陳婷，張嬌，王曉鴿，康楠，王鳳云，唐旭東

1中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院脾胃病研究所，北京 100091；2北京市昌平區(qū)中醫(yī)醫(yī)院脾胃病科；3河南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院脾胃肝膽科；4濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科

Caco-2細胞來源于人結(jié)腸腺癌細胞系，體外培養(yǎng)條件下可在有孔的多聚碳酸脂膜上分化為連續(xù)的細胞單層后，自發(fā)地進行上皮樣分化，其結(jié)構(gòu)與功能均類似于人腸上皮細胞，如形成微絨毛結(jié)構(gòu)、在細胞表面形成良好的刷狀緣以及在細胞間形成緊密連接等［1-5］?，F(xiàn)階段，該模型已廣泛應(yīng)用于藥理、生化、毒理及腸上皮細胞緊密連接等相關(guān)研究，是目前應(yīng)用最廣泛、最經(jīng)典的模型之一［6-9］。目前，國內(nèi)外關(guān)于評估采用Caco-2細胞構(gòu)建腸上皮細胞緊密連接模型的研究比較少，且評估方法未達成統(tǒng)一標準。2020年11月—2021年6月，本研究通過體外分化Caco-2細胞構(gòu)建腸上皮細胞緊密連接模型，并采用動態(tài)測定細胞跨膜電阻（TER）、大分子物質(zhì)熒光黃（FD-4）通透率、堿性磷酸酶（ALP）活性及觀察透射電鏡下細胞形態(tài)等對其進行綜合評價?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料實驗細胞：Caco-2細胞株（311C0001 CCC000100）購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)細胞中心。主要試劑：MEM培養(yǎng)基、優(yōu)級胎牛血清、非必需氨基酸、青—鏈霉素雙抗液、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖、二甲砷酸鈉均購自美國Sigma公司，Transwell板購自美國Corning公司，ALP試劑盒購自南京建成生物工程研究所，戊二醛、鋨酸均購自北京中鏡科技有限公司，環(huán)氧樹脂SPI-CHEM、醋酸雙氧鈾均購自德國SPI-CHEM公司。

1.2 腸上皮細胞緊密連接模型的建立方法將Caco-2細胞用含10%胎牛血清、1%青—鏈霉素雙抗液、1%非必需氨基酸的MEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)4～5 d細胞融合至90%時，采用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。以8×104/孔接種于Transwell 24孔培養(yǎng)板上（孔徑為0.4 μm，膜面積為0.33 cm2），每孔基底側(cè)加入MEM培養(yǎng)基600 μL，頂側(cè)加入細胞懸液100 μL。接種后第1周隔日更換培養(yǎng)液，第2周起每日更換培養(yǎng)液，直至培養(yǎng)第21天。

1.3 腸上皮細胞緊密連接模型的評價方法

1.3.1 細胞單層完整性分別于細胞培養(yǎng)第3、5、7、15、19、21天，使用細胞電阻儀測定TER，以了解單層完整性的動態(tài)形成過程［10］。為保證數(shù)值的穩(wěn)定性與準確性，測量時依次測定Transwell 24孔板3個不同方向的電阻值，取平均值乘以Transwell培養(yǎng)板的膜面積，即為細胞的TER。TER越高提示細胞間緊密連接越致密、細胞單層完整性越好。實驗重復(fù)6次，取平均值。

1.3.2 細胞單層極性分別于細胞培養(yǎng)第5、15、21天，取細胞單層頂側(cè)與基底側(cè)培養(yǎng)基，通過多功能酶標儀檢測其ALP活力，并計算二者的比值。頂側(cè)與基底側(cè)ALP活力比越高提示ALP逐漸向頂側(cè)刷狀緣集中，即單層極性越好。實驗重復(fù)6次，取平均值。

1.3.3 細胞單層通透性取體外分化培養(yǎng)21天的Caco-2細胞，用預(yù)溫至37℃的HBSS溶液緩慢沖洗Transwell 24孔板兩次，于Transwell 24孔板頂部加入0.1 mg/mL熒光標記的FD-4 100 μL，下層加入HBSS緩沖液600 μL。將細胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，孵育1 h。分別于Transwell小室上層與下層各取100 μL，使用多功能酶標儀計算熒光吸光度，計算FD-4通過單層細胞的百分率（FD-4通透率）及跨膜轉(zhuǎn)運表觀滲透系數(shù)（Papp）。Papp及FD-4通透率越低提示細胞單層完整性越好。實驗重復(fù)6次，取平均值。

1.3.4 細胞形態(tài)取體外分化培養(yǎng)21天的Caco-2細胞，用預(yù)溫至37℃的PBS緩沖液沖洗3遍，4℃條件下采用含2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的固定液固定2 h；用手術(shù)刀片將Transwell膜沿小室邊緣切下，置于載玻片上，滴1滴預(yù)冷的固定液，用薄刀片將細胞修成1 mm3大小。使用0.1 mol/L二甲砷酸鈉緩沖液漂洗，梯度乙醇脫水，環(huán)氧乙烷置換、浸透。將樣本進行包埋聚合修塊、切片后進行染色，最后在透射電鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用K-S正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布以±s表示，數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測量的多因素方差分析或t檢驗，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞單層完整性檢測結(jié)果隨著分化時間的延長，Caco-2細胞的TER呈逐漸升高趨勢。Caco-2細胞體外分化培養(yǎng)第3、5、7、15、19、21天的TER分別為（220.25±9.46）、（722.03±9.57）、（1 056.20±46.75）、（1 116.91±161.93）、（1 423.05±200.92）、（1 568.08±206.46）Ω·cm2，Caco-2細胞體外分化培養(yǎng)第3、5、7、15天的TER均明顯低于第19、21天（P均<0.05），Caco-2細胞體外分化培養(yǎng)第19和21天TER比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

2.2 細胞單層極性檢測結(jié)果Caco-2細胞體外分化培養(yǎng)第5、15、21天頂側(cè)與基底側(cè)ALP活力比分別為1.43±0.16、2.43±0.28、4.85±0.25，Caco-2細胞體外分化培養(yǎng)第5、15天頂側(cè)與基底側(cè)ALP活力比均明顯低于第21天（P均<0.05）。

2.3 細胞單層通透性檢測結(jié)果體外分化培養(yǎng)第21天的Caco-2細胞FD-4通透率為2.31%±1.12%，Papp為（1.95±0.90）×10-7cm/s。

2.4 細胞形態(tài)觀察結(jié)果透射電鏡觀察結(jié)果顯示，體外分化培養(yǎng)第21天的Caco-2細胞由微絨毛形成的刷狀緣排列整齊致密，見OSID碼圖1A；細胞頂側(cè)面分化出完整的緊密連接結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為連續(xù)的融合點，呈“焊接線”樣圍繞在細胞膜的頂部，相鄰細胞膜被“焊接”在一起，形成繩索樣結(jié)構(gòu)，見OSID碼圖1B。

3 討論

Caco-2細胞來源于人結(jié)腸癌細胞，經(jīng)過特定培養(yǎng)后，細胞單層可分化出絨毛面頂側(cè)和基底面基底側(cè)，表現(xiàn)出細胞極性，且具有明確界定的頂端刷狀邊緣和緊密的細胞連接，形態(tài)學(xué)上與小腸上皮細胞相類似［1-5］?，F(xiàn)階段，關(guān)于Caco-2細胞培養(yǎng)及腸上皮細胞緊密連接模型建立的方法已有較多文獻報道，但由于細胞來源以及不同實驗室培養(yǎng)條件的差異，使得建模后細胞形態(tài)、單層完整性及轉(zhuǎn)運特性等方面存在一定的異質(zhì)性［8-9］。因此，在利用Caco-2細胞建立腸上皮細胞緊密連接模型進行實驗前，首先需要根據(jù)不同的實驗條件對模型進行評價，以保證后續(xù)實驗的順利進行?，F(xiàn)階段常用的模型評價指標主要包括［10-12］：①測定細胞單層的TER；②測定細胞分化不同階段ALP的活性；③透射電鏡下觀察緊密連接及微絨毛結(jié)構(gòu)；④用辣根過氧化物酶測定Caco-2細胞的胞飲功能。只有同時滿足兩個及以上條件才能說明細胞單層的致密性與完整性良好。

本研究主要選用TER動態(tài)變化、ALP活力測定、FD-4通透率及透射電鏡下細胞形態(tài)來評價建立的腸上皮緊密連接模型的完整性與致密性。①TER：TER是離子經(jīng)細胞間隙的流動形成的，可在一定程度上反映細胞單層的完整性與致密性，TER越大表明細胞間緊密連接越致密。因其操作方便且不影響后續(xù)實驗，因此許多研究將該指標作為評價細胞單層完整性的首選指標。本研究結(jié)果顯示，隨著分化時間的延長，Caco-2細胞的TER呈逐漸升高趨勢；體外分化前3天尚處于分裂增殖階段，單層細胞尚未融合，故TER增長較慢；體外分化4～5天細胞單層融合后，TER迅速升高，第7天可達（1 056.2.0±46.75）Ω·cm2；而后緩慢增長，第19～21天TER值增長幅度較小，并維持在一個較恒定的值。但是，TER受細胞本身生長狀態(tài)、離子大小及Transwell培養(yǎng)板（孔徑、膜面積、膜材質(zhì)以及是否涂膠）等因素的影響，故應(yīng)進一步聯(lián)合其他指標進行評價。②ALP：ALP是刷狀緣標志性酶，可作為衡量腸上皮分化程度及細胞極性的特異性標志物。在細胞生長過程中，ALP逐漸向頂側(cè)集中，因此不同時間段頂側(cè)和基底側(cè)ALP的活性可反映細胞單層的生化特性和細胞極性，頂側(cè)和基底側(cè)ALP比值越大提示細胞極性越好。本研究結(jié)果表明，隨著分化時間的延長，Caco-2細胞單層兩側(cè)ALP活力差異逐漸增加，體外分化培養(yǎng)第5、15天頂側(cè)與基底側(cè)ALP活力比均明顯低于第21天；這表明分化至21天時，ALP逐漸向刷狀緣集中，分化后的細胞已具有明顯的極性。③細胞單層通透性：在正常情況下，完整的腸上皮僅允許離子及小分子可溶性物質(zhì)跨細胞旁通路轉(zhuǎn)運，大分子物質(zhì)無法通過。因此，F(xiàn)D-4作為熒光標記的大分子物質(zhì)，通過測定其從頂側(cè)向基底側(cè)的被動擴散Papp及通透率，可反映腸上皮緊密連接是否完整。本研究結(jié)果表明，Caco-2細胞體外分化21天的FD-4通透率僅為2.31%±1.12%，Papp為（1.95±0.90）×10-7cm/s，小于既往文獻報道的<1×10-6cm/s［13-15］，提示本實驗條件下構(gòu)建的腸上皮緊密連接模型細胞單層通透性符合要求。④細胞形態(tài)觀察：透射電鏡下的細胞形態(tài)觀察是評價腸上皮緊密連接模型的最直觀的指標。微絨毛與緊密連接結(jié)構(gòu)是腸上皮分化的特征性標志，也是評價腸上皮模型最為客觀的指標。本研究透射電鏡觀察結(jié)果顯示，Caco-2細胞體外分化至21天，由微絨毛形成的刷狀緣排列整齊致密；在細胞頂側(cè)面分化出了完整的緊密連接結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為連續(xù)的融合點，成“焊接線”樣圍繞在細胞膜的頂部，相鄰細胞膜被“焊接”在一起，形成了繩索樣結(jié)構(gòu)。

綜上所述，基于TER、FD-4通透率、ALP活力及透射電鏡下細胞形態(tài)學(xué)觀察等結(jié)果，在本實驗培養(yǎng)條件下Caco-2細胞體外分化21天后可形成腸上皮細胞緊密連接結(jié)構(gòu)，成功構(gòu)建腸上皮細胞緊密連接模型。