吳云飛 張智慧 陳旭源 梁鴻章 李軍 劉南波 吳旭

(1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科，四川 瀘州 646000；2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院胸外科；3喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院胸外科；4南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院胸外科；5 廣東省人民醫(yī)院胸外科；6南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院胸外科/惠僑醫(yī)療中心)

食管癌是我國高發(fā)病率、高死亡率的惡性腫瘤之一，早期可通過手術(shù)或手術(shù)為主的綜合治療；而晚期食管癌缺乏有效治療手段，靶向治療是食管癌的一種新治療手段〔1,2〕。研究表明lncRNA可預(yù)測多種惡性腫瘤的發(fā)生或預(yù)后，并可成為一類新的腫瘤標(biāo)志物及潛在的治療靶標(biāo)〔3〕。長的基因間非編碼RNA00707(LINC00707)是一種lncRNA，研究報(bào)道LINC00707在胃癌和肺腺癌組織中均過表達(dá)，且與胃癌、肺腺癌患者的晚期、腫瘤較大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后較差有關(guān)；LINC00707促進(jìn)了胃癌、肺腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移〔4，5〕。敲低LINC00707可顯著降低肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔6〕。LINC00707通過miR-206/FMNL2軸促進(jìn)大腸癌的細(xì)胞增殖和侵襲〔7〕，表明LINC00707不僅影響患者預(yù)后，還參與調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，然而LINC00707對食管癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及機(jī)制尚不清楚。研究報(bào)道癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞源性miR-382-5p促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的遷移和侵襲〔8〕。miR-382-5p可能通過靶向癌基因YBX1來抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲〔9〕。生物學(xué)在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)LINC00707與miR-382-5p有結(jié)合位點(diǎn)。而LINC00707與miR-382-5p是否有靶向關(guān)系尚未可知。本實(shí)驗(yàn)旨在研究LINC00707對食管癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選取西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2017年1月至2020年12月51例食管癌患者，通過手術(shù)取其癌組織及癌旁正常組織(離癌組織邊緣2 cm)，所有患者經(jīng)病理檢測確診為食管癌，術(shù)前未進(jìn)行過放化療，所有患者知情且同意。

1.2主要試劑 食管癌細(xì)胞EC9706(美國ATCC)；RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco)；Trizol試劑(美國GENMED)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(日本Takara)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法試劑盒、凋亡檢測試劑盒(日本同仁研究所)；蛋白提取試劑盒(北京百奧萊博)；Bax、Bcl-2和GAPDH抗體(美國Abbiotec)；山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(HRP)(美國GeneCopoeia)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(美國AAT Bioquest)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 食管癌細(xì)胞EC9706用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，將LINC00707干擾載體質(zhì)粒及陰性對照、miR-382-5p模擬物、抑制劑及其陰性對照分別轉(zhuǎn)染至EC9706細(xì)胞，記為si-LINC00707組、si-NC組、miR-382-5p組、miR-NC組、anti-miR-382-5p組、anti-miR-NC組；將LINC00707干擾載體質(zhì)粒與miR-382-5p抑制劑共轉(zhuǎn)染至EC9706細(xì)胞，記為si-LINC00707+anti-miR-382-5p組；正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照(con)組。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測LINC00-707和miR-382-5p的表達(dá)水平 提取食管癌組織、癌旁組織及各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說明進(jìn)行PCR，相對表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。以GAPDH和U6為內(nèi)參，LINC00707上游引物序列：5'-CCAACAGGGTATCAGAATTCTC-3'，下游引物序列：5'-TGCTGACAATAGCCATTAGG-3'；GAPDH上游引物序列：5'-TGGCCCGAAACCTCTACTG-3'，下游引物序列：5'-GCACACTCGATTTTAGGGTTCT-3'；miR-382-5p上游引物序列：5'-ATCCGTGAAGTTGTTCGTGG-3'，下游引物序列：5'-TATGGTTGTAGAGGACTCCTTGAC-3'；U6上游引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，下游引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'。

1.5MTT比色法檢測細(xì)胞增殖活性 各組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，每孔分別加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，每孔加入二甲基亞砜150 μl，振蕩反應(yīng)10 min使沉淀溶解，用酶標(biāo)儀于波長490 nm處檢測吸光度(OD)值。

1.6克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成數(shù) 將各組細(xì)胞消化后加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，以每孔100個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)2 w左右，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，然后用甲醇固定細(xì)胞，再加入吉姆薩染色液，染色30 min，最后在顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 用不含乙二胺四乙酶(EDTA)的胰酶消化各組細(xì)胞，離心收集，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞；加入300 μl結(jié)合緩沖液，加入5 μl Annexin V-FITC和PI，混勻、避光室溫孵育15 min；上機(jī)前補(bǔ)加 200 μl結(jié)合緩沖液，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.8劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移距離 各組細(xì)胞消化后接種在培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至鋪滿培養(yǎng)板后，用槍頭在板中間直線劃痕，用PBS沖洗劃下的多余細(xì)胞，換液后繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)0和24 h拍照觀察，計(jì)算遷移距離。

1.9Western印跡檢測蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，以40 μg/孔上樣蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，然后轉(zhuǎn)膜，再進(jìn)行封閉1 h，洗膜后分別加入Bax、Bcl-2和GAPDH抗體(1∶800)，4℃孵育過夜；洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h；電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，顯影、定影。Quantity-One軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算蛋白的相對表達(dá)量。

1.10雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建LINC00707的野生型和突變型熒光素酶載體，將其分別與miR-NC和miR-382-5p共轉(zhuǎn)染至EC9706細(xì)胞中，按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析及Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1LINC00707和miR-382-5p在食管癌組織和各處理組細(xì)胞中的表達(dá) 與癌旁正常組織(0.98±0.13、0.99±0.11)相比，食管癌組織中LINC00707表達(dá)水平(3.84±0.35)顯著升高，miR-382-5p表達(dá)水平(0.33±0.04)顯著降低(P<0.05)；LINC00707和miR-382-5p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(圖1)。與con組(1.00±0.01、1.00±0.00)和si-NC組(0.99±0.03、1.00±0.01)相比，si-LINC00707組LINC00707表達(dá)水平(0.23±0.03)顯著降低，miR-382-5p表達(dá)水平(3.81±0.12)顯著升高(P<0.05)；與miR-NC組(1.00±0.02)相比，miR-382-5p組miR-382-5p表達(dá)水平(4.38±0.15)顯著升高(P<0.05)；與anti-miR-NC組(1.01±0.01)相比，anti-miR-382-5p組miR-382-5p表達(dá)水平(0.14±0.01)顯著降低(P<0.05)；與si-LINC00707組相比，si-LINC00707+anti-miR-382-5p組miR-382-5p表達(dá)水平(1.25±0.08)顯著降低(P<0.05)。

圖1 LINC00707和miR-382-5p負(fù)相關(guān)

2.2各處理組對EC9706細(xì)胞活性和克隆形成的影響 與con組和si-NC組相比，si-LINC00707組EC9706細(xì)胞活性降低，克隆形成數(shù)顯著減少(P<0.05)；與miR-NC組相比，miR-382-5p組EC9706細(xì)胞活性顯著降低，克隆形成數(shù)顯著減少(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-382-5p組EC9706細(xì)胞活性升高，克隆形成數(shù)增加(P<0.05)；與si-LINC00707組相比，si-LINC00707+anti-miR-382-5p組EC9706細(xì)胞活性升高，克隆形成數(shù)增加(P<0.05)，見表1。

表1 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測各處理組EC9706中克隆形成數(shù)

2.3各處理組對EC9706凋亡的影響 與con組和si-NC組相比，si-LINC00707組EC9706細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與miR-NC組相比，miR-382-5p組EC9706細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-382-5p組EC9706細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與si-LINC00707組相比，si-LINC00707+anti-miR-382-5p組EC9706細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖2，表2。

圖2 各個(gè)處理組對細(xì)胞凋亡率的影響

2.4各處理組對EC9706遷移的影響 與con組和si-NC組相比，si-LINC00707組EC9706細(xì)胞遷移距離顯著縮短(P<0.05)；與miR-NC組相比，miR-382-5p組EC9706細(xì)胞遷移距離顯著縮短(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-382-5p組EC9706細(xì)胞遷移距離顯著增大(P<0.05)；與si-LINC00707組相比，si-LINC00707+anti-miR-382-5p組EC9706細(xì)胞遷移距離顯著增大(P<0.05)，見表2。

表2 流式細(xì)胞儀檢測各處理組EC9706凋亡率

2.5各處理組對EC9706中凋亡蛋白表達(dá)的影響 與con組和si-NC組相比，si-LINC00707組EC9706細(xì)胞中Bax表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與miR-NC組相比，miR-382-5p組EC9706細(xì)胞中Bax表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-382-5p組EC9706細(xì)胞中Bax表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與si-LINC00707組相比，si-LINC00707+anti-miR-382-5p組EC9706細(xì)胞中Bax表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖3，表3。

1～8：con組、si-NC組、si-LINC00707組、miR-NC組、miR-382-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-382-5p組、si-LINC00707+anti-miR-382-5p組圖3 各處理組細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的檢測

表3 Western印跡檢測各處理組EC9706中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

2.6雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測LINC00707和miR-382-5p靶向關(guān)系 LINC00707和miR-382-5p互補(bǔ)序列見圖4；WT-LINC00707與miR-382-5p共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而MUT-LINC00707與miR-382-5p共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)，見表4。

圖4 LINC00707和miR-382-5p互補(bǔ)序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

3 討 論

食管癌是最常見的胃腸道惡性疾病之一，其發(fā)病率相對較高，且逐年增加。因此，對食管癌致癌作用的分子機(jī)制研究及新的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)的確定對于目前食管癌的治療非常有益〔10,11〕。而非編碼RNA可作為食管癌預(yù)后因素和治療靶點(diǎn)〔12〕。研究報(bào)道LINC00707的沉默減弱了透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力〔13〕。敲低LINC00707通過miR-30c/CTHRC1抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，侵襲和遷移〔14〕。敲低LINC00707可通過與miR-485-5p結(jié)合來抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖〔15〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示LINC00707可能在食管癌中起促癌作用。干擾LINC00707表達(dá)后，EC9706細(xì)胞活性降低，克隆形成數(shù)減少，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞遷移距離縮短，Bax表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低；表明干擾LINC00707可抑制食管癌EC9706細(xì)胞增殖、克隆形成及遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

研究報(bào)道m(xù)iR-382-5p通過靶向抑制NF90抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡〔16〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá)miR-382-5p可抑制食管癌EC9706細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而抑制miR-382-5p表達(dá)與過表達(dá)miR-382-5p的作用相反。研究報(bào)道LINC00265通過靶向miR-382-5p介導(dǎo)SAT1和VAV3來促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲〔17〕。lncRNA SNHG14通過使miR-382-5p海綿化來調(diào)節(jié)SPIN1表達(dá)以促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展〔18〕。表明lncRNA可調(diào)控miR-382-5p影響腫瘤進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，LINC00707可能通過調(diào)控miR-382-5p影響食管癌細(xì)胞進(jìn)展。

綜上，干擾LINC00707可能通過上調(diào)miR-382-5p抑制食管癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。