳所需試劑（25 ～500 bp DNA Marker、6×DNA Loading Buffer，寶生物工程大連有限公司），Tris 溶液：28 mmol/L Tris-HCl（含200 mmol/L KCl，4 mmol/L MgCl2，pH 7.4），乙醇（分析純，分子量46.07，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）。

實(shí)驗(yàn)所用去離子水均由Milli-Q純水系統(tǒng)處理（18.0 MΩ·cm）。

1.2 儀器

FEI Talos F200S 透射式掃描電子顯微鏡（賽默飛世爾科技）、RF-6000 熒光光譜儀（島津公司）、SX2-2.5-10 箱式電阻爐（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、ChampGel5000 凝膠成像分析儀（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）、Mini-PROTEAN ? Electrophoresis Systems 凝膠電泳儀（美國Bio-Rad 公司）、BS124S 電子天平（北京塞多利斯儀器系統(tǒng)公司）、CRY-2102C 恒溫振蕩器（上海市百典儀器）、Zetasizer Nano ZS90 動(dòng)態(tài)光散射（馬爾文帕納科有限公司）、DZF-6020 真空干燥箱（北京中科博達(dá)儀器科技有限公司）、TG16-WS臺式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）、大龍實(shí)驗(yàn)室手動(dòng)單道可調(diào)式移液器（量程0 ～10 μL，20 ～200 μL，100 ～1 000 μL）、DF-101Z 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州特爾儀器設(shè)備有限公司）、Q-G1000/C6干式恒溫器（北京六一生物科技有限公司）、MTC-100恒溫混勻儀（杭州米毆儀器有限公司）、KQ-50DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 介孔硅納米顆粒合成

在40 mL 去離子水中加入4 g CTAC 和0.16 g TEA 攪拌混合，升溫至95 ℃，并于95 ℃加熱1 h 后，加入1.5 mL TEOS，繼續(xù)攪拌混合1 h［23］。離心收集MSNs，用水、乙醇多次洗滌，真空干燥。550 ℃空氣煅燒5 h除去殘余的有機(jī)物CTAC，于乙醇中重分散，置于4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 介孔硅納米顆粒表面氨基化

取20 mg的MSNs 分散于40 mL 乙醇中，超聲處理。加入40 μL APTES，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3 h。分別用乙醇和去離子水洗滌3 次，除去多余的反應(yīng)物，加入500 μL 的Tris 緩沖液，混合均勻，于4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

取少量洗滌后的介孔二氧化硅于離心管中，10 000 r/min 離心去除上清液，乙醇洗滌2 次，10 000 r/min 離心，留少量固體于管底。加入10 μL 水楊醛溶液，離心管底部沉淀變黃，證明介孔二氧化硅納米顆粒氨基化成功。

1.5 介孔硅納米顆粒載藥

取10 μL 氨基化介孔硅納米顆粒分散在含Dox 的PBS 溶液（2 mL，0.5 mg/mL）中，在黑暗條件下室溫?cái)嚢?4 h后，離心收集負(fù)載Dox的納米顆粒（Dox@MSNs）。用PBS溶液洗滌除去表面吸附的Dox殘留物，加入252 μL PBS緩沖液，混合均勻，待用。

1.6 介孔硅納米顆粒修飾DNA

將DNA 鏈在28 mmol/L Tris-HCl 溶液中于95 ℃加熱5 min，緩慢退火至室溫，使鏈完美形成DNA二級結(jié)構(gòu)（含HG1 和HG2）。將84 μL 10 μmol/L 探針HG1 和84 μL 10 μmol/L 探針HG2 溶液與252 μL 載藥介孔硅納米顆粒于室溫渦旋攪拌30 min制備DNA納米復(fù)合物?；旌衔镆?5 000 r/min離心10 min，用PBS緩沖液多次洗滌以去除過量的DNA 探針。加入1 mL PBS緩沖液混合均勻，得到核酸-硅基納米復(fù)合物（Dox@MSNs-DNA）。

2 結(jié)果與討論

2.1 硅納米復(fù)合材料的設(shè)計(jì)

本研究中硅納米復(fù)合材料的合成思路是：首先，在介孔二氧化硅納米顆粒的孔隙內(nèi)部載入腫瘤藥物Dox；同時(shí)，發(fā)夾G-四鏈體DNA（HG1、HG2（分別用熒光基團(tuán)Cy3 和Cy5 標(biāo)記））可在中性pH 值下通過靜電吸附作用，靈活吸附在APTES 修飾的單分散二氧化硅表面，對癌癥標(biāo)志物miRNA 進(jìn)行特異性響應(yīng)。如圖1 所示，在沒有刺激的情況下，Cy3 和Cy5 熒光團(tuán)與猝滅劑的距離很遠(yuǎn)，不會發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），熒光信號很弱。同時(shí)，無目標(biāo)識別響應(yīng)觸發(fā)納米載體的孔隙解鎖，藥物傳遞系統(tǒng)處于鎖定狀態(tài)。納米載體在靶標(biāo)miRNA-21刺激響應(yīng)下，會啟動(dòng)與HG1的雜交，解開HG1的發(fā)夾結(jié)構(gòu)以產(chǎn)生單鏈尾，增加HG1在顆粒表面的移動(dòng)性，促進(jìn)其與HG2雜交。HG2與HG1雜交，引發(fā)發(fā)夾組裝，產(chǎn)生雙鏈G-四鏈體，形成更穩(wěn)定、更剛性的雜化物，剛性雙鏈構(gòu)象對納米組裝體的親和力降低，因此從表面解離。解離產(chǎn)物中的HG1、HG2分別修飾的熒光染料Cy3、Cy5 由于距離拉近激活了F?ster 共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）信號，使得熒光信號放大，進(jìn)一步指示靶標(biāo)miRNA-21的表達(dá)。與此同時(shí)，靶標(biāo)miRNA-21的釋放可成為下一次發(fā)夾組裝的引發(fā)物，并不斷循環(huán)擴(kuò)增，以實(shí)現(xiàn)對腫瘤內(nèi)痕量靶標(biāo)miRNA-21的靈敏檢測。值得提出的是，該類硅基納米材料具有良好的生物安全性，其進(jìn)入體內(nèi)完成使命后會水解，水解產(chǎn)物的主要成分為硅酸，可通過尿液排出體外，因而在生物活體檢測中具有很大優(yōu)勢。

圖1 Dox@MSNs-DNA納米材料用于miRNA-21響應(yīng)的藥物控釋示意圖Fig.1 Schematic diagram of Dox@MSNs-DNA nanoparticals for controlled drug release in response to miRNA-21

2.2 硅納米復(fù)合材料的合成與表征

MSNs的透射電子顯微鏡（TEM）結(jié)果如圖2A、B所示。由圖可見，所得到的MSNs大小相似且均勻，平均直徑約為55 nm，有明顯介孔存在。同時(shí)，動(dòng)態(tài)光散射（DLS）表征也進(jìn)一步驗(yàn)證了單分散MSNs 的大?。▓D2C）。用Zeta 電位分析了DNA 修飾的MSNs的組裝過程。中間產(chǎn)物MSNs-NH2納米配合物具有正的ζ電位（圖2D），作為生物門的核酸吸附在MSNs-NH2上后，核酸修飾的MSNs（MSNs-DNA）顯示出5.6 mV 的ζ電位，相比MSNs-NH2降低。這種降低是由于在修飾過程中，MSNs-NH2吸附的核酸上有大量的負(fù)磷酸基團(tuán)。DLS也進(jìn)一步驗(yàn)證了DNA修飾的MSNs成功組裝。

圖2 MSNs的TEM圖像（A、B），及MSNs、MSNs-NH2、MSNs-DNA的DLS（C）與Zeta電勢（D）Fig.2 TEM images of MSNs（A，B），DLS data（C）and Zeta potentials（D）of MSNs，MSNs-NH2 and MSNs-DNA

2.3 瓊脂糖凝膠電泳

通過聚丙烯酰胺凝膠電泳驗(yàn)證了miRNA-21 觸發(fā)釋放的機(jī)制（圖3）。未加入靶標(biāo)miRNA-21 時(shí)，HG1與HG2的雜交產(chǎn)物較少，添加5 nmol/L 靶標(biāo)后，觀察到較慢的遷移速率，這是由于miRNA-21與DNA 雜交形成了22 個(gè)堿基對。表明在靶標(biāo)的參與下，HG1、HG2 能更有效地進(jìn)行發(fā)夾組裝，實(shí)現(xiàn)對miRNA-21的高效循環(huán)擴(kuò)增。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳圖像Fig.3 Agarose gel electrophoresis images

2.4 體外FRET效應(yīng)

基于FRET的設(shè)計(jì)以及熒光供體和受體的激活，循環(huán)擴(kuò)增的納米傳感器策略在體外檢測miRNA-21靶標(biāo)時(shí)表現(xiàn)出特殊的熒光響應(yīng)。如圖4 所示，隨著靶標(biāo)miRNA-21 濃度的增高，HG1 鏈上修飾的Cy3染料于566 nm 處的熒光逐漸減弱，而HG2 鏈上修飾的Cy5 染料于668 nm 處的熒光逐漸增強(qiáng)，表明Cy3供體和Cy5受體之間存在有效的能量共振轉(zhuǎn)移，體現(xiàn)了該方法對細(xì)胞內(nèi)miRNA熒光激活成像的可行性。在0 ～30 nmol/L miRNA-21 濃度范圍內(nèi)，Cy5、Cy3 分別在668 nm 和566 nm 處的熒光響應(yīng)比值（y）與miRNA-21 濃度的對數(shù)（x）呈線性關(guān)系，線性方程為y=0.064 4x+0.087，r2=0.989 1，檢出限（S/N=3）為0.04 nmol/L，與DNA雜交的動(dòng)力學(xué)一致［24］。

圖4 不同濃度miRNA-21檢測的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of miRNA-21 detected at different concentrations

2.5 靶標(biāo)特異性驗(yàn)證

由于高滲透長滯留效應(yīng)（EPR）的存在，使得納米材料在進(jìn)入細(xì)胞時(shí)更容易滯留在腫瘤部位。為進(jìn)一步提高腫瘤靶向性，本研究在納米材料上修飾靶向腫瘤的適配體，以使納米材料有更好的靶向效果。為了評估該循環(huán)擴(kuò)增的納米傳感器的選擇性，考察了在反應(yīng)體系中不加入靶標(biāo)、加入靶標(biāo)miRNA-21、加入非靶標(biāo)miRNA-29、miRNA-155、miRNA-199 及靶標(biāo)單堿基錯(cuò)配和三堿基錯(cuò)配后的熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖5A 所示。添加各種分析物后，Cy5 與Cy3 的熒光強(qiáng)度之比如圖5B 所示。由圖可見，加入靶標(biāo)miRNA-21 后顯示出較強(qiáng)的熒光共振轉(zhuǎn)移，Cy5 染料的峰明顯增強(qiáng)，而加入其他非靶標(biāo)物質(zhì)，Cy5 與Cy3 的熒光強(qiáng)度之比較低，表明該熒光策略對靶標(biāo)miRNA-21的檢測具有良好的特異性。

圖5 Dox@MSNs-DNA對不同靶標(biāo)的響應(yīng)熒光光譜圖（A）及柱狀對比圖（B）Fig.5 Fluorescence spectra of Dox@MSNs-DNA sensor for different targets（A）and histogram comparison（B）

2.6 Dox@MSNs－ DNA的藥物釋放

考察了Dox@MSNs-DNA 作為體外藥物控釋系統(tǒng)的能力。向1 mL Dox@MSNs-DNA 復(fù)合材料體系中加入5 μL的1 μmol/L 靶標(biāo)miRNA-21溶液，使miRNA-21的終濃度為5 nmol/L。以熒光光譜儀檢測實(shí)時(shí)釋放行為（圖6A）。發(fā)現(xiàn)在480 nm激發(fā)波長下，藥物Dox于596 nm處發(fā)射出熒光，熒光強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系如圖6B 所示?？捎^察到未加入靶標(biāo)的前兩小時(shí)上清液中Dox 的熒光強(qiáng)度幾乎不變，加入靶標(biāo)后，熒光逐漸增強(qiáng)，表明藥物被逐漸釋放。實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明，隨著靶標(biāo)與介孔硅納米外層封裝DNA的不斷雜交，封裝的藥物可進(jìn)行有效地控制釋放。一段時(shí)間后，藥物釋放的熒光減弱，可能是從介孔中釋放的藥物進(jìn)入了雜交DNA 的四鏈體部位，從而使得上清液中檢測到的Dox 的濃度下降。結(jié)果表明，miRNA在孔打開和誘導(dǎo)藥物可控釋放中起關(guān)鍵作用。

圖6 Dox@MSNs-DNA在不同時(shí)間釋藥的熒光光譜（A）及隨時(shí)間的釋藥曲線（B）Fig.6 Fluorescence spectra of Dox@MSNs-DNA at different drug release times（A）and drug release curve over time（B）

3 結(jié) 論

本研究設(shè)計(jì)并制備了一種新型的單分散Dox@MSNs-DNA，用于腫瘤標(biāo)志物的高靈敏檢測及其觸發(fā)的藥物按需釋放。該載藥系統(tǒng)以介孔二氧化硅納米顆粒為生物活性分子的載體，在介孔中裝載藥物的同時(shí)對材料表面進(jìn)行DNA 功能化。在腫瘤標(biāo)記物miRNA-21 的刺激下，兩條鏈上的熒光團(tuán)由于距離的拉近激活FRET 信號，產(chǎn)生熒光信號放大，從而實(shí)現(xiàn)了對miRNA-21的超靈敏熒光激活成像。材料表面功能化的DNA 作為防止Dox 釋放的DNA 門，使該藥物傳遞系統(tǒng)具有更準(zhǔn)確的釋放性能。此外，基于對材料的改性和修飾，該硅基納米材料還可以對其他藥物進(jìn)行輸送和生物靶向可控釋放，為隨需應(yīng)變給藥系統(tǒng)的發(fā)展開辟了新的前景，在癌癥治療方面具有巨大的潛力。