廖 恒 范榮國 李又春 高玉姣 穆敬平

1.湖北省十堰市太和醫(yī)院 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院睡眠心身醫(yī)學(xué)中心，湖北十堰 442000；2.湖北省丹江口市第一醫(yī)院健康管理科，湖北丹江口 442700

大腦是學(xué)習(xí)記憶最基本、最重要、最高級的神經(jīng)單元[1]。腦血流中斷后再灌流是導(dǎo)致腦缺血再灌注的根本原因[2]。腦缺血再灌注發(fā)生率和致死率高，屬腦卒中最嚴(yán)重的續(xù)發(fā)性損傷[3-4]。解決微循環(huán)障礙、改善或維持血腦屏障的完整性是減輕神經(jīng)功能損傷的關(guān)鍵[5-7]。電針刺激百會、神庭、水溝具有腦保護作用[8]。但不同頻率電針的作用卻不盡相同，本研究觀察不同頻率電針對大腦中動脈閉塞大鼠腦缺血再灌注模型的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD 大鼠50 只，SPF 級，56 日齡，體重（235±5）g，購自武漢市萬千佳興生物科技有限公司[許可證號：SYXK（鄂）2016-0031，合格證號：SCXK（鄂）2016-0008]，倫理審批：湖北醫(yī)藥學(xué)院動（福）第2017-59；實驗符合3R 原則，滿足動物福利。

1.2 主要設(shè)備與試劑

LH202H 型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（北京華運安特科技有限公司）；Morris 水迷宮（成都泰盟軟件有限公司）；FBR-1 型電解式組織血流計（日本生物醫(yī)藥公司）；KES900D 全自動血流變檢測儀（無錫康爾生電子科技有限公司）；伊文思藍(lán)（上海懋康生物科技有限公司）；SpectraMax Paradigm 多功能酶標(biāo)儀由美谷分子儀器（上海）有限公司提供。

1.3 研究方法

1.3.1 造模與分組 隨機選取10 只大鼠作為假手術(shù)組，其余采用大腦中動脈閉塞法建立腦缺血再灌注模型，造模成功后采用隨機數(shù)字表法將其分為模型組和高、中、低頻電針組，每組10 只。建模參考文獻[9]：麻醉后依次分離頸外動脈-頸內(nèi)動脈-頸內(nèi)動脈的顱外分支-翼腭動脈。夾閉頸內(nèi)動脈、頸總動脈遠(yuǎn)心端，于頸外動脈遠(yuǎn)心端剪口插栓線，松開動脈夾并緩慢推進至出現(xiàn)明顯的阻力感即可，阻斷供血1 h 后復(fù)灌1 h即成模，以改良Zea Longa 神經(jīng)功能缺損評分1～7 分為成模標(biāo)準(zhǔn)[10]。假手術(shù)組手術(shù)同前但不插栓線。

1.3.2 干預(yù)措施 取穴參考《實驗動物常用穴位名稱與定位》[11]。于術(shù)后第2 天，高（100 Hz）、中（50 Hz）、低（2 Hz）頻電針組均取百會、神庭、水溝穴。用0.25 mm×1 mm 針灸針提插捻轉(zhuǎn)后接LH202H 型刺激儀。選疏密波，電流：2 mA。25 min/次，1 次/d，連續(xù)干預(yù)5 d 后間隔2 d，共干預(yù)4 周，假手術(shù)組和模型組不予干預(yù)。

1.3.3 糖水偏好實驗 將兩個200 ml 的水瓶同時放于籠中。第1 天兩瓶均裝蔗糖水（1%），第2 天將其中一瓶換裝純水，自由飲1 h 后取走并計算糖水偏愛率[糖水消耗量/（糖水+純水）×100%][12]。

1.3.4 Morris 水迷宮實驗 定位航行記錄逃避潛伏期。如動物1 min 內(nèi)未找到則引導(dǎo)到平臺并停留20 s。訓(xùn)練1 次/d，共7 d，然后撤掉平臺并記錄60 s 內(nèi)穿臺次數(shù)[13-14]。

1.3.5 局部腦血流量（regional cerebral blood flow，rCBF）在動物右側(cè)顱頂皮下安置記錄電極，于造模后和干預(yù)1～4 周時測量其rCBF[15]。

1.3.6 血腦屏障通透性 股靜脈注射2%伊文思藍(lán)（4 ml/kg），2 h 后斷頭處死，取全腦，置于甲酰胺溶液中浸泡10 min，研磨勻漿，60℃孵育24 h 后離心，離心半徑為7 cm，4000 r/min 離心15 min，取上清。酶標(biāo)儀調(diào)至520 nm，測量光密度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出伊文思藍(lán)濃度[16]。

1.3.7 血液流變學(xué)指標(biāo)及紅細(xì)胞滲透脆性（osmotic fragility of erythrocyte，EOF）經(jīng)股動脈取全血2 ml 測定血液黏滯度（高、中、低切）、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)。取14 支干燥肝素管分別加入2.0 ml不同濃度NaCl 溶液，每支試管內(nèi)加入新鮮血液0.1 ml。開始出現(xiàn)溶血現(xiàn)象的NaCl 溶液濃度為最小EOF，出現(xiàn)完全溶血現(xiàn)象時的NaCl 溶液濃度為最大EOF。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗；各時間點間rCBF 的比較采用重復(fù)測量方差分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五組糖水偏好實驗及Morris 水迷宮試驗結(jié)果比較

模型組糖水偏愛率低于假手術(shù)組，逃避潛伏期長于假手術(shù)組，穿臺次數(shù)少于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。高、中、低頻電針組糖水偏愛率高于模型組，逃避潛伏期均短于模型組，穿臺次數(shù)多于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。低頻電針組糖水偏愛率高于高、中頻電針組，逃避潛伏期短于高、中頻電針組，穿臺次數(shù)多于高、中頻電針組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。高、中頻電針組各指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 五組糖水偏好實驗及Morris 水迷宮試驗結(jié)果比較（）

表1 五組糖水偏好實驗及Morris 水迷宮試驗結(jié)果比較（）

注 與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與高頻電針組比較，cP ＜0.05；與中頻電針組比較，dP ＜0.05

2.2 五組各時間點rCBF 比較

假手術(shù)組各時間點rCBF 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。模型組及高、中、低頻電針組組內(nèi)各時間點rCBF 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。模型組各時間點的rCBF 均低于同期假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。高、中、低頻電針組造模后rCBF與模型組比較，三組造模后rCBF 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。高、中、低頻電針組干預(yù)1～4 周的rCBF 均高于同期模型組，低頻電針組干預(yù)1～4 周的rCBF 均高于同期高、中頻電針組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。高、中頻電針組各時間點的組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 五組各時間點rCBF 結(jié)果比較（%，）

表2 五組各時間點rCBF 結(jié)果比較（%，）

注 與本組造模后比較，aP ＜0.05；與本組干預(yù)1 周比較，bP ＜0.05；與本組干預(yù)2 周比較，cP ＜0.05；與本組干預(yù)3 周比較，dP ＜0.05；與同期假手術(shù)組比較，eP ＜0.05；與同期模型組比較，fP ＜0.05；與同期高頻電針組比較，gP ＜0.05；與同期中頻電針組比較，hP ＜0.05。rCBF：局部腦血流量

2.3 五組血液流變學(xué)指標(biāo)及EOF 比較

模型組血液黏滯度高、中、低切及血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)高于假手術(shù)組，最大、最小EOF 低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。高、中、低頻電針組血液黏滯度高、中、低切及血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均低于模型組，最大、最小EOF 高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。低頻電針組血液黏滯度高、中、低切及血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均低于高、中頻電針組，最大、最小EOF 高于高、中頻電針組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。高、中頻電針組各指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見表3。

表3 五組血液流變學(xué)指標(biāo)及EOF 比較（）

表3 五組血液流變學(xué)指標(biāo)及EOF 比較（）

注 與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與高頻電針組比較，cP ＜0.05；與中頻電針組比較，dP ＜0.05。EOF：紅細(xì)胞滲透脆性

2.4 五組血腦屏障通透性指標(biāo)比較

模型組腦組織伊文思藍(lán)含量為（57.19±2.37）μg/g，高于假手術(shù)組（14.91±1.39）μg/g，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=48.662，P ＜0.05）。高、中、低頻電針組伊文思藍(lán)含量分別為（20.81±1.73）、（32.08±3.17）、（31.54±2.35）μg/g，均低于模型組，且低頻電針組低于高、中頻電針組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。高、中頻電針組伊文思藍(lán)含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

3 討論

腦缺血再灌注占腦卒中的56.6%，常造成神經(jīng)元嚴(yán)重?fù)p傷[17]。作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)瑰寶，針刺或電針對腦卒中后神經(jīng)功能的恢復(fù)作用顯著。研究表明，針刺百會、神庭、水溝可改善腦卒中認(rèn)知功能障礙及上肢痙攣[18-19]，而電針則可顯著改善認(rèn)知功能[20]，減少腦出血量，提高rCBF，顯著促進卒中大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)[21]。低頻電針組逃避潛伏期低于高、中頻電針組，穿臺次數(shù)多于高、中頻電針組，提示低頻電針在促進腦缺血再灌注模型大鼠提高學(xué)習(xí)記憶力方面較高頻、中電針優(yōu)勢更明顯。低頻電針對于緩解痙攣、增加缺血區(qū)血流量、改善腦卒中肢體運動功能有積極作用[22]。低頻電針可輸出微量低頻脈沖電流刺激受損腦組織使其“覺醒”，能更好地調(diào)理人體經(jīng)絡(luò)之氣，促進運動及神經(jīng)功能重建[23-24]。

血腦屏障是維持腦微環(huán)境穩(wěn)態(tài)、保證其正常功能的特殊結(jié)構(gòu)，改善或維持血腦屏障的完整性是防止腦缺血再灌注的關(guān)鍵[5]。EOF 可反映紅細(xì)胞滲透抵抗力，降低則導(dǎo)致血液黏滯度增加，紅細(xì)胞的流動性、順應(yīng)性及通過微小血管的能力也隨之降低，是導(dǎo)致血栓形成及微循環(huán)障礙，從而加重神經(jīng)損傷的重要因素[25]。低頻電針組血液黏滯度（高、中、低切）、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、腦組織中伊文思藍(lán)含量低于高、中頻電針組，而最大、最小EOF 高于高、中頻電針組，提示低頻電針在改善血腦屏障通透性和血液流動性方面優(yōu)于高、中頻電針。

總之，采取不同頻率電針治療可維持腦缺血再灌注大鼠血腦屏障正常功能和通透性，并增強紅細(xì)胞順應(yīng)性及流動性，為腦組織供應(yīng)更多能量，減輕續(xù)發(fā)性腦損傷，這有利于受損神經(jīng)元再生及功能恢復(fù)，提高學(xué)習(xí)記憶能力，且這一效應(yīng)以低頻電針最為突出。