安禎祥 何遠利 黃丹 唐東昕 王敏 王芳

(貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001)

肝纖維化(HF)是細胞外基質(ECM) 異常增生與過度沉積所導致的肝組織結構和功能異常的病理變化〔1〕。HF是各種慢性肝病向肝硬化、肝癌發(fā)展的重要環(huán)節(jié)〔2〕。HF可逆轉，而肝硬化失代償期很難逆轉，因此HF的逆轉治療是肝病治療關鍵環(huán)節(jié)。HF的分子病理生理機制研究方興未艾，但是針對肝星狀細胞(HSC)的研究一直都是熱點和重點〔3〕。HSC活化后表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)，大量合成分泌ECM，促進HF形成，因此HSC的激活是HF發(fā)生至關重要的節(jié)點。中藥治療HF有療效肯定，多途徑、多環(huán)節(jié)和多靶位的作用機制是其優(yōu)勢。通過中藥尋找抗HF藥物是目前研究的熱點〔4〕。赤水金釵石斛是貴州省道地藥材，為滋陰要藥。金釵石斛多糖(DNP)是從多年生蘭科植物金釵石斛中提取的多糖類物質，安全、毒性低〔5〕，具有調(diào)節(jié)免疫、保肝、抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用〔6〕。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，DNP能降低HF大鼠血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、肝纖四項水平，降低丙二醛(MDA)水平，提高超氧化物歧化酶(SOD)含量，下調(diào)轉化生長因子(TGF)-β1、基質金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1 mRNA表達，上調(diào)基質金屬蛋白酶(MMP)13 mRNA 表達，具有拮抗HF的作用〔7,8〕。本研究通過復制大鼠HF模型，檢測大鼠肝組織與HF進展關系密切的TGF-β1、α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達，探討DNP抗HF的作用機制。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級SD大鼠，雌雄各半，體重(180±20)g,購自重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司，動物許可證號:SCXK(渝)2012-0005，合格證號No 0004866。

1.2藥品及試劑 金釵石斛生藥購自貴州赤水，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學藥學院生藥實驗室王祥培教授鑒定為金釵石斛Dendrobium nobile的莖；經(jīng)過干燥，采用水提醇沉法提取多糖〔9〕(貴州中醫(yī)藥大學一附院制劑中心制備)，濃度2 g/ml；秋水仙堿片(云南玉溪生物制藥，批號H53021904)；扶正化瘀膠囊(上海黃海制藥，批號Z200220073)；四氯化碳(天津市光復科技發(fā)展有限公司，批號20120506)；TGF-β1抗體(美國immunoway公司，批號YM3438)；α-SMA抗體 (美國immunoway公司，批號YT5053)；Ⅰ型膠原抗體(美國Proteintech公司，批號14695-1-AP)；Ⅲ型膠原抗體(北京博奧森生物技術有限公司，批號bs-0549R)；免疫組化染色試劑盒(河南賽諾特生物技術有限公司)；Trizol 試劑、聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒及逆轉錄試劑盒均購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3主要儀器 BX51顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；CFX96 Real-Time System熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；NANODROP 2000紫外分光光度計(美國Therno scientific公司)；低溫高速離心機Heraeus Multifuge X1R(美國賽默飛世爾公司)。

1.4分組、造模、給藥及采樣 大鼠按性別隨機分為:正常組、模型組、秋水仙堿組(0.2 mg/kg)，扶正化瘀組(0.415 g/kg)，DNP低、中、高劑量組(5、10、20 g/kg)，考慮造模存在大鼠死亡情況，正常組為10只，其余各組各12只。采用文獻方法造?！?0〕，50%四氯化碳(CCL4)橄欖油溶液(1.5 ml/kg)腹腔注射，2次/w，第2周開始30%酒精(10 ml/kg)灌胃，隔日1次。正常組予等量橄欖油腹腔注射和生理鹽水灌胃。造模8 w。第9周起分別給予對應藥物(10 ml/kg)灌胃，1次/d,給藥4 w，正常組及模型組灌胃生理鹽水。每周按體重改變藥物劑量。給藥結束后采樣，禁食12 h，處死大鼠，取肝臟組織行蘇木素-伊紅(HE)、Masson染色、組化、PCR檢查。

1.5病理學檢查 肝組織甲醛固定，石蠟包埋切片，HE、Masson染色，光鏡下觀察病理組織學變化。用Image J軟件計算肝纖維組織膠原容積分數(shù)(膠原陽性的藍色面積與組織總面積的百分比)。

1.6免疫組化法檢測肝組織中TGF-β1、α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達 石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度酒精水化，微波抗原修復，3 %H2O2室溫去除內(nèi)源性過氧化物酶，羊血清封閉，加一抗TGF-β1(1∶400)、α-SMA(1∶100)、Ⅰ(1∶1 000)、Ⅲ(1∶400)型膠原，4℃冰箱過夜，加二抗工作液，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水、透明、中性樹膠封片，光鏡下采集圖片。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。以表達棕黃色為陽性，以不著色為陰性。使用Image J軟件計算蛋白表達的平均光密度值進行統(tǒng)計分析。

1.7qRT-PCR檢測肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原 mRNA表達 Trizol法提取樣本總RNA，測定RNA濃度，檢測RNA完整性,逆轉錄為cDNA。PCR反應體系:SYBR Green Ⅰ 10 μl，上游引物0.75 μl，下游引物0.75 μl，ddH2O 12.5 μl，cDNA 1 μl。將各反應管放入PCR 儀。引物由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。引物序列：Ⅰ型膠原蛋白(167 bp)：上游5'-CAGTGGCGGTTATGACTTCAG-3'，下游5'-GGCTGCGGATGTTCTCAATC-3'；Ⅲ型膠原蛋白(224 bp)：上游5'-GCCTTCTACACCTGCTCCT-3'，下游5'-CCACTCCAGACTTGACATCATAT-3'；GAPDH(252 bp)：上游5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'，下游5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。擴增條件：95℃ 30 s，95℃5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法來計算目的基因mRNA的相對含量。

1.8統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析、LSD檢驗。

2 結 果

2.1HE染色結果 正常組肝小葉結構完整，無明顯的纖維組織增生。與正常組比較，模型組肝索排列紊亂，肝細胞變性、壞死，見大量炎細胞浸潤，明顯的纖維組織增生，正常肝小葉結構破壞。與模型組比較，DNP低、中、高劑量組、秋水仙堿組、扶正化瘀組的纖維化有不同程度的減輕。見圖1。

圖1 DNP對HF大鼠肝組織病理學變化的影響(HE，×200)

2.2Masson染色情況 正常組肝小葉結構完整，匯管區(qū)和中央靜脈區(qū)有少許藍染膠原纖維。與正常組比較，模型組匯管區(qū)、中央靜脈區(qū)見大量增粗、增大藍染膠原纖維，纖維間隔明顯增大、變寬。與模型組比較，各給藥組藍染膠原纖維變細、變小，纖維間隔縮小、變窄。見圖2。正常組比較，模型組膠原容積分數(shù)明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組膠原容積分數(shù)均有明顯減少(P<0.01)；與秋水仙堿組比較，DNP高劑量組膠原容積分數(shù)顯著減少(P<0.05)；與扶正化瘀組比較，DNP中、高劑量組膠原容積分數(shù)顯著減少(P<0.05)。見表1。

圖2 DNP對HF大鼠肝組織病理學變化的影響(Masson，×200)

表1 DNP對HF大鼠肝組織膠原容積分數(shù)、TGF-β1、α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達的影響

2.3DNP對HF大鼠肝組織TGF-β1、α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響 正常組肝組織匯管區(qū)和中央靜脈區(qū)見少量TGF-β1、α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達。與正常組比較，模型組TGF-β1、α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白著色明顯加深、增多，具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，TGF-β1多分布于胞漿、匯管區(qū)，α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白多見于匯管區(qū)，與膠原纖維的分布呈一致性；與模型組比較，各給藥組TGF-β1、α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白著色面積均有明顯減少、降低，具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；與秋水仙堿組比較，DNP中、高劑量組TGF-β1、α-SMA蛋白表達無差異(P>0.05)，DNP高劑量組Ⅰ、Ⅲ型膠原表達無差異(P>0.05)；與扶正化瘀組比較，DNP高劑量組TGF-β1蛋白表達有差異(P<0.05)，DNP中、高劑量組α-SMA蛋白表達無差異(P>0.05)，DNP高劑量組Ⅰ型膠原表達有差異(P<0.05)，DNP中、高劑量組Ⅲ型膠原表達無差異(P>0.05)。見表1、圖3～6。

圖3 DNP對HF大鼠肝組織TGF-β1蛋白表達的影響(免疫組化，×200)

圖4 DNP對HF大鼠肝組織α-SMA蛋白表達的影響(免疫組化，×200)

圖5 DNP對HF大鼠肝組織Ⅰ型膠原蛋白表達的影響(免疫組化，×200)

圖6 DNP對HF大鼠肝組織Ⅲ膠原蛋白表達的影響(免疫組化，×200)

2.4DNP對HF大鼠肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達的影響 與正常組比較，模型組Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組Ⅰ型膠原mRNA表達均有明顯下降(P<0.05),Ⅲ型膠原除外DNP小劑量組外，其余各給藥組亦有明顯下降(P<0.01)；與秋水仙堿組、扶正化瘀組比較，DNP各組相比Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1。

3 討 論

HF屬中醫(yī)“肝積”“積聚”“脅痛”等范疇。HF時肝細胞壞死增加，修復能力下降，肝星狀細胞激活，增殖能力上升，分泌合成大量間質，肝細胞與肝星狀細胞關系失調(diào)。因此在治療上需要加強肝細胞自身修復能力，抑制肝星狀細胞活化。在HF過程中，肝腎陰虛是其重要證型，養(yǎng)陰柔肝是重要的治療法則〔11～17〕。HF以ECM的過度沉積為主要特征，Ⅰ、Ⅲ型膠原是ECM的主要成分，因而調(diào)控膠原代謝則影響HF的進程。秋水仙堿可增加Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的降解，具有抗HF的作用〔18〕，扶正化瘀膠囊能調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad通路，影響Ⅰ型前膠原和α-SMA的表達而抗肝纖維化，故設置秋水仙堿和扶正化瘀膠囊為對照。肝組織病理檢查仍然是診斷肝纖維化的金標準。本研究通過四氯化碳聯(lián)合灌胃酒精8 w，HE、Masson染色，模型組可見明顯的纖維組織增生，正常肝小葉結構破壞，形成假小葉。DNP干預后肝組織纖維化均有不同程度的減輕，說明DNP具有一定的抗肝纖維化作用。

HSC激活增殖，合成分泌大量ECM，是HF時ECM的主要細胞來源，是HF的細胞學基礎〔19，20〕。在HF形成過程中，肝細胞旁分泌的TGF-β1可結合HSC表面的相應受體，活化HSC，特異性表達α-SMA，上調(diào)ECM表達，活化的HSC又可自分泌TGF-β1，進一步激活HSC，通過肝細胞的旁分泌、HSC的自分泌形成正反饋，大量合成分泌ECM，誘導HF形成〔3〕。TGF-β1是HSC活化的關鍵細胞因子，TGF-β1促進HSC合成ECM，減少ECM的降解，加速HF的發(fā)展進程〔21〕。亦可通過TGF-β1/Smad信號通路調(diào)控HSC增殖活化，影響ECM的沉積。ECM持續(xù)過度沉積，肝臟結構破壞，形成假小葉，影響肝臟循環(huán)系統(tǒng)，進而發(fā)展成肝硬化。ECM以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主，HF早期以Ⅲ型膠原增加明確，后期主要是Ⅰ型膠原增加，主要沉積于匯管區(qū)〔22，23〕。Ⅰ、Ⅲ型膠原是膠原代謝的重要參數(shù)，是判斷抗肝纖維化藥物療效的依據(jù)。α-SMA多表達于纖維間隔、匯管區(qū)，α-SMA表達上升提示HSC活化〔24,25〕，細胞體外實驗表明，HSC合成ECM的量是肝細胞的10多倍，是竇狀隙內(nèi)皮細胞的20余倍〔4〕。檢測TGF-β1、α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型膠原在肝組織的表達，可判斷肝纖維化的程度〔26,27〕。因此抑制TGF-β1、α-SMA、Ⅰ、Ⅲ膠原蛋白的表達，是抗HF的重要節(jié)點。