蔣萬威 楊國輝

貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽 550004

膿毒癥心肌功能障礙（sepsis-induced myocardial dysfunction，SIMD）是因膿毒癥導(dǎo)致的心臟收縮或舒張功能下降，是膿毒癥常見的器官功能障礙之一，與患者的生存風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)[1-3]。超過10%的SIMD 患者可進(jìn)一步發(fā)展為膿毒癥性心肌病，長期影響患者心功能[4]。至今仍未完全闡明其具體的發(fā)病機(jī)制，多個(gè)潛在病理生理過程可能共同參與其中[5]。現(xiàn)階段多使用超聲多普勒、心肌標(biāo)志物等輔助措施識(shí)別SIMD，但這些指標(biāo)缺乏特異性，且尚無針對(duì)性的治療措施[6-8]。本研究通過分析高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫中的多個(gè)數(shù)據(jù)集，對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行研究，以期發(fā)掘SIMD 潛在的研究方向。

1 資料與方法

1.1 基因表達(dá)數(shù)據(jù)集選擇

在高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫中檢索膿毒癥患者外周血轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集及SIMD 小鼠心肌組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集（表1），為匹配膿毒癥患者外周血樣本選擇小鼠盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（cecal ligation and puncture，CLP）后24 h 的心肌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為研究對(duì)象。

表1 膿毒癥患者及膿毒癥心肌功能障礙動(dòng)物模型數(shù)據(jù)集

1.2 差異基因篩選

人體以膿毒癥患者及健康受試者分組，小鼠以CLP 及假手術(shù)分組。使用R 軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，采用P-Value＜0.05、Log2FC ＞1 為顯著性篩選條件，對(duì)小鼠共同差異基因進(jìn)行同源轉(zhuǎn)換，提取膿毒癥患者與動(dòng)物模型共同差異基因。見圖1。

圖1 膿毒癥心肌功能障礙差異基因篩選流程

1.3 差異基因生物功能分析

對(duì)膿毒癥外周血及SIMD 差異基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）及京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。

1.4 篩選SIMD 關(guān)鍵基因

對(duì)膿毒癥患者差異基因進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted correlation network analysis，WGCNA），以P ＜0.05 提取與臨床性狀顯著相關(guān)的基因模塊，篩選各基因模塊的前50 核心基因，同時(shí)定位SIMD 相關(guān)基因。

1.5 繪制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)

利用STRING 數(shù)據(jù)庫對(duì)膿毒癥患者差異基因進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)換，取中等置信度＞0.400 繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)，篩選提取核心蛋白，并從中定位SIMD 相關(guān)蛋白。

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥心肌損傷差異基因篩選結(jié)果

膿毒癥患者外周血及小鼠膿毒癥心肌組織分別有318 個(gè)及143 個(gè)共同差異基因，SIMD 差異基因占84 個(gè)，其中下調(diào)基因54 個(gè)，上調(diào)基因30 個(gè)。見圖2。

圖2 膿毒癥心肌功能障礙差異基因

2.2 膿毒癥心肌損傷差異基因GO 及KEGG 富集分析

膿毒癥及SIMD 差異基因集中在T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程；兩者在細(xì)胞成分及分子功能中也有相似基因富集（圖3～4）。膿毒癥外周血與SIMD 差異基因在KEGG 富集分析中有較大差異（圖5～6）。

圖3 膿毒癥患者外周血差異基因基因本體富集分析

圖4 膿毒癥心肌功能障礙差異基因基因本體富集分析

圖5 膿毒癥患者外周血差異基因京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫富集分析

圖6 膿毒癥心肌功能障礙差異基因京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫富集分析

2.3 差異基因WGCNA 分析

休克、APPCHE Ⅳ評(píng)分、主要診斷與綠色及藍(lán)色基因模塊相關(guān)，28 d 存活率與棕色基因模塊相關(guān)，見圖7。IRAK3、ANXA3、S100A8、GADD45A、LCN2、MME、LTF、NLRP1、FGL2、GBP5、KLHL2、KIF1B 等 為SIMD的關(guān)鍵基因，見圖8。

圖7 膿毒癥患者外周血差異基因與臨床性狀特征的關(guān)系

圖8 膿毒癥心肌功能障礙基因相互作用關(guān)系

2.5 SIMD 關(guān)鍵蛋白

共轉(zhuǎn)化658 個(gè)蛋白，LTF、LCN2、SOCS3、ITGA4、TLR2、JAK2、FCER1G、ITGAM、IL1R1、CD74、CIITA、MMP9 為SIMD 的關(guān)鍵蛋白。見圖9。

圖9 膿毒癥心肌功能障礙蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

3 討論

多個(gè)病理生理過程參與了膿毒癥器官所致的損傷，免疫調(diào)節(jié)失衡是重要的機(jī)制之一[9-10]。通過基因富集分析發(fā)現(xiàn)，SIMD 差異基因同樣集中在免疫的調(diào)控中，這些差異基因與患者的臨床性狀顯著相關(guān)，提示免疫調(diào)節(jié)失衡是造成心肌損傷的主要原因[11-13]。

LCN2 和LTF 處于WGCNA 及PPI 網(wǎng)絡(luò)的核心位置。LCN2 是脂質(zhì)運(yùn)載蛋白之一，其通過限制細(xì)菌增殖發(fā)揮先天性免疫作用，是巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞分化所必須的關(guān)鍵基因，具有調(diào)節(jié)免疫及預(yù)防器官功能損傷的作用[14-17]。LTF 在機(jī)體應(yīng)激時(shí)可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，其參與了NF-κB 和TLR4 等炎癥信號(hào)通路的傳導(dǎo)[18-20]。在膿毒癥患者及動(dòng)物模型中，LCN2 及LTF 在24 h 內(nèi)顯著升高，與膿毒癥患者呼吸衰竭、APACH Ⅳ評(píng)分、休克等有著高度相關(guān)性，可能是SIMD 的關(guān)鍵標(biāo)志物之一。ANXA3 及S100A8 同樣參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控，沉默前者可減輕炎癥反應(yīng)[21]，而后者可改善膿毒癥所導(dǎo)致的心肌重構(gòu)，減輕心肌損傷[22-23]。KLHL2 則參與抗原加工呈遞及先天性免疫系統(tǒng)過程[24-26]。

SOCS3 同樣是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要基因之一，其接受多種細(xì)胞因子的刺激，發(fā)揮抑制免疫反應(yīng)的作用[27-28]。一項(xiàng)死亡患者心肌組織的研究中發(fā)現(xiàn)，區(qū)別于擴(kuò)張型心肌病及缺血性心肌病，SOCS3 在膿毒癥患者心肌組織內(nèi)呈高表達(dá)趨勢，具有特異性[29]。而該基因在膿毒癥外周血中具有同樣趨勢，可能有利于對(duì)SIMD的鑒別[30]。

綜上所述，本研究聯(lián)合研究多個(gè)SIMD 動(dòng)物及膿毒癥患者的轉(zhuǎn)錄組基因數(shù)據(jù)集，LCN2、LTF、ANXA3、S100A8、KLHL2、SOCS3 是SIMD 潛在的關(guān)鍵基因，在臨床診斷、預(yù)后判斷及治療等方面具有重要意義。