楊興變，張蜀美，李俊，王黔陽(yáng)，何珺

摘要：為建立經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、有效的銀杏葉蛋白質(zhì)提取方法，采用正交法對(duì)銀杏葉中蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，紫外分光光度法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明： 銀杏葉蛋白質(zhì)在λ=560 nm波長(zhǎng)條件，在050～500 mg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=00645x+00037，R2=0998;銀杏葉中蛋白質(zhì)提取工藝為：料液比為1∶8、提取時(shí)間為2 h、提取溫度為70 ℃。本方法經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，可快速有效地從銀杏葉中提取蛋白質(zhì)，為充分利用銀杏葉資源提供實(shí)踐依據(jù)。

關(guān)鍵詞：銀杏葉;蛋白質(zhì);提取

中圖分類號(hào)：R93文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2022）01-0089-004國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2022.01.013

Study on the Protein Extraction Technology of Ginkgo Biloba Leaves

Yang Xingbian1，Zhang Zhumei1，2，Li Jun1，2 ，Wang Qianyang3，He Jun1*

（ 1.Research Center of Biochemistry Engineering of Guizhou Province，Guiyang，Guizhou 550025，China;2.College of Pharmacy，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China;3.Guizhou Beiyinte Biotechnology Co.，Ltd，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：To establish an economic，simple and effective method for protein extraction from Ginkgo biloba leaves.The orthogonal method was used to extract the protein from the leaves of Ginkgo biloba，and the content of protein of Ginkgo biloba leaves was determined by ultraviolet spectrophotometer （λ=560 nm）.The results showed that the standard curve was y= 0.0645x+0.0037，R2=0.998 and Ginkgo biloba protein had a good relationship in the range of 0.50～5.00 mg/mL.The optimum extraction parameters were as follows：the ratio of material to liquid was 1∶8，the extraction time was 2 h and the extraction temperature was 70 ℃.This method was economical，simple and reproducible，and it can be used to extract protein from Ginkgo biloba leaves quickly and effectively，which provides practical basis for rational and full utilization of Ginkgo biloba leaves resources.

Keywords：Ginkgo biloba leaves;protein;extraction

中國(guó)是銀杏主產(chǎn)國(guó)，約占全球的80 %，銀杏葉為銀杏科植物銀杏（Ginkgo biloba L.）的干燥葉，具有斂肺、平喘、活血化瘀、止痛的功效[1]，主要含有黃酮類、萜內(nèi)酯類、有機(jī)酸類、酚類、多糖、蛋白質(zhì)等多種活性成分，其中黃酮類、萜內(nèi)酯類為銀杏葉提取物的主要活性成分，是銀杏葉開(kāi)發(fā)利用的重點(diǎn)[2-5]，而對(duì)其蛋白質(zhì)相關(guān)研究較少[6]，從銀杏葉中提取蛋白質(zhì)更是未見(jiàn)報(bào)道，只見(jiàn)以雜質(zhì)形式被祛除的報(bào)道[7]。蛋白質(zhì)是生命體重要的組成部分，是食物中的重要組成部分，同時(shí)也是藥物研究的重要靶點(diǎn)，但目前蛋白質(zhì)資源短缺尤為嚴(yán)峻[8-11]，因此，解決蛋白質(zhì)資源短缺已經(jīng)成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。據(jù)查閱文獻(xiàn)， 銀杏干葉中蛋白質(zhì)含量598 %，可以作為一種蛋白質(zhì)來(lái)源加以利用[6，11]。銀杏葉蛋白質(zhì)中含有亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸和色氨酸等人體必需的6種氨基酸。然而，在生產(chǎn)銀杏葉提取物時(shí)，大量的水溶液、水洗液被直接丟棄，而銀杏葉中的蛋白質(zhì)就在被直接丟棄的水溶液、水洗液中，造成了資源的浪費(fèi)。因此，本文利用正交法建立銀杏葉中蛋白質(zhì)的提取方法，使銀杏葉在生產(chǎn)銀杏葉提取物的同時(shí)，可對(duì)其蛋白質(zhì)進(jìn)行提取回收利用。這不僅可以提高銀杏葉資源的綜合利用率，還可以減少生產(chǎn)廢液的排放，為銀杏產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供參考。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

電子天平（BSA124S，賽多利斯科學(xué)儀器公司）;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Cary 60 UV-Vis，Agilent Technologies）;電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9140 MBE，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療廠）;電熱恒溫水鍋浴（HHW21-600C，常州華奧儀器制造有限公司）;粉碎機(jī)（FSJ-A05N6，龍港市創(chuàng)達(dá)商貿(mào)有限公司）等。

氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、無(wú)水硫酸銅，均為分析純;水為娃哈哈純凈水。

1.2試驗(yàn)材料及對(duì)照品

材料：銀杏葉（8年生干銀杏葉，2020年7月20號(hào)購(gòu)于道真華山綠色產(chǎn)業(yè)公司）;

對(duì)照品：酪蛋白（含量>96%，批號(hào)：202009 02，山東萍聚生物科技有限公司）;

雙縮脲試劑：精密稱取3015 g的氫氧化鈉溶于300 mL的水中得到A液，精密稱取酒石酸鉀鈉599 g和無(wú)水硫酸銅150 g溶于500 mL的水中得到B液，將A、B液混合搖勻即得。

酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱取05002 g酪蛋白于100 mL容量瓶中，加入005 mol/mL的氫氧化鈉溶液，定容，搖勻，即得500 mg/mL的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取7支具塞試管，按表1系列梯度精密移取酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液和純水。

快速在每支試管中加入6 mL的雙縮脲試劑，振蕩均勻，加完后置于室溫下反應(yīng)30 min，然后在560 nm波長(zhǎng)下，以純水為空白，迅速測(cè)其吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

銀杏葉蛋白質(zhì)含量測(cè)定：分別將對(duì)應(yīng)的對(duì)照品溶液與供試品溶液放入紫外分光光度儀，記錄各自吸光度值，根據(jù)線性關(guān)系計(jì)算相應(yīng)的濃度，其質(zhì)量及含量按公式（1）、（2）計(jì)算：

蛋白質(zhì)的質(zhì)量（mg）=測(cè)定蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）×樣液體積（mL）（1）

蛋白質(zhì)的含量=蛋白質(zhì)質(zhì)量（mg）/樣品的質(zhì)量（mg）×100%（2）

1.3.2銀杏葉中蛋白質(zhì)提取單因素考察

將銀杏葉放在60 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘至完全干燥，粉碎，過(guò) 80目篩，得到銀杏葉粉末供試品。

提取溫度考察：精密稱取 1 g 的銀杏葉供試品粉末于 10 mL具塞試管中，共稱取5份。按1∶10的料液比加入蒸餾水，分別在設(shè)定的溫度20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃條件下，水浴提取1 h，趁熱抽濾即得不同溫度提取的供試品溶液;按照銀杏葉蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法測(cè)其吸光度值。

料液比考察：精密稱取 1 g 的銀杏葉供試品粉末于 10 mL具塞試管中，共稱取5份。分別按不同的1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14等料液比加入蒸餾水，在80 ℃條件下，水浴提取1 h，趁熱抽濾即得不同料液比提取的供試品溶液;按照銀杏葉蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法測(cè)其吸光度值。

提取時(shí)間考察：精密稱取 1 g 的銀杏葉供試品粉末于 10 mL具塞試管中，共稱取5份。按1∶10的料液比加入蒸餾水，在80 ℃條件下，分別水浴提取1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，趁熱抽濾即得不同時(shí)間提取的供試品溶液;按照銀杏葉蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法測(cè)其吸光度值。

1.3.3銀杏葉蛋白質(zhì)提取正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)[12-15]和實(shí)際大生產(chǎn)的經(jīng)驗(yàn)，以水為溶劑，料液比、提取時(shí)間、溫度為主要因素，各個(gè)因素設(shè)置三個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)分析，因素和水平值見(jiàn)表2。

精密稱取銀杏葉粉末1.00 g置于試管中，根據(jù)正交試驗(yàn)因素水平表中料液比的要求，加入相對(duì)應(yīng)的純水并將其密封好，平行操作下水浴加熱提取，濾過(guò)，獲得提取液，將其稀釋不同倍數(shù)并加入雙縮脲溶液60 mL，在室溫下反應(yīng)30 min，在560 nm測(cè)其吸光度，根據(jù)公式（1）、（2）和線性關(guān)系計(jì)算含量。

1.3.4重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)

平行稱取三批次銀杏葉粉末，按正交試驗(yàn)最佳方法提取銀杏葉中的蛋白質(zhì)，濾過(guò)，得到提取液，取樣測(cè)其含量。

2結(jié)果與分析

2.1線性關(guān)系的結(jié)果

以對(duì)照品濃度為X軸（橫坐標(biāo)），以吸光度值為Y軸（縱坐標(biāo)）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1得到酪蛋白在λ=560 nm波長(zhǎng)條件，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=00645x+00037（R2=0998），表明酪蛋白在050～500 mg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可用于后續(xù)銀杏葉中提取蛋白質(zhì)的檢測(cè)。

2.2單因素考察結(jié)果

以計(jì)算得到銀杏葉中蛋白質(zhì)的百分含量與對(duì)應(yīng)的提取溫度、料液比、提取時(shí)間作圖，結(jié)果分別見(jiàn)圖2、圖3和圖4。

由圖2可知，隨著溫度的上升，銀杏葉中蛋白質(zhì)提取百分含量逐漸上升，80 ℃達(dá)到最高，溫度繼續(xù)上升反而降低，這有可能溫度過(guò)高，導(dǎo)致蛋白質(zhì)不可逆變性沉淀，檢測(cè)時(shí)保證溶液的清亮而被過(guò)濾損失，故選擇 60 ℃、70 ℃、80 ℃ 三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

由圖3可知，料液比為1∶8時(shí)，銀杏葉中蛋白質(zhì)基本被完全提取出來(lái)，隨著料液比增加，銀杏葉中蛋白質(zhì)的提取百分含量已經(jīng)平穩(wěn)，故選擇料液比1∶6、1∶8、1∶10 三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的增加，銀杏葉中蛋白質(zhì)提取百分含量逐漸上升，提取越充分，但到達(dá)2 h后，銀杏葉中蛋白質(zhì)的提取百分含量增加較緩慢，故選擇提取時(shí)間1 h、2 h、3 h 三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果

由極差分析結(jié)果（表3）可以看出，C因素影響效果比較顯著;考察因素強(qiáng)度為C>B>A，A因素中A2>A3>A1，B因素中B2>B1>B3，C因素中C2>C3>C1，最佳工藝條件為A2B2C2，即是料液比為1∶8，提取時(shí)間為2 h，提取溫度為70 ℃ 。

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果

從驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（表4）可以看出，三批次提取液中含量相差不大，說(shuō)明工藝穩(wěn)定，可以有效的提取銀杏葉中的蛋白質(zhì)。

3結(jié)論與討論

蛋白質(zhì)是一切生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，也是構(gòu)成生物細(xì)胞的重要成分，是動(dòng)物或者人類都不可缺少的物品。然而目前遇到非常嚴(yán)峻的問(wèn)題，在全球約有1/5的人口嚴(yán)重缺乏蛋白質(zhì)的補(bǔ)充，蛋白質(zhì)資源短缺已經(jīng)成為全球關(guān)注的問(wèn)題，特別是發(fā)展中國(guó)家[10]。除此之外，蛋白質(zhì)也是藥物研究的重要靶點(diǎn)。因此，解決蛋白質(zhì)資源短缺已經(jīng)成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。

中國(guó)是世界上銀杏分布最廣的區(qū)域，約占全球的85 %，銀杏葉富含多種活性物質(zhì)，例如黃酮、內(nèi)酯、多糖和烷基酚酸等。目前，銀杏的研究一直以來(lái)都吸引無(wú)數(shù)國(guó)內(nèi)外科研工作者的眼球，尤其是以黃酮、萜內(nèi)酯為主要有效成分的銀杏葉提取物的研究最受矚目，是銀杏葉開(kāi)發(fā)利用的重點(diǎn)[2-5]。據(jù)文獻(xiàn)[6，11]報(bào)道，銀杏葉中蛋白質(zhì)含量相對(duì)來(lái)說(shuō)不少，可作為蛋白質(zhì)來(lái)源的一種。本文采用正交法，以水為溶劑，料液比、提取時(shí)間、溫度為主要因素對(duì)銀杏葉中蛋白質(zhì)提取，紫外分光光度法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定。通過(guò)正交試驗(yàn)得到銀杏葉中蛋白質(zhì)提取工藝為：料液比為1∶8、提取時(shí)間為2 h、提取溫度為70 ℃。驗(yàn)證試驗(yàn)得到三批次提取液中蛋白質(zhì)含量為3.72 %，RSD%為0.12，說(shuō)明該工藝穩(wěn)定，可以有效的提取銀杏葉中的蛋白質(zhì)，該方法經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，可快速有效地從銀杏葉中提取蛋白質(zhì)，使銀杏葉在生產(chǎn)銀杏葉提取物的同時(shí)，可對(duì)其蛋白質(zhì)進(jìn)行提取回收利用。這不僅可以提高銀杏葉資源的綜合利用率，還可以減少生產(chǎn)廢液的排放，為充分利用銀杏葉資源提供實(shí)踐依據(jù)。

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