孫 倩 楊美子 欒繼昕 李 森 張 帆

1.山東省聊城市人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，山東聊城 252000；2.濱州醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，山東煙臺(tái) 264003；3.山東第一醫(yī)科大學(xué)研究生院，山東泰安 271000；4.山東省聊城市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東聊城 252000

胃腺癌是胃癌最常見的病理分型，其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高[1-2]。目前中醫(yī)藥在預(yù)防胃腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注[3]。干姜黃芩黃連人參湯中的藥物包括干姜、人參、黃連和黃芩，研究表明，這四種成分具有較強(qiáng)的抗腫瘤功效[4-7]，但該藥物抗胃腺癌的機(jī)制仍未明確。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene coexpression network analysis，WGCNA）可以探索基因網(wǎng)絡(luò)與疾病性狀的關(guān)系[8]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選出藥物中的活性成分，利用WGCNA 和網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析篩選與胃腺癌風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行半柔性對(duì)接，反向驗(yàn)證藥材化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的相互作用，以探究藥物抗胃腺癌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 篩選藥物活性成分

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP），檢索獲得已知化學(xué)成分，篩選標(biāo)準(zhǔn)為類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 并且口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)收集已知藥物化學(xué)成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.2 藥物作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

檢索GenCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)得到與胃腺癌相關(guān)的作用靶點(diǎn)，將藥物預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與胃腺癌相關(guān)靶點(diǎn)相互交集，構(gòu)建藥物-化合物-靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.3 基因表達(dá)數(shù)據(jù)處理

胃腺癌的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)在TCGA 中下載得到。利用R 語(yǔ)言篩選差異表達(dá)基因，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|＞1、P ＜0.05，得到差異基因的火山圖和熱圖。

1.4 WGCNA

采用R 語(yǔ)言構(gòu)建權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)皮爾森相關(guān)系數(shù)篩選共表達(dá)模塊。將共同靶點(diǎn)最多的模塊作為藥物干預(yù)胃腺癌的目標(biāo)模塊。

1.5 GO 及KEGG 富集分析

根據(jù)GO 及KEGG 富集分析對(duì)WGCNA 得到的共有靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，設(shè)定P ＜0.05，篩選出藥物具有顯著性差異的GO 功能和KEGG 通路信息，并繪制氣泡圖。

1.6 核心靶點(diǎn)的篩選

將WGCNA 得到的共同靶點(diǎn)上傳至STRING，建立藥物靶蛋白-胃腺癌靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。利用CytoNCA 插件篩選關(guān)鍵基因，將其作為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.7 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接

關(guān)鍵靶點(diǎn)的2D 結(jié)構(gòu)文件從RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到，運(yùn)用Pymol 軟件移除潛在生物標(biāo)志物中的配體和非蛋白分子。關(guān)鍵化合物2D 結(jié)構(gòu)文件從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到，最后運(yùn)用AutoDock 軟件進(jìn)行半柔性對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出活性化合物共59 個(gè)，其中5 個(gè)來(lái)自干姜，29 個(gè)來(lái)自黃芩，11 個(gè)來(lái)自黃連，14 個(gè)來(lái)自人參。這59 個(gè)化合物包括：黃芩新素（neobaicalein）、黃麻甙A（corchoroside A）等，主要活性成分見表1（根據(jù)OB 值僅列出前5 項(xiàng)）。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)輸入這59 個(gè)化學(xué)成分，經(jīng)過(guò)篩選共得到184 個(gè)藥物潛在活性靶點(diǎn)。

表1 干姜黃芩黃連人參湯部分活性成分基本信息

2.2 藥物治療胃腺癌作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在GenCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)共收集到胃腺癌作用靶點(diǎn)8758、170、314、37、41 個(gè)，剔除重復(fù)靶點(diǎn)后共收集8953 個(gè)靶點(diǎn)（圖1A）。將藥物和胃腺癌潛在靶點(diǎn)取交集后共得到163 個(gè)靶點(diǎn)，即藥物治療胃腺癌潛在作用靶點(diǎn)（圖1B）。

圖1 數(shù)據(jù)庫(kù)及藥物和疾病共有靶點(diǎn)的維恩圖

2.3 藥物-化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

藥物-化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)總共包括242 個(gè)節(jié)點(diǎn)和673 條邊，如圖2 所示，其中紫色、綠色、紅色、藍(lán)色圓形分別代表黃芩、人參、干姜、黃連所屬化合物，黃色代表靶標(biāo)基因。排名前5 位的化合物分別是槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素、千層紙素A。

圖2 藥材-化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 胃腺癌的差異表達(dá)基因

最終篩選得到32 例癌旁和375 例癌癥的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，表達(dá)差異的基因共計(jì)6739 個(gè)，其中有3915 個(gè)上調(diào)，2824 個(gè)下調(diào)。見圖3。

圖3 差異基因的熱圖和火山圖

2.5 基因模塊選擇和作用靶點(diǎn)確定

選擇臨床特征進(jìn)行WGCNA 相關(guān)性分析。繪制差異表達(dá)基因聚類樹狀圖（圖4A），計(jì)算模塊與臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性，繪制熱圖（圖4B）。將模塊中所包含的靶點(diǎn)分別與化合物作用靶點(diǎn)比對(duì)，結(jié)果顯示藍(lán)色模塊中包含32 個(gè)共同靶點(diǎn)，與腫瘤等級(jí)呈正相關(guān)。

圖4 聚類樹狀圖和相關(guān)性熱圖

2.6 GO 和KEGG 富集分析

分子層面涉及的GO 富集分析有DNA 完整性檢驗(yàn)點(diǎn)、對(duì)金屬離子的反應(yīng)等（圖5A）。KEGG 通路排名靠前的主要涉及p53 信號(hào)通路、細(xì)胞周期和細(xì)胞衰老等（圖5B）。

圖5 GO 和KEGG 富集分析氣泡圖

2.7 潛在生物標(biāo)志物篩選

首先得到一個(gè)具有113 條邊、30 個(gè)節(jié)點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步篩選后得到一個(gè)具有25 條邊、8 個(gè)節(jié)點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)，3 次最終篩選得到3 個(gè)關(guān)鍵基因作為潛在生物標(biāo)志物，分別為VEGFA、CDK1、CCND1，過(guò)程見圖6。

圖6 治療胃腺癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選策略圖

2.8 分子對(duì)接結(jié)果

將關(guān)鍵靶點(diǎn)與關(guān)鍵化合物進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見表2。核心化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能均≤-30 kJ/mol，結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。見表2、圖7。

圖7 核心化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

表2 關(guān)鍵靶點(diǎn)與化合物的對(duì)接結(jié)果

3 討論

本研究通過(guò)WGCNA 聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接方法，在分子層面揭示了干姜黃芩黃連人參湯抗胃癌的活性成分、作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，初步闡釋了其抗胃腺癌的作用機(jī)制可能是通過(guò)藥物核心化學(xué)成分調(diào)節(jié)VEGFA、CDK1、CCND1 三個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，影響p53信號(hào)通路等過(guò)程起到抗癌作用。

干姜黃芩黃連人參湯出自《傷寒論》，四種藥材寒溫并用，缺一不可，有散結(jié)除痞之功[9]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得到核心化合物主要包括漢黃芩素、黃芩素、槲皮素等，這些化合物同屬于黃酮類化合物，不會(huì)產(chǎn)生拮抗作用。漢黃芩素、黃芩素可通過(guò)抗腫瘤血管發(fā)生抑制癌細(xì)胞的增殖[10]，槲皮素可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[11]。山柰酚具有廣譜抗腫瘤活性，對(duì)胃癌細(xì)胞具有抑制作用[12-13]。通過(guò)KEGG 富集分析得到藥物核心化學(xué)成分可通過(guò)p53 信號(hào)通路、細(xì)胞周期等發(fā)揮抗癌作用。槲皮素可通過(guò)上調(diào)p53 來(lái)增強(qiáng)曲古抑菌素A的抗腫瘤活性[14]，同時(shí)漢黃芩素能夠抑制人胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，加速其凋亡[15]。分子對(duì)接結(jié)果顯示，核心化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合活性較高，提示這些化合物可通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮抗癌作用。

VEGFA 是一種促血管生長(zhǎng)因子，其促血管生成作用最強(qiáng)、專屬性也最高[16]。VEGFR 可以與VEGFA特異結(jié)合來(lái)介導(dǎo)血管的生成[17]。研究表明胃腺癌患者的腫瘤分期和預(yù)后與胃腺癌組織中VEGFA 的異常表達(dá)密切相關(guān)[18-20]。CDK1 是一種周期蛋白依賴性蛋白激酶，由催化激酶亞基和細(xì)胞周期蛋白蛋白伴侶組成，具有調(diào)控細(xì)胞周期的重要功能[21]。CDK1 在大多數(shù)惡性腫瘤中的表達(dá)均增加，其中就包括胃腺癌。CDK1作為抗腫瘤藥物研發(fā)的有效靶點(diǎn)，可顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)[22-23]。CCND1 是細(xì)胞周期蛋白家族中最重要的細(xì)胞周期正調(diào)節(jié)器[24]。CCND1 可以調(diào)整細(xì)胞周期不同階段的進(jìn)展，在細(xì)胞周期中發(fā)揮特定作用。CCND1 基因多態(tài)性與多種消化系統(tǒng)腫瘤密切相關(guān)[25-26]。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、WGCNA、分子對(duì)接技術(shù)對(duì)干姜黃芩黃連人參湯中的活性化合物與作用靶點(diǎn)進(jìn)行了分析，初步得到其抗胃腺癌的作用機(jī)制是通過(guò)核心化學(xué)成分調(diào)關(guān)鍵靶點(diǎn)，影響p53 信號(hào)通路、細(xì)胞周期和細(xì)胞衰老等過(guò)程起到抗癌作用。本研究結(jié)果為后續(xù)研究提供了理論基礎(chǔ)和重要依據(jù)，為今后研發(fā)新藥指明了方向。