常芳娟,張貴云,張麗萍,呂貝貝,劉 珍,范巧蘭,姚 眾

(山西農業(yè)大學棉花研究所 運城 044000)

西瓜()富含維生物C 等多種營養(yǎng)物質,是世界上重要的園藝作物之一,我國是世界上最大的西瓜生產國和消費國。西瓜連作會影響植株生長發(fā)育,增加病蟲害發(fā)生率,發(fā)生產量和品質下降等連作障礙現象。我國耕地面積的限制、西瓜種植業(yè)集約化規(guī)?；奶岣摺⒔洕娴尿屖挂约吧a栽培條件的制約等,均加劇了西瓜連作障礙的發(fā)生,嚴重制約了西瓜產業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

研究表明,導致連作障礙的原因復雜多樣,土壤中的微生物區(qū)系和化學物質發(fā)生異常是造成土壤質量下降、連作障礙發(fā)生的本質原因,其中,土壤理化性質的劣變以及土傳病害的發(fā)生是主要的誘導因子。土壤化學熏蒸劑在防控植物土傳病害方面有較好的效果,但其長期使用會破壞土壤生態(tài)系統(tǒng),引發(fā)人類健康和生態(tài)環(huán)境的風險。因此,尋找可有效調控土壤微生物區(qū)系并解決連作土壤病害問題的綠色方案對西瓜產業(yè)的高質量可持續(xù)發(fā)展有著重要意義。

生物熏蒸是利用十字花科(Brassicaceae)或菊科(Compositae)等植物在分解過程中產生的揮發(fā)性生物活性物質抑制或殺死土壤中有害生物的方法。蕓薹屬()植物植株和果實中含有的硫代葡萄糖苷,在植物組織破碎腐解后,通過土壤微生物作用,被植物細胞中的黑芥子酶水解產生揮發(fā)性活性物質異硫氰酸酯,該類物質具有抑制病原真菌、殺滅植物寄生線蟲和提高土壤質量及作物產量等作用。Koron 等研究表明,蕓薹屬植物生物熏蒸可提高土壤有機質和礦質養(yǎng)分,并提高草莓()果實數量和葉片質量。Maxwell 等通過3年研究,發(fā)現芥菜型油菜()覆蓋顯著降低了水稻紋枯病的發(fā)病率和嚴重程度,并顯著提高了水稻()產量。

生物熏蒸以其綠色、安全、環(huán)保、成本低等優(yōu)點,引起研究者的廣泛關注。然而,土壤微生物間的關系錯綜復雜,單獨生物熏蒸無法保證土壤真菌群落的穩(wěn)定性,因此,在生物熏蒸的同時添加土壤有益微生物種類或數量,可調控土壤微生物區(qū)系向健康穩(wěn)定方向發(fā)展。解淀粉芽孢桿菌()可產生抗菌蛋白類、脂肽類抗生素等抑菌物質,并可通過競爭作用占據有利生態(tài)位點,從而提高作物抗病抗逆性、修復土壤微生態(tài)環(huán)境、促進作物健康生長。Qin 等研究發(fā)現解淀粉芽孢桿菌L-S60 顯著改變了黃瓜()根際微生物群落結構,并可促進黃瓜幼苗的生長。目前,關于西瓜連作障礙的防治研究多為化學熏蒸或化學熏蒸配施微生物菌劑,尚無生物熏蒸及其配施微生物菌劑相關的研究報道。本課題組在前期研究基礎上,采用Illumina HiSeq 高通量測序技術,研究了生物熏蒸及其配施微生物菌劑對連作西瓜土壤化學性質及真菌群落組成和多樣性的影響,以揭示土壤真菌群落結構對生物熏蒸及配施微生物菌劑的響應機制,為緩解或克服西瓜連作障礙提供理論依據,保障西瓜產業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試油菜品種‘晉黃芥’,芥菜型油菜,為課題組研究篩選出的高硫苷油菜品種。油菜根莖硫苷含量為60.82～70.64 μmol?g,油菜籽硫苷含量95.40 μmol?g。

解淀粉芽孢桿菌菌劑,有效成分含量1.2 億芽孢?g,江蘇省蘇科農化有限責任公司生產。

1.2 試驗設計

試驗地位于山西省運城市聞喜縣畖底鎮(zhèn)西顏村,該地土壤類型為褐土,是傳統(tǒng)的精耕細作農業(yè)區(qū),試驗前已連續(xù)種植兩年西瓜。試驗設置3 個處理,分別為:生物熏蒸處理(R)、生物熏蒸+解淀粉芽孢桿菌菌劑處理(RB)、空白對照(CK),每處理3 個重復,每小區(qū)面積45 m。R 處理2019年4月2日將達到終花期的油菜(12 000 kg?hm)粉碎,翻埋,澆水(450 m?hm),覆蓋薄膜,4月12日揭膜,通風敞氣10 d,4月22日覆膜播種西瓜; RB 處理在R 處理的基礎上,于西瓜播種時加施解淀粉芽孢桿菌菌劑,每穴施入6 g。供試西瓜品種為‘歐洲風暴’,行距2.5 m,株距45 cm,每小區(qū)定植40 株西瓜,田間管理照常規(guī)進行。

1.3 土壤樣本采集

于西瓜初花期(2019年6月9日),分別采集生物熏蒸處理(R)、生物熏蒸+解淀粉芽孢桿菌菌劑處理(RB)和空白對照(CK)的西瓜根圍土樣,每小區(qū)采用 “X”型5 點取樣法。移去表層土壤,用土鉆從5～20 cm土層垂直采集西瓜根部周圍0～5 cm 范圍土壤,每點采集3 份土樣,除去其中植物殘體、碎石及其他雜物等,充分混勻后裝入塑封袋中貼標簽放入冰盒中帶回實驗室。一部分土樣于?80 ℃冰箱保存,用于土壤真菌群落結構的分析。另一部分土樣自然風干后過2 mm 篩,用于土壤化學性質的測定。

1.4 測定方法

土壤pH 測定采用電位法,堿解氮(AN)測定采用堿解擴散法,有效磷(AP)測定采用0.5 mol?LNaHCO浸提-鉬銻抗比色法,速效鉀(AK)測定采用NHOAc 浸提-火焰光度法,全氮(TN)測定采用凱式定氮法,有機質(OM)測定采用重鉻酸鉀容量法。

土壤真菌總DNA 提取采用MN NucleoSpin 96 Soi 試劑盒,按說明書步驟進行。采用真菌ITS1 通用引物(F:5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3,R:5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3)對土壤真 菌ITS1 區(qū)進行擴增。目標區(qū)域PCR 反應體系為10 μL:樣品DNA 50 ng、上游和下游引物(10 μmoL?L)各0.3 μL、KOD FX Neo Buffer 5 μL、dNTP (2 mmol?Leach) 2 μL、KOD FX Neo 0.2 μL、ddHO 補至10 μL。PCR 反應條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃40 s,25 個循環(huán); 72 ℃ 7 min。將目的區(qū)域 PCR 純化后進行Solexa PCR 擴增,反應體系為20 μL:目的區(qū)域 PCR 純化產物5 μL,Solexa Primer 引物(2 μmoL?L)各2.5 μL,2×Q5 HF MM 10 μL,ddHO 補至20 μL。PCR 反應條件:98 ℃ 30 s,98 ℃ 10 s,65 ℃ 30 s,72 ℃30 s,10 個循環(huán); 72 ℃ 5 min。將第二次PCR 擴增產物進行定量、混樣、純化后,用1.8%的瓊脂糖凝膠,120 V 40 min 電泳后,切目的片段用Monarch DNA 試劑盒回收。利用 Illumina HiSeq 測序平臺進行高通量測序,測序委托北京百邁克生物科技有限公司完成。

將測序得到的原始序列進行雙端拼接、過濾去除嵌合體后得到高質量序列,使用Usearch 軟件對高質量序列在97%的相似度水平下進行聚類,劃分OTU,并基于微生物分類學數據庫分析每個OTU 對應的物種分類信息,進而獲得各分類水平上各樣品的群落組成,利用QIIME 軟件生成不同分類水平上的物種豐度表,利用R 語言工具繪制成樣品各分類學水平下的群落結構圖。使用Mothur 軟件和R 語言工具對樣品進行Alpha 多樣性分析,研究單個樣品內部的物種豐度及物種多樣性,得到各樣品Alpha 多樣性指數值,繪制樣品稀釋曲線。使用QIIME 軟件進行 Beta 多樣性分析,根據距離矩陣獲得相應距離下的樣品層次聚類(UPGMA)樹。并通過相關性與關聯(lián)分析研究菌群與環(huán)境因子之間的關系。進而評估生物熏蒸及配施微生物菌劑對西瓜連作土壤真菌群落組成和多樣性的影響。以上分析均在BMKCloud云平臺網站上完成。采用SPSS 17.0 和Microsoft Excel進行實驗數據的分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理對土壤化學性質的影響

不同處理土壤化學性質如表1 所示。與CK 相比,R 和RB 處理的土壤pH 有所降低,而堿解氮、有效磷、速效鉀、全氮及有機質含量均有提高,提高幅度分別為4.35%和19.13%、42.31%和10.77%、29.30%和 16.83%、 15.67%和 10.67%、 9.28%和5.10%,除全氮含量顯著增加外,其他差異均未達顯著水平。R 與RB 相比,有效磷、速效鉀、全氮、有機質含量均表現為R>RB,堿解氮含量為RB>R。說明高硫苷油菜作為綠肥,改善了土壤的理化性質,提高了土壤肥力。

表1 不同處理土壤化學性質分析Table 1 Analysis of chemical properties of soil under different treatments

2.2 不同處理土壤真菌群落豐度和多樣性分析

稀釋性曲線是表征樣品測序數據量是否充分,能否足以反映樣品中物種多樣性的重要依據。由圖1可知,3 個土壤樣品的OTU 數隨測序數量的增加快速上升,當抽取的序列條數達40 000 條以上時,稀釋曲線趨于平緩,表明樣品序列充分、數據合理,增加更多的測序量對OTU 數增多的貢獻率也較小,當前測序量能充分反映出3 個樣品真菌群落物種多樣性和豐富度的真實信息。

圖1 不同處理土壤樣品稀釋曲線Fig.1 Soil fungal rarefaction curves of different treatments

對測序的有效序列在97%的相似度水平下聚類獲得的OTU 分布Venn 圖(圖2)顯示,3 個處理共產生794 個OTU,其中,共有的OTU 為720 個,占OTU總數的90.68%。CK、R 和RB 的OTU 數分別為778、753 和755,CK、R 和RB 特有的OTU 數分別為15、5 和2。CK 與RB、CK 與R、R 與RB 共有的OTU數分別為744、739 和729 個,CK 與RB 的共有數最高。說明生物熏蒸及其配施微生物菌劑均不同程度地降低了西瓜連作土壤真菌群落種類和數量,添加微生物菌劑可一定程度上穩(wěn)定西瓜連作土壤真菌群落結構。

圖2 不同處理土壤真菌Venn 圖Fig.2 Venn diagrams of soil fungal community under different treatments

Alpha 指數可反映單個樣品內物種的豐度(ACE和Chao1 指數)和多樣性(Shannon 和Simpson 指數)。本試驗測序覆蓋率均達99%以上,說明本次測序結果能反映樣本土壤中真菌群落的實際情況。由表2可知,土壤真菌群落豐度和多樣性指數均表現為R

表2 不同處理土壤真菌群落豐度和多樣性指數Table 2 Abundance and diversity indexes of soil fungal communities of different treatments

2.3 不同處理土壤真菌群落結構分析

不同處理土壤真菌門水平的群落組成及分布如圖3 所示。門分類水平共檢測出10 個菌門,其中子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和被孢霉門(Mortierellomycota)為3 個主要菌門,在R、RB 和CK 中這3 類菌群所占比例分別為96.17%、95.71%和95.14%。相對豐度最高的為子囊菌門,在各處理中所占豐度比例大小依次為RB (79.24%)>R(75.80%)>CK (75.60%),處理間差異達顯著水平(<0.05); 被孢霉門在3 個處理間的相對豐度為7.57%～8.10%,各處理間差異不顯著。RB 處理顯著降低了擔子菌門的比例,與CK 相比,降低25.96%(<0.05)。未分類菌門所占比例為2.74%～4.13%,在各處理中相對豐度表現為R

圖3 不同處理土壤真菌門水平的群落組成及分布Fig.3 Composition and distribution of soil fungal communities at phylum level in different treatments

不同處理土壤真菌群落在科水平上差異如圖4所示。豐度前5 的科分別為毛殼菌科(Chaetomiaceae)、從赤殼科(Nectriaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、小囊菌科(Microascaceae)和柔膜菌科(Helotiaceae),其中毛殼菌科真菌是試驗地連作西瓜土壤中的主要菌群,其在RB 處理土壤中的相對豐度最高,其次為R 處理土壤,與CK 相比,相對豐度分別增加11.80%和6.66%。被孢霉科在3 個處理間的相對豐度為7.39%～7.98%,各處理間差異不顯著。R 和RB處理均不同程度增加了土壤中小囊菌科的相對豐度,RB 處理還顯著增加了從赤殼科的相對豐度(<0.05),降低了柔膜菌科在土壤的相對豐度。其他菌科真菌(15.12%～19.47%)及未分類菌科(6.44%～8.64%)真菌在生物熏蒸及其配施微生物菌劑后相對豐度均有不同程度降低。

圖4 不同處理土壤真菌科水平的群落組成及分布Fig.4 Composition and distribution of soil fungal communities at family level in different treatments

采用UPGMA 對樣品進行聚類分析,結果表明(圖5),土壤真菌群落聚類分為兩支,RB 與CK 的真菌群落間遺傳距離較近,群落組成相似度高,聚為一支,而R 則獨立為一支。說明高硫苷油菜熏蒸可改變土壤真菌群落結構,而添加微生物菌劑后可調節(jié)土壤微生物群落組成,使土壤真菌群落向穩(wěn)定和多樣化方向發(fā)展。

圖5 不同處理土壤真菌群落相似性聚類樹Fig.5 Similarity cluster trees of soil fungal community in different treatments

2.4 不同處理土壤真菌群落與土壤環(huán)境因子的關聯(lián)分析

RDA 分析可直觀地反映土壤真菌群落與環(huán)境因子之間的相關性。如圖6 所示,第一、二排序軸對土壤真菌群落變化的解釋率分別為23.32%和17.87%,總解釋率達41.19%。有機質(OM)含量與土壤真菌群落結構的相關性最大,全氮(TN)、速效鉀(AK)和pH 次之,有效磷(AP)和堿解氮(AN)的影響較小。pH 與AP、TN 與AK 的矢量箭頭之間夾角為銳角,表明其間可能具有協(xié)同效應。3 個處理中,RB 的3個樣本距離較近,CK 的3 個樣本距離較遠,可能與菌群空間分布的復雜性和不均勻性相關。

圖6 不同處理土壤真菌群落與土壤環(huán)境因子的關聯(lián)分析Fig.6 Redundancy analysis for fungal groups and soil environmental factors under different treatments

3 討論

油菜是我國廣泛種植的蕓薹屬植物,作為綠肥還田有較好的土壤培肥優(yōu)勢。土壤養(yǎng)分是物質循環(huán)和能量流動的主要驅動力,土壤pH、全氮、堿解氮、速效鉀、有機質和有效磷等為土壤基本化學指標,可反映土壤肥力,進而直接或間接地影響土壤微生物群落組成和作物生長。本研究結果表明,生物熏蒸及其配施微生物菌劑均降低了土壤pH,提高了土壤堿解氮、有效磷、速效鉀、全氮及有機質的含量,這與Koron 等、劉哲輝等的研究結果一致。這可能是油菜作為綠肥,磷鉀含量高,可活化土壤中難溶性磷,干物質碳氮比適中,在土壤中分解直接為土壤帶來了部分氮磷鉀等營養(yǎng)元素; 另一方面,微生物是土壤養(yǎng)分重要的源和匯,油菜綠肥還田促進了土壤微生物的代謝活動,這些微生物的活動又影響了土壤營養(yǎng)元素含量。本研究中RDA 分析結果表明有機質、全氮、速效鉀和pH 為影響土壤真菌群落結構的關鍵因子,其中有機質的影響最大。土壤有機質是農田肥力的基礎和核心,油菜綠肥還田可提高土壤有機質。宋以玲等還發(fā)現施用復合微生物菌劑可降低土壤pH,提高土壤有效養(yǎng)分和有機質含量。林葉春等研究表明土壤pH 和有機質含量是影響植煙土壤微生物群落結構變化的主要因素,這均與本研究結果相似。土壤微生物對外界環(huán)境變化十分敏感,傅海平等通過研究綠肥間作對茶樹()根際土壤真菌群落結構的影響發(fā)現,全磷、有效磷、有機質、全氮和堿解氮是影響真菌群落結構的主要因素,這與本研究相異,可能是因氣候、地理環(huán)境、土壤養(yǎng)分等的差異造成的。

土壤真菌是土壤中重要的微生物,在分解有機質、養(yǎng)分循環(huán)和交換、植物土傳病蟲害生物防治及促進植物生長發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用。Hollister 等研究發(fā)現,芥菜籽粕能顯著影響土壤微生物群落結構,使真菌群落豐富度降低60%以上。張春怡等的研究結果表明,生物熏蒸結合微生物菌劑可降低茄子()連作土壤真菌群落的豐富度和多樣性,減少土傳病原菌的比例,增加

有益菌相對豐度,驅動土壤真菌群落的生態(tài)演替。本研究中,高硫苷油菜生物熏蒸降低了連作西瓜土壤真菌群落的豐富度和多樣性,配施解淀粉芽孢桿菌菌劑后,使真菌群落的豐度和多樣性有所提升,同時UPGMA 聚類分析發(fā)現,RB 與CK 的真菌群落結構相似度較高,這與張慶華等的研究結果相似。說明生物熏蒸及其配施微生物菌劑在一定程度上可影響微生物群落組成和多樣性。 這可能是生物熏蒸具有廣譜性,釋放的抑菌活性物質在殺滅土壤病原菌的同時,也降低了有益菌群的比例,而微生物菌劑的加入為土壤微生物環(huán)境注入了新的活力,在發(fā)揮生防潛能的同時有益于調節(jié)微生物群落結構向健康可持續(xù)方向發(fā)展。

油菜綠肥還田可刺激土壤微生物活性,影響微生物群落結構。Campanella 等研究發(fā)現,蕓薹屬植物作為綠肥破碎翻壓到土壤后,小麥()根腐病菌和小麥雪霉葉枯病幾乎完全滅絕,鐮刀菌(spp.)種群數量也顯著降低; Robert等研究表明,高硫代葡萄糖苷的芥菜混合物可顯著減少馬鈴薯()黃萎病發(fā)病率,并可減少其他土傳病害如馬鈴薯黑痣病和瘡痂病的發(fā)生。本研究中,土壤真菌群落組成結果分析表明,子囊菌門、擔子菌門和被孢霉門為3 個主要菌門,其中,相對豐度最高的為子囊菌門。生物熏蒸顯著增加了土壤中子囊菌門和擔子菌門真菌的相對豐度,配施微生物菌劑后子囊菌門真菌相對豐度增加,擔子菌門真菌相對豐度有所降低,這與胡洪濤等的研究結果相似。子囊菌和擔子菌多為土壤腐生真菌,在土壤木質素含量較高的環(huán)境中為優(yōu)勢菌,是復雜化合物及有機質的重要分解者,在養(yǎng)分循環(huán)中擔任著重要角色。擔子菌可高效分解木質化植被碎屑,其滑銹傘屬()、絲膜菌屬()可與植物共生形成菌根,增強植株抗性。推測子囊菌和擔子菌的增加與土壤有機質含量和土壤肥力的提升有關,這可能是高硫苷油菜的綠肥作用,纖維素和木質素等有機物隨秸稈的輸入促進了腐生真菌的活動,使子囊菌和擔子菌菌群得到快速增長與繁殖。而解淀粉芽孢桿菌菌劑的加入,可能抑制了擔子菌門中導致植物病害的真菌生長繁殖,如瓜亡革菌()。

研究表明,毛殼菌科中的毛殼菌(spp.)可降解纖維素、木質素等有機物,在防治植物病害方面也極具發(fā)展?jié)摿?。Joong-Hyeop 等從球毛殼菌() F0142 中分離得到的抑菌活性物質對稻瘟病和小麥葉銹病有較好的防效,并對番茄晚疫病菌也有一定的控制作用。本研究中,土壤真菌群落科水平上,毛殼菌科為主要優(yōu)勢菌群,在高硫苷油菜生物熏蒸配施解淀粉芽孢桿菌菌劑處理土壤中的相對豐度最高，其次為單獨生物熏蒸土壤。這與張春怡等關于蕓薹屬植物可增加土壤中毛殼菌豐度的研究結果一致。黎妍妍等也發(fā)現解淀粉芽孢桿菌YH-22 可促使土壤中毛殼菌、木霉菌等有益菌的比例上升。此外,本研究發(fā)現R 和RB 處理均增加了土壤中小囊菌科的相對豐度,RB 處理還顯著增加了從赤殼科的相對豐度,降低了柔膜菌科在土壤中的相對豐度。從赤殼科、小囊菌科、柔膜菌科均為子囊菌門真菌,在自然界循環(huán)中起到降解腐爛有機質、纖維素等的作用。柔膜菌科真菌多數為腐生菌,少數可寄生,引起植物病害,如Minji等和Andrej 等均發(fā)現其薄盤菌屬()中的可導致嚴重的松樹(spp.)枯梢病。說明微生物菌劑通過調節(jié)土壤微生物群落結構,在促進有益菌繁殖的同時抑制或殺滅了有害病原菌,從而減輕土傳病害。

4 結論

本研究利用高通量測序技術,揭示了生物熏蒸及其配施微生物菌劑對連作西瓜土壤真菌群落結構的影響機制。生物熏蒸及生物熏蒸配施微生物菌劑降低了土壤pH,提高了土壤堿解氮、有效磷、速效鉀、全氮及有機質的含量,其中有機質、全氮、速效鉀和pH 為影響土壤真菌群落結構的主要因子。西瓜連作土壤中優(yōu)勢菌門為子囊菌門、擔子菌門和被孢霉門,生物熏蒸可顯著降低土壤真菌群落豐富度和多樣性,配施解淀粉芽孢桿菌菌劑可調節(jié)西瓜連作土壤微生物群落結構,提高真菌群落豐度和多樣性,使連作土壤微生物區(qū)系朝健康穩(wěn)定方向發(fā)展。本研究為生物熏蒸配施微生物菌劑在實際生產中的應用提供了一定的參考依據,為緩解或克服西瓜連作障礙提供了有效的措施。但西瓜連作土壤細菌群落結構對生物熏蒸配施微生物菌劑的響應機制還有待研究,因此在后續(xù)工作中,將進一步研究生物熏蒸配施微生物菌劑對常見西瓜土傳病害的調控機制,為保障西瓜產業(yè)高質量可持續(xù)發(fā)展提供有效方案。