于會麗，徐變變，徐國益，邵 微,2，高登濤，司 鵬

（1中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所，鄭州 450009；2河南農業(yè)大學林學院，鄭州 450002）

0 引言

生物有機肥含有功能菌，功能菌的快速繁殖可優(yōu)化土壤微生物種群結構，增強土壤酶活性，活化土壤養(yǎng)分[1]，提高根系活力[2]，促進根系對營養(yǎng)元素的吸收利用[3]，提高作物產量和品質[4-5]，增強作物抗病和抗逆性[6-7]。如曹亮亮等[8]發(fā)現在腐熟雞糞堆肥中添加2種蛋白原料固態(tài)發(fā)酵根際功能菌研制成的生物有機肥，均能顯著增加盆栽香蕉植株的株高和假莖粗。陳波等[9]研究表明，生物有機肥較對照及有機肥處理，顯著促進了盆栽櫻桃樹體對氮、磷、鉀的吸收。艾爾買克·才卡斯木等[10]通過盆栽試驗發(fā)現，不同氯化鈉濃度脅迫下，實生核桃幼苗接種EM菌，核桃幼苗生物量和超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性均顯著高于非菌根植株，而葉片丙二醛(MAD)含量顯著低于非菌根植株。同時邵麗等[11]采用Biolog-Eco法研究表明，生物復混肥能顯著提高土壤微生物群落碳源利用率、微生物群落豐富度和功能多樣性。孫薇等[12]利用Biolog-Eco技術分析了不同施肥處理對土壤微生物群落代謝能力的影響，結果表明，生物有機肥處理土壤微生物活性、物種多樣性、豐富度以及對6類碳源代謝能力均顯著高于常規(guī)施肥。然而生物有機肥在促進盆栽蘋果幼苗生長、抗逆指標以及對土壤微生物多樣性影響的有關報道仍較少。

本研究以1年生蘋果幼苗‘煙富8號’為試材，以常規(guī)有機肥雞糞為對照，研究生物有機肥不同施用量對蘋果幼苗生長、生理特性以及土壤微生物功能多樣性的影響，確定其在樹苗栽培中最佳施用量，以期為生物有機肥在苗木培育中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地基本情況

試驗于2017年4月在中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所試驗田進行。區(qū)域氣候為溫帶大陸性季風氣候，年平均降雨量632 mm，無霜期220天，全年日照時間約2400 h。

1.2 供試材料

供試作物為1年生蘋果幼苗‘煙富8號’。

供試肥料包括生物有機肥（有效活菌數≥2億個/g，有機質≥70%，氨基酸≥20%，腐殖質≥40%，N+P2O5+K2O≥6%）和雞糞（有機質≥50%，N+P2O5+K2O≥6%）。

1.3 試驗設計

試驗以盆栽方式進行，采用內徑31 cm、高38 cm的圓筒塑料盆，每盆裝風干土20 kg。試驗共設4個處理，CK為雞糞35 g/(kg·土)，T1、T2、T3分別為生物有機肥23.3、35、70 g/(kg·土)，其中，23.3、35、70 g/(kg·土)指供試肥料中折算出有機含量與土壤質量比值，每處理重復3次，每重復種植4盆，完全隨機排列。各處理中土壤與有機肥充分混勻后裝盆備用。

1.4 樣品采集及測定

1.4.1 株高樣品選擇 9月收獲時，每處理每重復選擇生長一致的‘煙富8號’蘋果幼樹進行測定。

1.4.2 葉片樣品采集 9月收獲時，每株采取枝條倒2～4片葉，一部分葉片帶回實驗室立即測定鮮重、葉面積、葉片SPAD值，后烘干粉碎用于測定葉片中氮磷鉀含量；一部分葉片用冰盒帶回實驗室并保存于4℃冰箱中用于測定葉片抗性物質和酶活性等指標。

1.4.3 土壤樣品采集 每處理每重復選擇4株樹以抖落法[13]采集果樹根際土壤樣品，去除植物殘根等雜物后，并將4個土樣混合，過2 mm孔徑的無菌篩網，-80℃儲存。

1.4.4 根系樣品采集 將去除土壤的根系放于0.149 mm的篩中，用水沖洗干凈，取出雜物、死根后，將根系用吸水紙吸干后保存，用于測定根系的各項指標。

1.4.5 樣品測定 株高用直尺測量植株從露出土壤根部至頂端的距離，葉面積采用便攜式葉面積儀CI-203CA測定，主根長采用直尺測定，根體積采用排水法測定[14]，葉片SPAD值采用SPAD-502儀測定，葉片可溶性糖采用蒽酮比色法測定[15]，葉片可溶性蛋白采用考馬斯亮藍G-250染色法測定[15]，葉片丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定[14]，葉片脯氨酸采用磺基水楊酸法測定[14]，葉片POD（過氧化物酶）、CAT（過氧化氫酶）和PAL（苯丙氨酸解氨酶）活性方法參見文獻[16]，采用H2SO4和H2O2消煮，全自動間斷化學分析儀（Clever Chem 380，德國）測定葉片氮和磷含量，火焰光度計測定葉片鉀含量[17]。

1.4.6 土壤微生物群落測定 將相當于1 g烘干土的新鮮土壤加入到盛有99 mL 0.85%滅菌生理鹽水的250 mL三角瓶中，28℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)30 min，使土樣與生理鹽水充分混勻，再放置在4℃冰箱內靜置30 min，然后加樣于Biolog-Eco板微孔板中，每孔加入150 μL。25℃下培養(yǎng)192 h，每24 h Biolog自動讀取儀讀數1次（Biolog MicroStation自動微生物鑒定，美國）。Biolog-ECO 96孔微平板上分布31種單一碳源和空白對照，每種碳源和空白有3個平行。31種單一碳源大致可分為6類（碳水化合物、氨基酸類、羧酸類化合物、聚合物、胺類化合物和酚酸類化合物），并以各類碳源在96 h的相對光密度(Ci-R)平均值表示土壤微生物對這一碳源的利用強度。一個板可以測3個平行。

微生物群落功能多樣性的計算[18]如式(1)～(5)。

Mc Intosh指數(U)是基于群落物種多維空間距離的多樣性指數，可利用第i孔的相對吸光值(ni)計算得到[式(1)]。

Shannon-Wiener指數(H')用于評估豐富度，其中Pi為第i孔的相對吸光值與整個平板相對吸光值總和的比例，如式(3)。

式中，Ci為所測定的31個碳源孔的吸光值，R為對照孔的吸光值。

Simpson指數(D)又稱優(yōu)勢度指數，是對多樣性方面的集中性度量[式(4)]。

Pielou均勻度指數(E)是群落實測多樣性與最大多樣性的比例[式(5)]。

式中，S為豐富度指數，代表被利用的碳源總數。

1.5 數據整理與分析

采用Microsoft Excel 2010進行數據處理；用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，對蘋果幼苗生物量（株高、葉面積、百葉鮮重、根體積、根長）、葉片生理特性（丙二醛、可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸、過氧化物酶、過氧化氫酶、苯丙氨酸解氨酶、SPAD值、葉片氮、磷、鉀）、土壤微生物群落多樣性指數（均勻度指數、優(yōu)勢度指數、多樣性指數、豐富度指數、均一性指數）、土壤微生物對6類碳源的利用強度（聚合物、碳水化合物、酚酸類化合物、羧酸類、氨基酸類、胺類）用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行主成分分析。分析中，一般選擇特征值大于1的成分作為主成分。本研究數據分析中，特征值大于1的有3個成分，分別記作F1、F2、F3。這3個主成分的累計貢獻率為100.00%，表示這3個主成分涵蓋了所有的原始數據信息。每個處理的綜合得分按照式(6)計算。

2 結果與分析

2.1 生物有機肥對蘋果苗生物量的影響

如表1所示，與CK相比，生物有機肥處理增加蘋果苗株高和根長，其中，T1處理的株高和根長最高，較CK分別顯著增加14.24%和24.02%，且T1處理與其他處理差異顯著。生物有機肥處理的蘋果幼苗葉面積和百葉鮮重均低于CK，其中T3處理的葉面積和百葉鮮重最低，較CK分別顯著降低12.78%和23.85%，其他處理與CK差異不顯著。除T1處理外，生物有機肥處理的蘋果幼苗根體積均顯著低于CK。

表1 不同處理對蘋果幼苗生物量的影響

2.2 生物有機肥對蘋果葉片生理特性的影響

2.2.1 生物有機肥對蘋果葉片抗性物質的影響 由表2可以看出，施用不同濃度生物有機肥對蘋果葉片抗逆性指標影響各異。與CK相比，T1處理的蘋果葉片可溶性糖和脯氨酸含量最高，丙二醛含量最低，除可溶性糖外，差異達顯著性水平。生物有機肥處理的蘋果葉片可溶性蛋白含量均低于CK，其中T1和T3處理葉片可溶性蛋白較CK分別顯著降低19.65%和26.39%。

表2 不同處理對蘋果葉片抗性物質的影響

2.2.2 生物有機肥對蘋果葉片酶活性和SPAD值的影響 由圖1可知，T1處理下，蘋果葉片過氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶活性達最高，較CK分別增加5.84%和5.48%，差異不顯著；與CK相比，T2處理顯著提高蘋果葉片過氧化氫酶活性，其他處理與CK無顯著差異；T3時處理下，蘋果葉片過氧化物酶、過氧化氫和苯丙氨酸解氨酶活性達最低。由此表明，低用量生物有機肥可促進葉片酶活性，高用量抑制葉片酶活性。蘋果葉片SPAD值由高到低依次為T1＞T2＞T3＞CK，其中，T1和T2處理蘋果葉片SPAD值較CK分別顯著提高15.45%和12.71%，T3處理與CK差異不顯著。

圖1 不同處理對蘋果葉片過氧化物酶、過氧化氫和苯丙氨酸解氨酶活性以及SPAD值的影響

2.2.3 生物有機肥對蘋果葉片氮、磷、鉀含量的影響 生物有機肥對蘋果葉片氮、磷、鉀含量的影響如圖2。結果表明，T1和T3處理蘋果葉片氮含量較CK分別增加2.58%和7.79%。同時生物有機肥顯著提高蘋果葉片鉀含量，鉀含量由高到低依次為T1＞T2＞T3＞CK，T1處理較CK顯著增加27.33%，不同處理間差異不顯著。但生物有機肥處理對蘋果葉片磷含量影響不大。

圖2 不同處理對蘋果葉片氮、磷、鉀含量的影響

2.3 生物有機肥對蘋果土壤微生物多樣性的影響

2.3.1 不同處理土壤微生物功能多樣性指數分析 選取土樣培養(yǎng)96 h數據進行土壤微生物代謝多樣性分析，不同施肥處理對蘋果土壤微生物群落功能多樣性指數影響不同，如表3所示。T2處理的土壤優(yōu)勢度指數D、多樣性指數H'和豐富度指數S顯著低于其他處理，T3處理的多樣性指數H'、豐富度指數S和均一性指數U最高，較CK分別提高0.91%、7.60%和4.14%，且與T1處理差異不顯著。

表3 土壤微生物群落多樣性指數

2.3.2 不同處理土壤微生物對6類碳源的利用強度 由圖3可知，施生物有機肥與雞糞CK土壤微生物對Biolog-Eco板中不同類碳源利用強度存在不同差異。T1處理土壤微生物對酚酸類化合物和胺類利用強度較CK分別增加18.87%和13.51%，且與其他處理無顯著性差異；T3處理土壤微生物對聚合物、碳水化合物、氨基酸類和胺類利用強度最高，較CK分別增加20.00%、6.33%、16.88%和18.92%；與CK相比，T2處理土壤微生物對聚合物、碳水化合物和羧酸類利用強度分別降低8.33%、8.86%和21.79%。

圖3 不同處理土壤微生物對6類碳源的利用強度

2.4 不同處理對蘋果幼苗生長、土壤微生物多樣性指數、碳源利用強度綜合影響主成分分析

通過主成分分析（表4）可知，第1主成分其特征值的變量解釋度為45.345%，是最主要的解釋變量，前2個成分的特征值為79.196%，表明這2個成分是主要分析部分。對各處理在3個成分中進行綜合評價（表5），T1得分最高，為2.06，說明T1處理蘋果土壤微生物功能多樣性指數、碳源利用強度及蘋果苗生物量、葉片抗性物質、酶活性、SPAD值、養(yǎng)分含量最高。

表4 指標總方差分解

表5 不同處理蘋果幼苗綜合評價

3 結論

施用生物菌肥可不同程度上增加蘋果幼苗株高、根長、葉片鉀養(yǎng)分、可溶性糖和脯氨酸含量，影響葉片酶活性，改善土壤微生物功能多樣性，其中以施用23.3 g/(kg·土)生物有機肥的效果最好。施用生物有機肥23.3 g/(kg·土)顯著提高蘋果苗株高、根長和葉片鉀養(yǎng)分、脯氨酸和SPAD值，增加葉片酶活性，促進蘋果苗生長，施用70 g/(kg·土)生物有機肥反而降低葉片酶的活性；同時，施用23.3 g/(kg·土)生物有機肥增加土壤微生物群落豐富度，提高土壤微生物對酚酸類化合物和胺類利用強度。

4 討論

4.1 生物有機肥對蘋果幼苗生物量和養(yǎng)分含量的影響

生物有機肥含有溶磷、固氮功能的有益微生物，能夠改善土壤環(huán)境，促進作物生長發(fā)育[19]。李北齊[20]研究發(fā)現，施用生物有機肥能增加盆栽鹽堿土玉米的株高和根長。本研究與其類似，施用生物有機肥均能促進蘋果幼苗的株高和根長，其中生物有機肥23.3 g/(kg·土)處理(T1)效果最佳。生物有機肥用量為70 g/(kg·土)處理(T3)對蘋果幼苗葉面積、百葉鮮重以及根體積產生抑制作用?？赡苁怯捎谏镉袡C肥用量過多，其成分抑制或導致其他元素供應不足，從而抑制蘋果幼苗生長[21]。同時本研究發(fā)現，生物有機肥可提高蘋果葉片氮和鉀含量，這與張金妹等[22]的研究結果相似。生物有機肥中的有益微生物菌群具有固氮解鉀能力，使土壤養(yǎng)分有效地供應給作物，從而提高氮、鉀含量[23]。

4.2 生物有機肥對蘋果葉片生理特性的影響

丙二醛是植物在逆境環(huán)境下細胞發(fā)生膜脂過氧化作用的產物之一，其含量反映植物遭受逆境的傷害程度[24]。本試驗結果表明，與雞糞CK相比，施用生物有機肥能夠顯著降低蘋果葉片丙二醛含量，即降低蘋果葉片膜脂質過氧化程度，預防并修護葉片細胞和細胞膜損傷，增強植株生長代謝活力，這與劉艷等[25]的研究結果相似。脯氨酸是植物體內一種細胞質滲透調節(jié)物質，植物在逆境環(huán)境下體內脯氨酸含量發(fā)生改變[25]。本研究發(fā)現，生物有機肥低濃度23.3 g/(kg·土)處理葉片脯氨酸含量顯著高于高濃度70 g/(kg·土)處理，可能是高濃度生物有機肥脅迫下細胞受害嚴重，導致葉片脯氨酸含量減少[26]。植物體內防御酶活性與植物抗性相關，生物有機肥增強草莓抗逆性[27]。本研究表明，生物有機肥能提高葉片過氧化氫酶(CAT)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性，增強幼苗抗逆性，這與謝東鋒等[28]研究結果相似。同時發(fā)現，生物有機肥低濃度23.3 g/(kg·土)處理時3種酶活性增加，高濃度時70 g/(kg·土)處理酶活性降低，這可能與處理葉片丙二醛含量有關（表2），即丙二醛含量降低，酶活性增加，丙二醛含量的積累對酶活性增加具有誘導作用[29]。

4.3 生物有機肥對土壤微生物多樣性的影響

筆者用Biolog-Eco方法研究了施用生物有機肥對土壤中微生物群落代謝的影響，結果表明，施用生物有機肥平均能增加土壤微生物多樣性指數以及微生物對6類碳源的利用強度，可能是生物有機肥的施用改善了土壤水分、營養(yǎng)、通氣等環(huán)境條件，為土壤微生物提供良好的生長環(huán)境，提高了土壤微生物代謝能力，增強了土壤微生物競爭能力，從而提高土壤微生物功能多樣性以及對6類碳源的利用能力[30-31]，具體作用機理有待進一步研究。