李瑩玉， 賀小賢， 蔣合陽(yáng)， 曹娟娟， 肖 苗， 蘆 平， 劉 歡, 2*

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院， 陜西 西安 710021)

0 引言

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)是海水環(huán)境中一種常見的條件致病菌.該菌為兼性厭氧菌，具有進(jìn)行液體條件下游動(dòng)的極生鞭毛和固體表面爬動(dòng)的周生鞭毛系統(tǒng)，無(wú)芽孢和莢膜，最適生長(zhǎng)溫度為17 ℃～35 ℃.溶藻弧菌也是一種重要的食源性病原菌，主要分布在海洋、湖泊、河口和入?？诘人w環(huán)境中，由溶藻弧菌引起的魚體發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為出血癥，呈現(xiàn)為受感染的魚體行動(dòng)變得遲緩，進(jìn)食次數(shù)減少，皮膚暗淡無(wú)光，魚鱗開始掉落，魚體表面發(fā)生潰瘍甚至出血，同時(shí)魚體內(nèi)部的腹膜、肝臟、魚鰾以及腸壁毛細(xì)管出現(xiàn)充血現(xiàn)象.溶藻弧菌容易引起淺表傷口和耳部感染(中耳炎和外耳炎)，如果人食用了被溶藻弧菌污染的海產(chǎn)品，會(huì)引起食物中毒、腹瀉和腸胃炎等癥狀[1-3].為應(yīng)對(duì)快速變化的環(huán)境，溶藻弧菌體內(nèi)進(jìn)化出了多種感染機(jī)制，包括菌落相變、生物被膜和群體感應(yīng)等[4-6].這些機(jī)制通過(guò)細(xì)菌體內(nèi)復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)，而基因表達(dá)的調(diào)控包括表達(dá)過(guò)程的所有階段，即轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯以及翻譯后修飾[7，8].

雙組分系統(tǒng)(Two-component systems，TCS)是一種常見的細(xì)菌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通訊模式，它們?cè)谏矬w內(nèi)感知和傳遞各種不同的輸入信號(hào)，對(duì)細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境變化進(jìn)行適應(yīng)性反應(yīng).在原核生物中，雙組分系統(tǒng)通常是由一個(gè)膜結(jié)合傳感器組氨酸激酶(Histitine kinase sensor,HK)和一個(gè)DNA結(jié)合響應(yīng)調(diào)控元件(Responce regulator,RR)組成.當(dāng)傳感器激酶感知胞外信號(hào)后會(huì)發(fā)生自磷酸化，隨后磷酸基團(tuán)會(huì)轉(zhuǎn)移至響應(yīng)調(diào)控元件，使其由“非活性”轉(zhuǎn)變?yōu)椤盎钚浴睜顟B(tài)，激活后的響應(yīng)調(diào)控元件通過(guò)與靶標(biāo)DNA的結(jié)合影響其轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同細(xì)胞功能的調(diào)控[9，10].TCS廣泛參與調(diào)控細(xì)菌的各種生理功能，包括細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖、致病性、毒力因子表達(dá)、環(huán)境應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)獲取和代謝以及抗生素耐藥性等[11-15].細(xì)菌HK作為關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)TCS的組分，已成為新型抑菌劑的潛在靶標(biāo)而備受關(guān)注[16].在大腸桿菌中，BaeSR是五大細(xì)胞壓力應(yīng)激系統(tǒng)(BaeSR,CpxAR,RscBC,Psp和σE)之一，由組氨酸激酶BaeS和響應(yīng)元件BaeR組成，參與多重耐藥性、趨化性、鞭毛合成、六型分泌系統(tǒng)合成、滲透壓、缺鐵應(yīng)激等多種生理功能的調(diào)控[17-20].而關(guān)于BaeSR在溶藻弧菌中的作用尚未見報(bào)道.本文對(duì)溶藻弧菌組氨酸激酶BaeS進(jìn)行序列分析以及突變株的構(gòu)建，通過(guò)對(duì)毒力因子表達(dá)以及不同環(huán)境壓力下的生長(zhǎng)分析，初步明確了BaeS對(duì)溶藻弧菌毒力、抗生素耐受性以及溫度、SDS、吐溫等不同環(huán)境應(yīng)激的調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究BaeSR對(duì)溶藻弧菌生理功能的調(diào)控機(jī)制以及新型抑菌劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株、培養(yǎng)基及試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

溶藻弧菌EPGS(WT)，質(zhì)粒pDM4，大腸桿菌DH5α，DH5αλpir，SM10λpir均為實(shí)驗(yàn)室保存；pDM19-T載體購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司.

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

LB培養(yǎng)基：1%(w/v)NaCl、1%(w/v)胰蛋白胨、0.5%(w/v)酵母提取物.

LBS培養(yǎng)基：3%(w/v)NaCl、1%(w/v)胰蛋白胨、0.5%(w/v)酵母提取物.

固體培養(yǎng)基則添加1.5%(w/v)瓊脂，溶藻弧菌在培養(yǎng)過(guò)程中添加氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)100μg/mL，大腸桿菌則根據(jù)質(zhì)粒特性添加對(duì)應(yīng)的抗生素.

1.2 主要儀器與設(shè)備

Micro 17型低溫高速離心機(jī)，芬蘭賽默飛世爾科技有限公司；移液器，德國(guó)Eppendorf公司； WH-3型渦旋混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；DSX-280B型手提式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；DK-98 II型核酸定量?jī)x，美國(guó)Quawell；Agilent 2100型生物電泳圖像分析系統(tǒng)，美國(guó)安捷倫；Varioskan Flash型酶標(biāo)儀，芬蘭賽默飛世爾科技有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株生長(zhǎng)條件

溶藻弧菌在LBS培養(yǎng)基30 ℃下培養(yǎng)，大腸桿菌在LB培養(yǎng)基37 ℃下培養(yǎng)，固體靜置，液體則在200 rpm下震蕩培養(yǎng).

1.3.2 氨基酸序列比對(duì)及結(jié)構(gòu)域分析

將BaeS氨基酸序列提交至Interpro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)進(jìn)行其保守結(jié)構(gòu)域的分析，同時(shí)利用Genedoc軟件對(duì)不同細(xì)菌的BaeS氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析.

1.3.3ΔbaeS突變株的構(gòu)建

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的溶藻弧菌EPGS全基因組序列，以baeS基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)上游同源臂引物對(duì)baeSup-F/R和下游同源臂引物對(duì)baeSdown-F/R，由北京擎科生物科技有限公司合成.利用Overlap PCR構(gòu)建ΔbaeS片段后與pDM4進(jìn)行連接重組，并依次轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5αλpir和SM10λpir，挑取陽(yáng)性克隆株并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，對(duì)重組克隆株進(jìn)行保種.將溶藻弧菌WT與含有pDM4-ΔbaeS質(zhì)粒的大腸桿菌SM10λpir供體菌分別于30 ℃和37 ℃搖床活化培養(yǎng)后，接種至對(duì)應(yīng)的新鮮液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600為0.8左右，進(jìn)行接合實(shí)驗(yàn)，通過(guò)兩輪同源重組交換，篩選得到ΔbaeS突變株.

1.3.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將活化好的溶藻弧菌野生株WT和突變株ΔbaeS菌液濃度統(tǒng)一至OD600=1.0，按1%接種量分別將野生株WT和突變株ΔbaeS接種到50 mL LBS液體培養(yǎng)基中，同時(shí)添加100μg/mL Amp，30 ℃、200 rpm培養(yǎng)，每小時(shí)取樣測(cè)定OD600，連續(xù)取12 h，繪制生長(zhǎng)曲線，至少做三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn).

1.3.5 運(yùn)動(dòng)性的測(cè)定

對(duì)于運(yùn)動(dòng)性的測(cè)定參考鄧益琴等[21]的方法：將活化的菌液濃度調(diào)整至OD600=1.0，分別取2μL菌液，垂直懸空滴加到含有0.3%(軟平板)和1.5%(硬平板)瓊脂粉的LBS平板上，待菌液晾干后放于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱，硬平板倒置培養(yǎng)12 h，軟平板正置培養(yǎng)9 h，取出拍照.

1.3.6 生物被膜的測(cè)定

采用結(jié)晶紫染色法測(cè)定生物被膜的形成[22]，將活化后的菌液濃度稀釋至相同值(OD600=1.0)，用移液槍吸取30μL菌液滴加到含有10 mL LBS培養(yǎng)基的血清瓶中，放于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng)24 h，不可搖晃.輕輕地取出血清瓶，在每個(gè)血清瓶中滴入2%(w/v)結(jié)晶紫溶液，靜置5 min后倒出培養(yǎng)液，并用純凈水緩慢地沖洗血清瓶直至流出的水呈無(wú)色狀態(tài)，將血清瓶放置60 ℃干燥箱烘干，拍照保存；之后向每個(gè)血清瓶中加入1 mL 33%(v/v)冰乙酸溶解染色的生物被膜，在570 nm處測(cè)定其吸光值.每個(gè)菌株至少進(jìn)行三個(gè)獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn).

1.3.7 胞外蛋白酶活性測(cè)定

首先對(duì)溶藻弧菌胞外蛋白酶的活性進(jìn)行定量檢測(cè)，將活化后的菌液濃度統(tǒng)一至OD600=1.0，用移液槍各吸取1.5 mL菌液于EP管中，4 ℃，5 000 rpm離心10 min，取1 mL上清液于血清瓶，再加入1 mL PBS(pH 7.2)和0.05 g天藍(lán)皮粉(HPA)，搖勻后于37 ℃搖床200 rpm培養(yǎng)2 h，離心后對(duì)上清液進(jìn)行600 nm處吸光度的測(cè)定.同時(shí)采用含1%(w/v)脫脂奶粉的LBS平板定性測(cè)定胞外蛋白酶活性，將活化后的菌液濃度統(tǒng)一至OD600=1.0，分別吸取2μL菌液滴加到1%(w/v)脫脂奶粉的LBS平板上，待菌液晾干后，倒置于30 ℃培養(yǎng)24 h，拍照觀察透明圈大小.

1.3.8 對(duì)不同抗生素抗性實(shí)驗(yàn)

將過(guò)夜培養(yǎng)的WT和突變株ΔbaeS菌液濃度調(diào)整為OD600=1.0，用新鮮的LBS培養(yǎng)基對(duì)菌液梯度稀釋(1、10-1、10-2、10-3、10-4)，分別吸取2μL菌液平行3次滴定到各含有25μg/mL四種抗生素(氯霉素、鏈霉素、克林霉素和卡那霉素)的LBS固體培養(yǎng)基上，待菌液晾干后，于30 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)并拍照.

1.3.9 環(huán)境應(yīng)激能力實(shí)驗(yàn)

檢測(cè)溶藻弧菌WT和突變株ΔbaeS在不同環(huán)境下的生存能力，即在LBS固體培養(yǎng)基中添加不同物質(zhì)形成不同的環(huán)境壓力，包括不同NaCl含量：3%、5%、10% NaCl(v/v)；不同SDS含量：0.5%、1%、3%(w/v)；不同吐溫80含量：0.5%、1%、3%(w/v).步驟如下：將過(guò)夜培養(yǎng)的WT和突變株ΔbaeS菌液濃度調(diào)整為OD600=1.0，用新鮮的LBS培養(yǎng)基對(duì)菌液梯度稀釋(1、10-1、10-2、10-3、10-4)，分別吸取2μL菌液平行3次滴定到LBS固體培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)情況，同時(shí)進(jìn)行拍照.

1.3.10 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行；使用Origin9.1軟件作圖，顯著性水平為5%.

2 結(jié)果與討論

2.1 baeS序列分析

TCS通常由兩個(gè)元件組成，即感知外界信號(hào)的受體蛋白(組氨酸激酶)和將信號(hào)轉(zhuǎn)化為不同生理生化過(guò)程的響應(yīng)蛋白，通常這兩個(gè)蛋白由相鄰近的基因編碼.圖1(a)為baeS基因(orf04422)在溶藻弧菌EPGS基因組中的位置，共由1 371 bp堿基組成.位于其上游的orf04421基因(666 bp)編碼響應(yīng)調(diào)控元件，即TCS中的RR；其上游的orf04420基因(711 bp)編碼甘油磷酸二酯酶；位于baeS基因下游的orf04423基因(2 097 bp)則編碼TonB依賴型的鐵載體受體蛋白.可見，在溶藻弧菌中作為受體蛋白的BaeS及其響應(yīng)元件是由兩個(gè)相鄰的基因編碼的.

不同的組氨酸激酶所含有的結(jié)構(gòu)域差異較大，但是通常都含有以下三個(gè)結(jié)構(gòu)域，即感應(yīng)區(qū)域(HK_Sensor)，二聚化和組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(dimerization and histitine phosphotrasfer domain,DHp)，以及ATP結(jié)合和催化結(jié)構(gòu)域(catalysis and ATP-binding domain,CA).此外，還含有如HAMP(在histidine kinases,adenylyl cyclases,methyl-accepting proteins,phosphatases中存在的結(jié)構(gòu)域),PAS,GAF等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域[23].

利用Interpro在線分析了溶藻弧菌BaeS蛋白的結(jié)構(gòu)域組成和細(xì)胞定位，結(jié)果如圖1(b)和(c)所示.溶藻弧菌BaeS除了含有HK_Sensor，DHp和CA三個(gè)基本結(jié)構(gòu)域外，還含有HAMP結(jié)構(gòu)域.其中，244位為保守的組氨酸位點(diǎn)(H)，在激酶狀態(tài)下HK將ATP中的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至該組氨酸位點(diǎn)，之后再轉(zhuǎn)移至RR中的天冬氨酸位點(diǎn)，從而改變RR的轉(zhuǎn)錄，酶解或調(diào)控活性.通過(guò)對(duì)其結(jié)構(gòu)域細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，HK_sensor區(qū)域主要位于細(xì)胞周質(zhì)空間，其兩側(cè)為兩個(gè)跨膜區(qū)，HAMP、DHp以及CA區(qū)則位于細(xì)胞質(zhì)中.此外，對(duì)不同細(xì)菌中BaeS氨基酸序列進(jìn)行了比對(duì)分析，結(jié)果如圖1(d)所示，BaeS在三個(gè)弧菌中保守性較高，溶藻弧菌(WP_005374264.1)與副溶血弧菌(WP_005459362.1)和哈氏弧菌(KIP66134.1)BaeS氨基酸序列的同源度分別達(dá)到82.45%和78.56%；與大腸桿菌(CAD6009838.1)和福氏志賀氏菌(AIL41268.1)BaeS氨基酸序列同源度分別為27.80%和28.16%，其中DHp結(jié)構(gòu)域氨基酸組成較為保守，如組氨酸位點(diǎn).

(a)baeS基因在溶藻弧菌EPGS基因組中的位置

(b)BaeS蛋白結(jié)構(gòu)域分析

CM：細(xì)胞質(zhì)區(qū)；TM：跨膜區(qū)；NCM：周質(zhì)區(qū)(c)BaeS細(xì)胞定位分析

(d)BaeS氨基酸組成比對(duì)分析圖1 BaeS基因組定位以及生物信息學(xué)分析

2.2 ΔbaeS缺失株的篩選鑒定

通過(guò)Overlap PCR獲得缺失第4-279位堿基的片段，與自殺質(zhì)粒pDM4進(jìn)行重組后接合至溶藻弧菌野生型菌株中，對(duì)兩次同源重組后的菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以野生型菌株作為對(duì)照，結(jié)果如圖2所示.由圖可知，2號(hào)泳道的ΔbaeS突變株較1號(hào)泳道的野生株片段少約270 bp.為進(jìn)一步確定敲除片段是否正確，對(duì)ΔbaeS缺失株進(jìn)行基因組提取，并利用引物進(jìn)行基因測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ΔbaeS突變株第4-279位堿基缺失，表明ΔbaeS突變株成功構(gòu)建.

2.3 BaeS對(duì)溶藻弧菌生長(zhǎng)的影響

通過(guò)測(cè)定溶藻弧菌野生株WT和突變株ΔbaeS在LBS培養(yǎng)基中的吸光度，研究BaeS對(duì)溶藻弧菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖3所示.由圖可知，溶藻弧菌在LBS豐富培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速，經(jīng)過(guò)1 h的短暫適應(yīng)期后便進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，11 h后逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期.相比于溶藻弧菌野生株，ΔbaeS突變株雖然也能快速適應(yīng)LBS培養(yǎng)基，但在對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期其生長(zhǎng)受到明顯限制，菌體生長(zhǎng)速度放緩，培養(yǎng)至12 h后菌液的吸光度僅為0.7左右，而野生株可達(dá)1.0左右.可見，BaeS對(duì)于溶藻弧菌在LBS豐富培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)具有一定的正調(diào)控作用.

圖3 溶藻弧菌野生株WT和ΔbaeS突變株在LBS中的生長(zhǎng)情況

2.4 BaeS對(duì)溶藻弧菌運(yùn)動(dòng)性的影響

溶藻弧菌野生株WT和突變株ΔbaeS運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)結(jié)果如圖4所示.野生株具有較強(qiáng)的游動(dòng)和爬動(dòng)能力，培養(yǎng)一定時(shí)間后可在平板上形成一定運(yùn)動(dòng)距離的菌落；而ΔbaeS在軟平板和硬平板上的運(yùn)動(dòng)能力均明顯降低，基本喪失了爬動(dòng)能力.即BaeS對(duì)溶藻弧菌的游動(dòng)和爬動(dòng)能力均具有一定的促進(jìn)作用.

圖4 WT和ΔbaeS突變株運(yùn)動(dòng)性測(cè)定

2.5 BaeS對(duì)溶藻弧菌生物被膜形成的作用

首先通過(guò)結(jié)晶紫染色法觀察生物被膜的產(chǎn)生情況，如圖5(a)所示.溶藻弧菌野生株可在試管壁上形成大量的生物被膜，突變株ΔbaeS生物被膜形成量明顯較野生株減少；之后用冰乙酸對(duì)生物被膜進(jìn)行充分溶解，在570 nm處測(cè)定吸光值，結(jié)果如圖5(b)所示，突變株ΔbaeS生物被膜形成量較野生株減少.可見，BaeS參與溶藻弧菌生物被膜形成的調(diào)控過(guò)程.

(a)結(jié)晶紫染色法測(cè)定生物被膜

(b)核酸定量?jī)x測(cè)定OD570處吸光值圖5 WT和ΔbaeS突變株生物被膜的形成

2.6 BaeS對(duì)溶藻弧菌胞外蛋白酶活性的調(diào)控作用

堿性絲氨酸蛋白酶Asp是溶藻弧菌主要的毒力因子.通過(guò)HPA定量測(cè)定了野生株WT和突變株ΔbaeS胞外蛋白酶的活性，結(jié)果如圖6(a)所示.野生株能夠產(chǎn)生大量的Asp，而basS基因缺失后，溶藻弧菌所分泌的Asp較野生株顯著降低(p≤0.05).此外，利用脫脂牛奶平板定性分析了酪蛋白酶產(chǎn)量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變株ΔbaeS菌落直徑雖變小，但是其仍可形成與野生株基本相同的透明圈，如圖6(b)所示.可見，BaeS促進(jìn)溶藻弧菌Asp的表達(dá)，而對(duì)于酪蛋白酶的合成影響不大.

(a)堿性絲氨酸蛋白酶活性測(cè)定

(b)酪蛋白酶活性測(cè)定圖6 不同菌株胞外蛋白酶活性測(cè)定

2.7 BaeS對(duì)溶藻弧菌不同抗生素抗性的影響

選取四種抗生素氯霉素，鏈霉素，克林霉素和卡那霉素測(cè)試溶藻弧菌野生株WT和ΔbaeS突變株對(duì)抗生素的敏感性，結(jié)果如圖7所示.野生株和ΔbaeS突變株對(duì)氯霉素均具有高度的敏感性，在含有25μg/mL氯霉素平板上培養(yǎng)后，均未見任何生長(zhǎng).相比野生株而言，ΔbaeS突變株對(duì)其他三種抗生素(鏈霉素，克林霉素和卡那霉素)也表現(xiàn)出不同程度的敏感性；其中對(duì)克林霉素最敏感(圖7).由此可見，BaeS參與了溶藻弧菌耐受克林霉素的作用過(guò)程.TCS廣泛參與細(xì)菌抗生素耐受性的調(diào)控，可通過(guò)細(xì)胞表面修飾，減少藥物流入或增加藥物流出，上調(diào)抗生素降解酶的表達(dá)，或者通過(guò)形成生物被膜等其他耐藥形態(tài)來(lái)提高細(xì)菌對(duì)抗生素的耐受性[24].在大腸桿菌中，BaeSR通過(guò)上調(diào)MDR藥物外排泵實(shí)現(xiàn)對(duì)新生霉素的耐藥性[25].副溶血弧菌VbrKR則通過(guò)激活β-內(nèi)酰胺酶基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐受性[26].溶藻弧菌BaeSR對(duì)克林霉素的耐受性的調(diào)控機(jī)制則需進(jìn)一步深入研究.

圖7 溶藻弧菌對(duì)不同抗生素耐受性的分析

2.8 BaeS對(duì)溶藻弧菌不同環(huán)境應(yīng)激能力的影響

TCS在細(xì)菌中普遍存在，對(duì)維持體內(nèi)平衡至關(guān)重要，使細(xì)菌能夠感知環(huán)境的變化并做出相應(yīng)的反應(yīng).首先檢測(cè)了野生株WT和ΔbaeS突變株在不同鹽濃度下的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖8(a)所示.WT在0.5%、1.0%和3.0%(w/v)NaCl的平板上生長(zhǎng)良好，但隨著鹽濃度的降低，在相同稀釋度下的生長(zhǎng)有所降低.ΔbaeS突變株在3個(gè)不同鹽度下均能生長(zhǎng)，但隨著鹽度的降低其菌落生長(zhǎng)有所減弱；在相同鹽度下，ΔbaeS突變株的菌落生長(zhǎng)較野生型有所減弱，在稀釋度為10-4時(shí)，在1.0%和3.0%(w/v)NaCl的平板上ΔbaeS突變株所形成的菌落較WT略顯稀疏，而在0.5%(w/v)NaCl平板上WT仍可生長(zhǎng)，而ΔbaeS突變株已無(wú)肉眼可見的菌落形成，這可能是由于BaeS對(duì)溶藻弧菌生長(zhǎng)影響所引起的.可見，溶藻弧菌作為一種嗜鹽菌，其生長(zhǎng)隨著鹽度的降低而受到一定限制，而BaeS對(duì)溶藻弧菌在低鹽條件下的適應(yīng)并無(wú)明顯的調(diào)控作用.

之后考察了不同濃度吐溫對(duì)溶藻弧菌野生株WT和ΔbaeS突變株生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖8(b)所示.由圖可以看到，WT在添加了吐溫的平板上可以生長(zhǎng)，隨著吐溫濃度的增加，生長(zhǎng)受到一定的抑制，在添加3%吐溫平板上WT所形成的菌落較低濃度下更為疏松.而ΔbaeS突變株的生長(zhǎng)也隨著吐溫濃度的增加而有所減弱，但相較于相同水平下的WT而言，ΔbaeS突變株對(duì)吐溫具有較強(qiáng)的耐受性，在相同培養(yǎng)條件下所形成的菌落直徑明顯增大.可見，BaeS在溶藻弧菌響應(yīng)外界吐溫壓力的過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用.

在添加了不同濃度SDS平板上，WT均能較好地生長(zhǎng)，且SDS濃度的增加對(duì)其生長(zhǎng)的影響不顯著.而ΔbaeS突變株在0.5%SDS平板上生長(zhǎng)與WT基本一致，但在1%和3%SDS平板上其生長(zhǎng)受到明顯的抑制，尤其在3%SDS平板上，ΔbaeS突變株僅在未稀釋時(shí)形成菌落，稀釋10倍后便未有肉眼可見的菌落形成，見圖8(c)所示.可見，BaeS在溶藻弧菌響應(yīng)SDS的生理過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色.在金黃色葡萄球菌Newman中，SDS可以直接作用于SaeSR雙組份系統(tǒng)中組氨酸激酶SaeS，影響其激酶/磷酸酶活性，改變下游基因的表達(dá)，從而降低金黃色葡萄球菌對(duì)SDS的耐受[27].下一步可以深入研究SDS是否也能直接作用于BaeS影響其激酶/磷酸酶活性，從而調(diào)控溶藻弧菌在SDS壓力下的響應(yīng)活性.

(a)不同鹽濃度對(duì)WT和ΔbaeS突變株生長(zhǎng)的影響

(b)不同濃度吐溫對(duì)WT和ΔbaeS突變株生長(zhǎng)的影響

(c)不同濃度SDS對(duì)WT和ΔbaeS突變株生長(zhǎng)的影響圖8 WT和ΔbaeS突變株在不同環(huán)境壓力下的生長(zhǎng)情況

3 結(jié)論

(1)成功構(gòu)建了無(wú)標(biāo)記基因缺失突變株ΔbaeS.BaeS含有HK_Sensor，HAMP，DHp和CA四個(gè)結(jié)構(gòu)域，244位為進(jìn)行磷酸化的組氨酸位點(diǎn)，此外，還含有兩個(gè)TM結(jié)構(gòu)域.溶藻弧菌BaeS氨基酸組成與副溶血弧菌和哈氏弧菌具有較高的相似度.

(2)BaeS對(duì)溶藻弧菌的生長(zhǎng)和不同毒力因子，包括運(yùn)動(dòng)性、堿性絲氨酸蛋白酶、生物被膜等具有正向調(diào)控作用.

(3)BaeS對(duì)溶藻弧菌克林霉素耐受性以及對(duì)吐溫、SDS等環(huán)境變化的應(yīng)激能力具有重要的調(diào)控作用.