羅 濤，王計平，高慧玲，崔紅利，李潤植

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷 030801)

亞麻薺屬于十字花科亞麻薺屬一年生草本植物，被認(rèn)為是保健食用油和生物柴油的優(yōu)質(zhì)原料[1]。與其他油料作物相比，亞麻薺在生長周期(約90 d)以及抗逆方面具有明顯優(yōu)勢[2]。更為重要的是，亞麻薺作為一種古老而又富含研究價值的環(huán)境友好型油料作物，其種子含油量較高(種子干重的36%～47%)，而且富含多不飽和脂肪酸(PUFA)，其中亞油酸(C18:2)約占總含油量的19%，亞麻酸(C18:3)約占32%[3]。植物油脂合成途徑主要包括在質(zhì)體中的從頭合成以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的加工和組裝過程[4-5]，轉(zhuǎn)錄因子可以通過結(jié)合順式作用元件調(diào)控下游基因表達(dá)，從而調(diào)控物質(zhì)合成與代謝過程。

近年來，轉(zhuǎn)錄因子的功能研究越來越多，包括在非生物脅迫[6]、代謝物質(zhì)積累[7-9]及生長發(fā)育[10]等方面。LAFL基因(包括LEC1、LEC2、ABI3和FUS3)調(diào)控種子發(fā)育的不同階段，包括胚胎發(fā)生和貯藏物質(zhì)的積累[11-12]。FUS3是可以調(diào)控油脂合成基因的植物特異性轉(zhuǎn)錄因子之一，它包含一個B3結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能特異性結(jié)合RY元件[13]，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)LEC1可以增加擬南芥幼苗的油脂積累，而在FUS3突變體中，LEC1的表達(dá)并沒有導(dǎo)致油脂含量的明顯增加，這說明LEC1的功能部分依賴于FUS3[14]；對擬南芥FUS3突變體的研究還發(fā)現(xiàn)，擬南芥FUS3突變體中總脂肪酸含量為野生型含量的31%，與ABI3(62%)和LEC2(79%)突變體相比變化更顯著，由此說明FUS3在擬南芥油脂積累方面發(fā)揮重要調(diào)控作用[15]。Elahi等[16]在油菜FUS3突變體中同樣發(fā)現(xiàn)FUS3能調(diào)控油脂的積累；Zhang等[17]過表達(dá)FUS3后，激活了煙草BY2細(xì)胞和擬南芥幼苗中的TAG生物合成，當(dāng)FUS3和DGAT1共表達(dá)時，又進(jìn)一步增加了煙草BY2細(xì)胞的油脂積累。另外，在擬南芥FUS3突變體中，油酸(C18:1)的去飽和效率較野生型明顯降低，并且FUS3在一定程度上也調(diào)控超長鏈脂肪酸的積累[15]。這些研究結(jié)果均表明FUS3在調(diào)控油脂合成與積累過程中發(fā)揮重要作用。

本研究利用生物信息學(xué)方法及RT-PCR技術(shù)分析鑒定了亞麻薺CsFUS3-1和CsFUS3-2基因，并預(yù)測其互作蛋白及下游表達(dá)基因，利用實時熒光定量PCR檢測CsFUS3基因的時空表達(dá)模式，并通過異源表達(dá)鑒定CsFUS3基因的功能。該研究為深入解析亞麻薺高油含量的分子機(jī)制提供新知識，同時，為進(jìn)一步篩選和培育優(yōu)良油料作物新品種提供新的基因元件和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料亞麻薺(SC-N1)種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田。試驗所用的組織材料(根、莖、葉)取自亞麻薺8～10片真葉的幼苗，花取自亞麻薺盛花期，于亞麻薺花后10、20、30、40 d采集種子。各試驗材料采集后液氮速凍，存放于-80 ℃超低溫冰箱。

煙草種子、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞(GV3101)均由分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所提供。pCAMBIA3300載體購買自淼靈質(zhì)粒平臺。

1.2 方 法

1.2.1 CsFUS3家族的鑒定及生物信息學(xué)分析利用AtFUS3蛋白序列作為種子序列，在亞麻薺基因組庫中進(jìn)行Blastp篩選，初步篩選出2條亞麻薺CsFUS3蛋白序列，分別命名為CsFUS3-1和CsFUS3-2。利用CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、PFAM(https://pfam.xfam.org/)、SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)對兩條候選序列進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析。

利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)在線數(shù)據(jù)庫分析CsFUS3蛋白序列的基本理化性質(zhì)；利用在線工具對CsFUS3蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位(https://psort.hgc.jp/form2.html)、信號肽(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)和跨膜區(qū)(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)預(yù)測分析；分別利用在線網(wǎng)站SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)對CsFUS3蛋白序列進(jìn)行二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；運用在線網(wǎng)站GSDS2.0(http://gsds.gao-lab.org/)分析CsFUS3的基因結(jié)構(gòu)。

利用DNAMAN對AtFUS3和CsFUS3進(jìn)行多序列比對分析；運用MEGA7.0對亞麻薺CsFUS3以及其他物種的FUS3蛋白序列(表1)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，方法為鄰接法(Neighbor-joining method)；利用在線工具M(jìn)EME(http://meme-suite.org/tools/meme)對CsFUS3蛋白家族進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)預(yù)測分析；利用TBtools提取亞麻薺CsFUS3基因上游2 000 bp的啟動子區(qū)序列，利用Plant CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對其進(jìn)行順式作用元件預(yù)測分析。

表1 各物種FUS3蛋白序列信息

1.2.2 CsFUS3互作蛋白預(yù)測為了獲得亞麻薺CsFUS3蛋白與其他蛋白之間的互作關(guān)系，通過在線網(wǎng)站STRING(https://cn.string-db.org/)進(jìn)行互作蛋白預(yù)測，最小相互作用分值設(shè)置為0.7。

1.2.3CsFUS3下游基因預(yù)測為研究CsFUS3參與亞麻薺油脂合成的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步分析了油脂合成相關(guān)基因的上游啟動子序列。根據(jù)CsFUS3特異性結(jié)合RY元件特性[13]，篩選CsFUS3可能調(diào)控的下游基因；再從亞麻薺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[18]中提取這些下游基因在不同發(fā)育時期種子中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)數(shù)據(jù)(FPKM)進(jìn)行相關(guān)性分析，并繪制折線圖，分析CsFUS3基因與下游基因的共表達(dá)模式。

1.2.4CsFUS3基因的表達(dá)模式分析利用試劑盒(9109, TaKaRa)提取亞麻薺不同組織(根、莖、葉、花及不同發(fā)育時期的種子)的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A, TaKaRa)將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用Primer 6.0軟件設(shè)計CsFUS3基因特異性引物，以亞麻薺CsActin作為內(nèi)參基因(表2)，對CsFUS3基因進(jìn)行RT-PCR分析；用試劑盒(RR820A, TaKaRa)進(jìn)行qRT-PCR檢測，每個樣品設(shè)置3次重復(fù)。采用2-△△Ct計算基因的相對表達(dá)量，用SPSS 25.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

表2 引物信息

1.2.5 煙草瞬時表達(dá)表達(dá)載體pCAMBIA3300-CsFUS3-1和pCAMBIA3300-CsFUS3-2由蘇州金唯智生物科技有限公司構(gòu)建。利用試劑盒(9760，TaKaRa)提取質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌，用引物F(TGTAAAACGACGGCCAGT)和R(CAGGAAACAGCTATGACC)檢測后，配制煙草侵染液，用注射器侵染煙草葉片。取侵染3 d后的葉片提取RNA，檢測目的基因是否有效表達(dá)，所用CsFUS3基因引物見表2，煙草內(nèi)參基因NtActin引物為F(CAGTGGCCGTACAACAGGTA)和R(AACCGAAGAATTGCATGAGG)。取侵染5 d后的葉片冷凍干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 總油脂的提取和測定采用氯仿-甲醇法提取煙草葉片的總油脂。稱取50 mg粉末，加7.5 mL甲醇:氯仿(2∶1)，置于37 ℃搖床振蕩反應(yīng)24 h，離心收集上層有機(jī)相。沉淀再用7.5 mL甲醇∶氯仿(2∶1)抽提2 h，收集上層有機(jī)相。將收集的上層有機(jī)相合并，加入5 mL氯仿和9 mL 1% NaCl溶液，使體系中甲醇∶氯仿∶1% NaCl溶液體積比為2∶2∶1.8，混勻后離心。吸取下層清液于稱重后的玻璃管(W1)中，氮吹儀吹干后，置于真空干燥箱中4 h，稱重(W2)?？傆椭?(W2-W1)/0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻薺CsFUS3蛋白的理化性質(zhì)分析

利用AtFUS3蛋白序列進(jìn)行本地Blast，鑒定出2條亞麻薺CsFUS3蛋白序列，均與擬南芥AtFUS3屬于B3蛋白家族，分別命名為CsFUS3-1和CsFUS3-2，蛋白長度分別為310和311個氨基酸，分子量分別為34.98和35.03 kD，理論等電點分別為5.65和5.55，均為酸性蛋白。CsFUS3-1和CsFUS3-2蛋白不穩(wěn)定指數(shù)各為45.43和45.57，均屬于不穩(wěn)定蛋白。2個CsFUS3蛋白均無跨膜區(qū)和信號肽，不屬于分泌蛋白。通過亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，2個CsFUS3蛋白與擬南芥AtFUS3均位于細(xì)胞核。經(jīng)比較CsFUS3和AtFUS3蛋白的理化性質(zhì)基本一致(表3)。

表3 亞麻薺CsFUS3基因及編碼蛋白的基本信息

2.2 CsFUS3基因及編碼蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

基因結(jié)構(gòu)(圖1)比較發(fā)現(xiàn)，CsFUS3和AtFUS3基因的結(jié)構(gòu)相似，3個基因均含有6個外顯子，其中CsFUS3-1和AtFUS3包含5個內(nèi)含子，而CsFUS3-2除了編碼區(qū)含有5個內(nèi)含子外，5′端非編碼區(qū)還存在1個內(nèi)含子。

圖1 亞麻薺CsFUS3與擬南芥AtFUS3基因結(jié)構(gòu)比較Fig.1 Gene structure of CsFUS3 from C. sativa and AtFUS3 from Arabidopsis thaliana

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖2)發(fā)現(xiàn)，亞麻薺CsFUS3-1蛋白的二級結(jié)構(gòu)包括無規(guī)則卷曲47.42%、α-螺旋29.35%、延伸鏈17.1%和β-轉(zhuǎn)角6.13%；CsFUS3-2蛋白的二級結(jié)構(gòu)包括無規(guī)則卷曲45.98%、α-螺旋26.37%、延伸鏈18.65%和β-轉(zhuǎn)角9%。2個CsFUS3蛋白與擬南芥AtFUS3的二級結(jié)構(gòu)組成(無規(guī)則卷曲46.96%、α-螺旋27.48%、延伸鏈19.17%、β-轉(zhuǎn)角6.39%)類似，其中無規(guī)則卷曲的占比最高，其次是α-螺旋和延伸鏈，而β-轉(zhuǎn)角占比最小。3個FUS3蛋白的二級結(jié)構(gòu)相似，只是在各組成結(jié)構(gòu)占比上存在一定差異。

圖2 亞麻薺CsFUS3與擬南芥AtFUS3蛋白的二級結(jié)構(gòu)比較Fig.2 Secondary structure of CsFUS3 proteins from C. sativa and AtFUS3 protein from A. thaliana

對CsFUS3與擬南芥AtFUS3蛋白進(jìn)行同源建模比較(比對模板編號：5z00.1.C)，結(jié)果見圖3，CsFUS3-1和CsFUS3-2的序列相似度分別為0.4和0.41，覆蓋度均為0.35，都是以同源四聚體形式發(fā)揮作用。與AtFUS3蛋白一樣，構(gòu)成CsFUS3蛋白的多肽鏈不存在配體。

圖3 亞麻薺CsFUS3與擬南芥AtFUS3蛋白的三級結(jié)構(gòu)比較Fig.3 Tertiary structure of CsFUS3 proteins from C. sativa and AtFUS3 protein from A. thaliana

2.3 CsFUS3蛋白的多序列比對、系統(tǒng)進(jìn)化及保守基序分析

與AtFUS3蛋白進(jìn)行序列比對(圖4)發(fā)現(xiàn)，2個CsFUS3與AtFUS3蛋白序列相似性極高，均包含一個高度保守的B3結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖5，A)發(fā)現(xiàn)，各物種的FUS3蛋白大致分為三類，CsFUS3蛋白與擬南芥、白菜型油菜、蓖麻和麻風(fēng)樹FUS3聚類于同一分支，且CsFUS3與擬南芥AtFUS3的親緣關(guān)系最近，可能具有相同的進(jìn)化來源。

圖4 亞麻薺CsFUS3與擬南芥AtFUS3蛋白序列比對Fig.4 Multiple sequence alignment of CsFUS3 proteins of C. sativa and AtFUS3 protein from A. thaliana

在MEME網(wǎng)站進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域(圖5，B)預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)亞麻薺CsFUS3與同屬于十字花科的擬南芥和白菜型油菜FUS3具有相同的保守域且分布一致。與其他物種的FUS3蛋白相比，十字花科植物的FUS3中包含獨有的motif 8，該motif可能是十字花科物種FUS3蛋白在進(jìn)化上的關(guān)鍵氨基酸殘基位點。

AtFUS3. 擬南芥；BrFUS3a、BrFUS3b. 白菜型油菜；RcFUS3. 蓖麻；JcFUS3. 麻風(fēng)樹；AhFUS3. 花生；GmFUS3a、GmFUS3b. 大豆；GsFUS3. 野大豆；HvFUS3. 大麥圖5 各物種FUS3蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹和保守基序分析AtFUS3. Arabidopsis thaliana；BrFUS3a, BrFUS3b. Brassica rapa；RcFUS3.Ricinus communis；JcFUS3. Jatropha curcas；AhFUS3. Arachis hypogaea；GmFUS3a, GmFUS3b. Glycine max；GsFUS3. Glycine soja；HvFUS3. Hordeum vulgareFig.5 Phylogenetic tree and conserved motif analysis of FUS3 proteins from various species

2.4 CsFUS3啟動子元件分析

提取CsFUS3基因上游2 000 bp序列進(jìn)行啟動子元件分析，結(jié)果見表4，兩個CsFUS3基因包含相同的功能元件，分別是啟動子基本元件CAAT-box和TATA-box、參與胚乳特異性負(fù)表達(dá)元件、參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件、厭氧誘導(dǎo)所必需的順式調(diào)節(jié)元件、光響應(yīng)元件、與光反應(yīng)有關(guān)的MYB結(jié)合位點和α-淀粉酶啟動子保守序列。

表4 亞麻薺CsFUS3基因上游啟動子順式作用元件

2.5 CsFUS3與油脂合成相關(guān)蛋白的互作分析

利用STRING在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行互作蛋白預(yù)測發(fā)現(xiàn)(圖6)，CsFUS3與WRI1、AGL15、ABI5和BBM蛋白之間存在互作關(guān)系。WRI1在脂肪酸合成途徑中發(fā)揮重要作用[19]，而另外3個蛋白主要與植物的生長發(fā)育調(diào)控相關(guān)[20-23]。

圖6 亞麻薺CsFUS3與相關(guān)蛋白間的相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Interaction network between CsFUS3 and related proteins in C. sativa

2.6 CsFUS3的組織表達(dá)特異性

為了探究CsFUS3基因在亞麻薺各組織中的功能，分別檢測了2個CsFUS3基因在亞麻薺的根、莖、葉、花以及不同發(fā)育時期的種子中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)CsFUS3基因僅在種子中表達(dá)(圖7)，并且隨著種子的發(fā)育成熟，CsFUS3-1和CsFUS3-2基因表達(dá)量均呈現(xiàn)先增高后降低的變化趨勢，在花后30 d基因表達(dá)量達(dá)到最高，隨后逐漸降低。

不同小寫字母表示在P< 0.05水平上差異顯著圖7 亞麻薺CsFUS3基因表達(dá)分析Different normal letters indicate significantly different at P < 0.05Fig.7 Expression analysis of CsFUS3 genes of C. sativa

2.7 CsFUS3下游靶基因預(yù)測

根據(jù)CsFUS3特異性結(jié)合RY元件的特性，對油脂合成相關(guān)基因的上游啟動子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)6個可能的靶基因(表5)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，這些基因在種子中特異性表達(dá)。根據(jù)OLE1、OLE2、OLE3、ABI3-1、ABI3-2和ABI3-3基因在不同發(fā)育時期的種子中的FPKM值，預(yù)測其與CsFUS3基因的共表達(dá)模式，結(jié)果如圖8所示，4個基因(OLE1、OLE2、OLE3和ABI3-3)與CsFUS3基因的表達(dá)量變化趨勢顯著相關(guān)(P<0.01)，在花后30 d時表達(dá)量均達(dá)到最高。因此，推測在亞麻薺種子發(fā)育時期CsFUS3直接調(diào)控OLE1、OLE2、OLE3和ABI3-3基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

表5 預(yù)測基因在亞麻薺數(shù)據(jù)庫中的編號

圖8 預(yù)測基因在亞麻薺不同發(fā)育時期種子中的FPKM變化趨勢Fig.8 FPKM variation trend of predicted genes at different seed developmental stages of C. sativa

2.8 過表達(dá)CsFUS3促進(jìn)煙葉總油脂含量積累

為解析CsFUS3是否具有調(diào)控油脂合成的功能，分別構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA3300-CsFUS3-1和pCAMBIA3300-CsFUS3-2(圖9，A)，通過雙酶切驗證(圖9，B、C)載體正確后，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，得到陽性單克隆(圖9，D、E)。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草葉片瞬時表達(dá)CsFUS3基因，侵染3 d后，提取葉片RNA，RT-PCR檢測顯示，CsFUS3-1和CsFUS3-2基因在煙草葉片中有效表達(dá)(圖10)。

A. 植物重組表達(dá)載體示意圖； B～C. 載體雙酶切驗證：M. DL2000；1. pCAMBIA3300-CsFUS3-1(B)和pCAMBIA3300-CsFUS3-2(C)；2. 雙酶切；D～E. 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化：M. DL5000；1. 農(nóng)桿菌陽性單克隆，pCAMBIA3300-CsFUS3-1(D)和pCAMBIA3300-CsFUS3-2(E)圖9 植物重組表達(dá)載體構(gòu)建及驗證A. Schematic diagram of plant recombinant expression vector；B-C. Double restriction enzyme digestion verification of vector: M. DL2000；1. pCAMBIA3300-CsFUS3-1(B) and pCAMBIA3300-CsFUS3-2(C)；2. Double digested； D-E. Detection of Agrobacterium transformants： M. DL5000；1. The positive Agrobacterium clones，pCAMBIA3300-CsFUS3-1(D) and pCAMBIA3300-CsFUS3-2(E)Fig.9 Construction and verification of plant recombinant expression vector

M. DL1000；A. 煙草內(nèi)參基因RT-PCR檢測： 1、2. CsFUS3-1轉(zhuǎn)基因葉片；3、4. CsFUS3-2轉(zhuǎn)基因葉片；B. CsFUS3-1基因RT-PCR檢測；C. CsFUS3-2基因RT-PCR檢測圖10 煙草葉片瞬時表達(dá)RT-PCR檢測M. DL1000；A. RT-PCR detection of tobacco reference genes：1,2. CsFUS3-1 transgenic leaves；3,4. CsFUS3-2 transgenic leaves；B. RT-PCR detection of CsFUS3-1；C. RT-PCR detection of CsFUS3-2Fig.10 RT-PCR detection of transient expression in tobacco leaves

選取野生型及轉(zhuǎn)CsFUS3-1和CsFUS3-2基因的煙草葉片進(jìn)行總油脂含量測定。結(jié)果顯示(圖11)，與野生型相比，轉(zhuǎn)CsFUS3-1和CsFUS3-2基因的葉片總油脂含量分別提高了0.95%和1.12%，但差異不顯著。

不同小寫字母表示在P< 0.05水平上差異顯著圖11 過表達(dá)CsFUS3基因的煙葉總油脂含量Different normal letters indicate significantly different at P < 0.05Fig.11 Total oil content in tobacco leaves overexpressing CsFUS3 genes

3 討 論

3.1 CsFUS3基因序列結(jié)構(gòu)特征及高度保守性

FUS3是一類植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，僅存在于種子植物中[24-25]，并在種子成熟過程中發(fā)揮作用[26]。目前對該基因的研究主要在擬南芥[27-29]、油菜[16,30]和花生[31]等植物中，而亞麻薺FUS3基因的研究鮮有報道。本研究利用AtFUS3蛋白序列，在亞麻薺基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定出2條完整的CsFUS3蛋白序列，這兩條序列均包含一個B3結(jié)構(gòu)域，屬于B3家族蛋白[32]。系統(tǒng)發(fā)育顯示CsFUS3與同屬十字花科的擬南芥和白菜型油菜AtFUS3蛋白親緣關(guān)系最近，并且這些蛋白包含的保守基序高度一致，說明FUS3蛋白的進(jìn)化高度保守。

亞麻薺CsFUS3基因啟動子區(qū)涉及到參與胚乳特異性調(diào)控、防御和應(yīng)激反應(yīng)、厭氧誘導(dǎo)和光響應(yīng)元件，以及MYB結(jié)合位點和α-淀粉酶啟動子保守序列。眾多調(diào)控因子參與植物細(xì)胞胚胎發(fā)育，其中包括FUS3[33]，如韋云婷等[30]對甘藍(lán)型油菜分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)US3對胚胎發(fā)育具有重要作用；另有研究表明，與MYB有關(guān)的一些結(jié)合元件大多與植物的干旱反應(yīng)相關(guān)[34]，在甘藍(lán)型油菜中BnaFUS3可以響應(yīng)多種非生物脅迫[35]；推測亞麻薺CsFUS3基因可能響應(yīng)逆境脅迫，并參與植物胚胎發(fā)生過程。

3.2 CsFUS3在亞麻薺種子中特異表達(dá)

本研究發(fā)現(xiàn)，CsFUS3基因在亞麻薺種子中特異性表達(dá)，并在種子的四個發(fā)育時期中表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢，與花生和油用牡丹種子中FUS3基因的表達(dá)模式相同[31,36]。CsFUS3基因在亞麻薺種子發(fā)育中后期的表達(dá)量最高，推測CsFUS3基因在該時期通過調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)來控制種子中油脂的合成與積累。

3.3 CsFUS3基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

在擬南芥中，由LEC1、ABI3、FUS3和LEC2組成的LAFL調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，是激活種子發(fā)育成熟的主調(diào)控因子[15]。FUS3基因直接作用ABI3參與種子儲藏蛋白和油體蛋白的合成[29]。FUS3與質(zhì)體脂肪酸生物合成基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)也表現(xiàn)出一定的誘導(dǎo)關(guān)系[37]。本研究結(jié)果推測，CsFUS3直接調(diào)控ABI3-3和OLE基因表達(dá)促進(jìn)種子TAG積累。

互作蛋白預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，CsFUS3與WRI1蛋白相互作用參與種子油脂合成調(diào)控，F(xiàn)US3與AGL15、BBM、ABI5蛋白之間的互作，可能在植物胚胎發(fā)生、種子發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用[4,29]。

3.4 CsFUS3基因促進(jìn)煙草葉片油脂積累

本研究構(gòu)建植物表達(dá)載體，在煙草葉片中異源表達(dá)CsFUS3-1和CsFUS3-2基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因葉片中總油脂含量比野生型高，但差異不顯著，表明CsFUS3基因可能會促進(jìn)細(xì)胞油脂合成積累，我們將進(jìn)一步轉(zhuǎn)化亞麻薺及擬南芥驗證其功能。