劉莉芳,羅麗飛，陳宇龍，高澤霞,3

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北省名優(yōu)魚(yú)育種與健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，武漢 430070；2.湖北洪山實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070； 3.長(zhǎng)江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，武漢 430070

雌激素(estrogen)是促進(jìn)性腺發(fā)育和維持生殖功能必不可少的類(lèi)固醇激素，也在調(diào)節(jié)能量代謝和生長(zhǎng)發(fā)育方面起著關(guān)鍵的作用[1-2]。在魚(yú)類(lèi)中，已有研究表明雌二醇 (estrogen 2，E2)可通過(guò)GH/IGF軸調(diào)控IGF的表達(dá)，也可通過(guò)雌激素受體(estrogen receptor，ER)調(diào)控IGF的表達(dá)從而影響生長(zhǎng)發(fā)育[3]。ER是介導(dǎo)雌激素在多個(gè)組織器官中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵受體[4-5]。哺乳動(dòng)物只有ERα和ERβ兩個(gè)雌激素受體基因[6]。由于基因組復(fù)制，多數(shù)硬骨魚(yú)具有ERα、ERβ1和ERβ2三個(gè)雌激素受體基因[7-9]。

團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)，是中國(guó)特有的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。自1960年推廣養(yǎng)殖至今，已成為中國(guó)第六位大宗養(yǎng)殖淡水魚(yú)類(lèi)[10]。目前，關(guān)于雌激素受體與團(tuán)頭魴生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系尚未報(bào)道。因此，本研究克隆獲得了雌激素受體基因(ERα、ERβ1和ERβ2)的核心序列，并對(duì)其在3個(gè)年齡段的團(tuán)頭魴生長(zhǎng)快慢個(gè)體肌肉和性腺組織中的表達(dá)情況進(jìn)行定量分析，以期為研究雌激素受體基因在調(diào)節(jié)生長(zhǎng)與生殖發(fā)育過(guò)程中的潛在影響提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用的團(tuán)頭魴人工繁殖樣品來(lái)自湖北省黃岡市百榮水產(chǎn)良種公司。其中，挑選出同一家系中3個(gè)年齡段的團(tuán)頭魴：1齡(性腺未成熟)團(tuán)頭魴、2齡(性腺初次成熟)團(tuán)頭魴、3齡(性腺第2次成熟)團(tuán)頭魴。在不同年齡段中，各選取6尾生長(zhǎng)快(fast growth， FG)的和生長(zhǎng)慢(slow growth， SG)的團(tuán)頭魴(雌雄各3尾)，其生長(zhǎng)數(shù)據(jù)見(jiàn)圖1。魚(yú)體經(jīng)100 mg/L MS-222(Tricaine methanesulfonate)麻醉后，冰上采集肌肉、性腺組織，液氮速凍后轉(zhuǎn)至-80 ℃保存。

FG代表快速生長(zhǎng)組，SG代表慢速生長(zhǎng)組；FG和SG之間的顯著性差異由*(P<0.05)、 **(P<0.01)、***(P<0.001)表示。FG stands for fast-grow group,SG stands for slow-grow group; the The significant difference between FG and SG is represented by * (P <0.05), ** (P<0.01), *** (P<0.001) respectively.

1.2 總RNA提取及cDNA合成

采用Trizol法(TaKaRa，大連)提取總RNA，并用瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop 2000核酸蛋白儀(Thermo，美國(guó))分別檢測(cè)總RNA完整性和濃度。按照HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒(Vazyme，南京)說(shuō)明書(shū)合成cDNA的第一條鏈，稀釋5倍后保存于-20 ℃待用。

1.3 團(tuán)頭魴ER基因克隆

通過(guò)NCBI下載斑馬魚(yú)ER基因的cDNA序列，與筆者所在課題組已獲得的團(tuán)頭魴轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行Blast，獲得多個(gè)ER基因亞型片段。利用NCBI的primer design tool (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)用于拼接的引物(表1)，引物由武漢擎科生物科技有限公司合成。以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，將條帶單一的擴(kuò)增產(chǎn)物送武漢擎科生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序獲得的目的基因片段用Mega 6.0軟件進(jìn)行拼接，并與斑馬魚(yú)基因序列進(jìn)行比對(duì)，確定團(tuán)頭魴各ER基因亞型的核心序列。

表1 基因克隆引物 Table 1 Primers for gene clone

1.4 團(tuán)頭魴ER基因分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

通過(guò)NCBI的ORF finder程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析團(tuán)頭魴ERβ1基因的開(kāi)放閱讀框信息。使用ProtPara程序(https://web.expasy.org/protparam/)分析ERβ1的分子質(zhì)量及等電點(diǎn)等理化性質(zhì)，同時(shí)使用DNAman軟件對(duì)團(tuán)頭魴ERβ1基因與其他脊椎動(dòng)物進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。使用Mega 6.0軟件構(gòu)建ER基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 qRT-PCR

基于獲得的團(tuán)頭魴ER基因序列信息，利用NCBI的primer design tool設(shè)計(jì)定量引物(表2)，并由武漢擎科生物科技有限公司合成。選擇團(tuán)頭魴β-actin作為內(nèi)參基因，以團(tuán)頭魴3個(gè)年齡階段2個(gè)組織的cDNA為模板，按照Hieff? qPCR SYBR Green Master Mix(Low Rox)試劑盒(翊圣，上海)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。

表2 qRT-PCR引物 Table 2 Primers of qRT-PCR

1.6 數(shù)據(jù)分析

各基因的相對(duì)表達(dá)水平以2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算，使用SPSS Statistics 22和GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。將P>0.05描述為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(用“ns”表示)，P<0.05描述為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(用“*”表示)，P<0.01描述為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(用“**”表示)，P<0.001描述為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(用“***”表示)。

2 結(jié)果與分析

2.1 團(tuán)頭魴ER理化性質(zhì)分析

利用同源克隆拼接核心序列，獲得了部分團(tuán)頭魴ERα和ERβ2的CDS(coding sequencing)序列，以及團(tuán)頭魴ERβ1基因的完整的CDS序列。ProtParam軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，團(tuán)頭魴ERβ1基因的開(kāi)放閱讀框?yàn)? 704 bp，其編碼的蛋白質(zhì)由567個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，分子質(zhì)量為63.75 ku，理論等電點(diǎn)(pI)為7.54，為堿性蛋白。氨基酸殘基中Leu(11.6%)、Ser(10.8%)、Pro(6.2%)、Glu(5.8%)、Gly(5.8%)的頻率較高，極性氨基酸占59.6%，非極性氨基酸占40.4%(圖2)。消光系數(shù)(M-1cm-1γ=280 nm)為62.225，其不穩(wěn)定系數(shù)為61.78，屬不穩(wěn)定蛋白。疏水指數(shù)為77.72，平均親水性為-0.30，屬可溶性蛋白。

2.2 團(tuán)頭魴ER同源性分析

使用DNAman軟件對(duì)人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、雞(Gallusgallus)、團(tuán)頭魴及其他魚(yú)類(lèi)ER氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，并使用Mega軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示，團(tuán)頭魴ERβ1蛋白的氨基酸序列與鯉(88.43%)、金魚(yú)(87.37%)和斑馬魚(yú)(86.39%)具有較高的同源性，與大西洋鮭(66.72%)、日本青鳉(65.14%)和大黃魚(yú)(62.06%)具有中度同源性，與小鼠(50.96%)、非洲爪蟾(50.87%)、歐亞野豬(50.00%)、雞(47.99%)和人(46.95%)具有低度同源性(圖3)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中ERα和ERβ亞型各聚成一類(lèi)，形成兩大分支。團(tuán)頭魴ER基因各亞型分別與鯉、金魚(yú)和斑馬魚(yú)中相應(yīng)亞型的同源性較高，在進(jìn)化樹(shù)中距離最近(圖4)。

圖2 ERβ1氨基酸頻率分布圖Fig.2 Amino acid frequency distribution of ERβ1

a：鯉Cyprinus carpio； b：金魚(yú) Carassius auratus； c：斑馬魚(yú) Danio rerio；d：大西洋鮭 Salmo salar；e：日本青鳉 Oryzias latipes；f：大黃魚(yú) Larimichthys crocea；g：小鼠 Mus musculus；h：非洲爪蟾 Xenopus tropicalis；i：歐亞野豬 Sus scrofa；j：雞 Gallus gallus；k：人 Homo sapiens.

2.3 ER基因在生長(zhǎng)快慢個(gè)體各組織中的表達(dá)

1)雌激素受體基因在肌肉中的表達(dá)。在1齡到3齡團(tuán)頭魴肌肉中，ERα和ERβ1在生長(zhǎng)快組(FG)中的表達(dá)量整體高于生長(zhǎng)慢組(SG)(P<0.05)，并且ERα在1齡FG組和SG組團(tuán)頭魴中的表達(dá)量差異比2齡和3齡團(tuán)頭魴更為明顯(P<0.05)。然而，ERβ2在FG組和SG組團(tuán)頭魴中的表達(dá)量差異與ERα和ERβ1相反(P<0.05)。在3齡雄性團(tuán)頭魴中，ERβ2在FG組中的表達(dá)量顯著高于SG組(P<0.001)(圖5)。

團(tuán)頭魴ERβ2為部分CDS序列 Megalobrama amblycephala ERβ2 is part of the CDS sequence.圖4 基于氨基酸序列的ER基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of ER genes based on their amino acid sequences

2)雌激素受體基因在性腺中的表達(dá)。在1齡和2齡雌性團(tuán)頭魴中，雌激素受體基因ERα、ERβ1和ERβ2在FG組的表達(dá)量顯著高于SG組。在雄性團(tuán)頭魴中，ERα在1齡FG組的性腺中的表達(dá)量高于SG組；在2齡階段，F(xiàn)G組的性腺中的表達(dá)量低于SG；在3齡階段，F(xiàn)G組的性腺中的表達(dá)量高于SG組。1齡和2齡雄性團(tuán)頭魴性腺中，ERβ2在FG組的表達(dá)量顯著低于SG組，但在3齡雄性性腺中，ERβ2在FG組的表達(dá)量顯著高于SG組。

A：ERα，B：ERβ1，C：ERβ2；FG：快速生長(zhǎng)組，SG：慢速生長(zhǎng)組；FG與SG之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異由“ns”(P>0.05)，“*”(P<0.05)，“**”(P<0.01)，“***”(P<0.001)表示。下同。 FG stands for fast-grow group,SG stands for slow-grow group; the significant difference between FG and SG was represented by “ns”(P>0.05)，“*”(P<0.05)，“**”(P<0.01)，“***”(P<0.001),respectively.The same as below.

A：ERα； B：ERβ1； C：ERβ2.圖6 雌激素受體基因在性腺中的表達(dá)Fig.6 Expression of estrogen receptor genes in the gonad tissue

3 討 論

同源性在一定程度上反映了物種之間的親緣關(guān)系，本研究中團(tuán)頭魴ER基因與鯉科魚(yú)類(lèi)同源性較高，與其他科魚(yú)類(lèi)次之，與其他脊椎動(dòng)物同源性較低。說(shuō)明ER基因同源性高低與物種親緣關(guān)系有關(guān)，在親緣關(guān)系接近的物種中具有較高的同源性，奧利亞羅非魚(yú)的同源性比對(duì)結(jié)果證實(shí)了這一推測(cè)[11]。本研究中系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明ERα和ERβ亞型分成2類(lèi)。ERβ亞型中ERβ1和ERβ2各聚成一類(lèi)，與張民等[12]對(duì)海水青鳉的研究結(jié)果一致。

已有研究表明，莫桑比克羅非魚(yú)(Oreochromismossambicus)在性腺切除術(shù)后出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩的現(xiàn)象，在異位性腺移植后生長(zhǎng)恢復(fù)[13],表明內(nèi)源雌激素一定程度上促進(jìn)了魚(yú)體生長(zhǎng)，這種促進(jìn)作用主要通過(guò)ER介導(dǎo)，推測(cè)ERs表達(dá)上調(diào)對(duì)于性腺已發(fā)育成熟的團(tuán)頭魴具有一定的促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。因此，我們挑選不同年齡階段中生長(zhǎng)快(FG)和生長(zhǎng)慢(SG)的團(tuán)頭魴，檢測(cè)了雌激素受體基因ERα、ERβ1和ERβ2在肌肉和性腺組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在性腺發(fā)育早期(1齡團(tuán)頭魴)，ERα在FG組的性腺和肌肉中的表達(dá)量顯著高于SG組(P<0.05)，但是在FG組和SG組的肌肉中，ERα的表達(dá)量差異顯著高于在性腺中的表達(dá)量差異(P<0.001)。表明在性腺早期發(fā)育過(guò)程中，ERα更傾向于在生長(zhǎng)方面而不是性腺方面發(fā)揮作用。在性腺發(fā)育成熟時(shí)期(2齡團(tuán)頭魴)，ERα在FG組和SG組中的表達(dá)量差異在性腺中更明顯。該結(jié)果表明，在性腺中期發(fā)育過(guò)程中，ERα更傾向于在性腺發(fā)育方面發(fā)揮作用；并且ERβ1替代了ERα在生長(zhǎng)方面的作用。在性腺發(fā)育成熟后(3齡團(tuán)頭魴)，ERα和ERβ1同時(shí)在生長(zhǎng)方面發(fā)揮作用，但是ERβ1只在雄性個(gè)體中發(fā)揮作用，而ERα在雄性和雌性個(gè)體中均發(fā)揮作用。此外，ERβ2與ERα、ERβ1的表達(dá)結(jié)果相反，在性腺發(fā)育早期和中期，ERβ2在雄性FG組的肌肉和性腺中表達(dá)量顯著低于SG組，但是在性腺發(fā)育早期的雌性個(gè)體中，ERβ2在FG組的性腺中的表達(dá)量顯著高于SG組，與肌肉中的結(jié)果相反(P<0.05)。其結(jié)果表明ERβ2的作用與ERα和ERβ1相反，在性腺發(fā)育早期和中期，對(duì)生長(zhǎng)起到抑制作用。因此我們推測(cè)，ERα和ERβ1在肌肉組織中的上調(diào)可一定程度上促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)，而ERβ2的功能可能與ERα、ERβ1存在一定拮抗作用。有研究結(jié)果顯示，對(duì)小鼠使用ERα的激動(dòng)劑丙吡唑三醇(propylpyrazole triol)，可促進(jìn)糖脂代謝通路中重要基因的表達(dá)[14]，這表明ERα在生長(zhǎng)代謝方面發(fā)揮作用。

綜上，本研究克隆了團(tuán)頭魴ER基因的CDS序列，該序列與鯉科魚(yú)類(lèi)具有較高的同源性。對(duì)ERs在團(tuán)頭魴3個(gè)年齡階段生長(zhǎng)快慢個(gè)體的肌肉和性腺組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明ERs在一定程度上可促進(jìn)性腺已發(fā)育成熟的魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)，對(duì)尚未性成熟的魚(yú)類(lèi)則偏向于促進(jìn)其性腺發(fā)育。同時(shí)ERα、ERβ1和ERβ2可能組成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控體系，彼此相互影響，在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中共同調(diào)節(jié)機(jī)體生長(zhǎng)和性腺發(fā)育。