楊麗娟，付 亮，任星旭，朱 坤，蔣志凱

（河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院/河南省強(qiáng)筋小麥繁育工程技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453000）

黑色小麥和紫色小麥籽粒種皮和糊粉層富含花青素而呈現(xiàn)黑、紫色[1]?；ㄇ嗨厥屈S酮類(lèi)水溶性天然色素，對(duì)植物具有防止紫外線(xiàn)輻射、防止病害等多種生理功能。食物中的花青素對(duì)人類(lèi)具有抗氧化、保護(hù)肝臟、抗癌、預(yù)防心腦血管疾病等多種功效[2-3]。黑、紫色小麥中蛋白質(zhì)以及鈣、鐵、鋅、硒等微量元素含量都顯著高于普通小麥[4-5]，是功能型食品和保健型食品的理想原材料。隨著生活水平提高，消費(fèi)者對(duì)糧食的需求正在發(fā)生深刻的變化，從吃得飽向吃得好、吃得健康轉(zhuǎn)變，美味、營(yíng)養(yǎng)、美觀的有色食品受到了市場(chǎng)青睞。黑、紫色小麥具有高鐵、鋅、鉀、鎂、鉀鈉比、氨基酸、纖維和富硒鉻、多色苷等突出特點(diǎn)[6-7]，其推廣應(yīng)用有助于通過(guò)傳統(tǒng)食物有效預(yù)防貧血、糖尿病、心腦血管等病癥[8]，在飲食結(jié)構(gòu)改善和特定人群營(yíng)養(yǎng)狀況改良方面將發(fā)揮重要作用。

彩色小麥?zhǔn)切←溣N的珍貴種質(zhì)資源，通過(guò)雜交育種或雙單倍體育種等現(xiàn)代生物育種技術(shù)對(duì)彩色小麥種質(zhì)資源加以利用，選育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病且適宜產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的彩色小麥品種是一個(gè)大有前景的研究方向。國(guó)內(nèi)黑、紫色小麥品種多采用周黑麥1 號(hào)[9]、漯珍1 號(hào)[10-11]、中普黑麥1 號(hào)[12]等少數(shù)骨干親本選育而成，遺傳背景不夠明確。目前，關(guān)于普通小麥種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的研究較多[13-17]，而關(guān)于彩色小麥種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記普遍存在于生物基因組中，在基因組中分布廣、密度高，遺傳穩(wěn)定，易于檢測(cè)而且分型簡(jiǎn)單[18]。SNP 標(biāo)記在育種中可應(yīng)用于遺傳多樣性檢驗(yàn)和基因分型，可以真實(shí)反映品種間的親緣關(guān)系[19-20]。為了明確黑、紫色小麥種質(zhì)間的遺傳關(guān)系進(jìn)而從中選擇親本材料，采用15K SNP 芯片數(shù)據(jù)分析15 份黑、紫色小麥種質(zhì)資源的遺傳差異，并測(cè)定籽粒中的花青素含量，為黑、紫色小麥雜交育種親本選擇提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黑、紫色小麥品種（系）為特色小麥1（紫色，T1）、特色小麥2（紫色，T2）、特色小麥3（黑色，T3）、特色小麥4（黑色，T4）、特色小麥5（黑色，T5）、漯珍1號(hào)（黑色，LZ1）、紫色小麥（黑色，ZM）、蜀紫麥1801（紫色，SZ）、衛(wèi)輝黑小麥（黑色，WHH）、周黑麥1 號(hào)（黑色，ZH1）、豫州黑麥1 號(hào)（紫色，YZH1）、稷紫黑麥9 號(hào)（黑色，JZH9）、永黑麥1 號(hào)（黑色，YH1）、豫州黑麥2 號(hào)（紫色，YZH2）、同盟黑小麥（黑色，TMH），均由河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。其中，漯珍1 號(hào)和周黑麥1 號(hào)為商業(yè)品種，其他為農(nóng)藝性狀已穩(wěn)定的品系。供試對(duì)照品種為中國(guó)春（CS）和新麥26（XM26），均由河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。試驗(yàn)在河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院輝縣試驗(yàn)基地進(jìn)行，所有材料均于2020年10月15日播種，生育期管理同一般大田管理，2021 年6 月2 日人工收獲麥穗，各材料用單穗脫粒機(jī)脫粒，避免混雜。

1.2 基因組DNA提取與15K芯片分析

2020 年11 月，在田間取新鮮彩色小麥種質(zhì)葉片，液氮速凍后交由中玉金標(biāo)記（北京）生物技術(shù)股份有限公司完成基因組DNA提取和中麥芯1號(hào)15K SNP 芯片分析。中麥芯1 號(hào)是中玉金標(biāo)記（北京）生物技術(shù)股份有限公司運(yùn)用Affymetrix?Axiom 平臺(tái)開(kāi)發(fā)的穩(wěn)定性較高的小麥育種專(zhuān)用芯片，共有13 947個(gè)標(biāo)記，基本均勻覆蓋小麥全基因組，每條染色體上2個(gè)標(biāo)記間的物理距離平均為1 M。對(duì)DQC（數(shù)據(jù)質(zhì)控）＞82%和CR（標(biāo)記檢出率）＞95%的樣品進(jìn)行SNP位點(diǎn)質(zhì)控，獲取9 227個(gè)標(biāo)記，將此批檢測(cè)數(shù)據(jù)與公司種質(zhì)資源庫(kù)數(shù)據(jù)合并，進(jìn)行miss（缺失率）＜10%和maf（最小等位基因頻率）＞5%過(guò)濾，最終獲得7 116 個(gè)可用標(biāo)記，作為有效SNP 位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。將SNP 分型數(shù)據(jù)分別記為1（純合AA）、2（雜合AB）、3（純合BB）和0（缺失），建立原始矩陣。用NTSYS-PC 2.1 軟件計(jì)算材料間遺傳相似度，使用Treebest軟件的NJ-tree模型構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)[21]。

1.3 籽?；ㄇ嗨睾繙y(cè)定

以中國(guó)春和新麥26為對(duì)照，將待測(cè)小麥樣品籽粒用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過(guò)孔徑250 μm 的篩，稱(chēng)取樣品1.00 g 于50 mL 具塞比色管中，加入提取液定容至刻度，搖勻1 min，超聲提取30 min，于沸水浴中水解1 h，取出冷卻，用提取液再次定容，靜置，取上清液，用0.45 μm水相濾膜過(guò)濾，4 ℃保存待測(cè)，有效期3 d。參考NY/T 2640—2014，采用HPLC 法測(cè)定彩色小麥籽粒中飛燕草色素、矢車(chē)菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥素和錦葵色素等6種花青素含量[22]，進(jìn)一步計(jì)算總花青素含量。所用高效液相色譜儀為1260 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）。色譜柱：Zorbax SB-C18 4.6 mm×250 mm×5μm，美國(guó)Agilent 公司）；流動(dòng)相：A 為1%甲酸水溶液，B為1%甲酸乙腈溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)：530 nm；柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 15份黑、紫色小麥種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析

由表1可知，15份黑、紫色小麥種質(zhì)資源的SNP標(biāo)記雜合率均低于3%，純合度較高，且各種質(zhì)資源田間長(zhǎng)勢(shì)整齊。

表1 15份黑、紫色小麥種質(zhì)資源的SNP標(biāo)記雜合率Tab.1 Heterozygosity rates of 15 germplasm resources with black or purple grain based on SNP markers %

本研究共獲得9 227 個(gè)SNP 位點(diǎn)，對(duì)分型結(jié)果進(jìn)行分析后，獲得7 116 個(gè)有效SNP 位點(diǎn)（圖1），多態(tài)性比率為77.12%。每條染色體上的SNP 位點(diǎn)數(shù)為128～682 個(gè)，在A、B、D 基因組上不均勻分布。B基因組中SNP位點(diǎn)最多，有3 216個(gè)，其中，3B染色體上SNP 位點(diǎn)最多，有682 個(gè)。D 基因組中SNP 位點(diǎn)最少，有1 544 個(gè)，其中，4D 染色體上SNP 位點(diǎn)最少，有128個(gè)。

圖1 小麥各染色體上的SNP位點(diǎn)分布Fig.1 Distributions of SNP loci on each chromosome in wheat

由表2 可知，15 份小麥種質(zhì)資源之間的遺傳相似度為44.58%～99.94%。遺傳相似度最高的2 份種質(zhì)資源是特色小麥4與漯珍1號(hào)，為99.94%；其次是特色小麥3與永黑麥1號(hào)（99.43%）、特色小麥1與豫州黑麥1 號(hào)（94.65%）；豫州黑麥1 號(hào)與特色小麥1、豫州黑麥1號(hào)與特色小麥2、特色小麥1與特色小麥2、豫州黑麥2 號(hào)與特色小麥2 之間的遺傳相似度均高于90%。遺傳相似度最低的2份種質(zhì)資源是豫州黑麥1號(hào)與蜀紫麥1801（44.58%）；蜀紫麥1801與多數(shù)種質(zhì)資源間的遺傳相似度低于50%，僅與特色小麥3、永黑麥1 號(hào)分別達(dá)到了50.7%、50.74%；豫州黑麥2 號(hào)與特色小麥3、特色小麥5、紫色小麥、周黑麥1 號(hào)、永黑麥1 號(hào)之間的遺傳相似度以及同盟黑小麥與豫州黑麥2 號(hào)之間的遺傳相似度均低于50%。單份種質(zhì)資源與其他種質(zhì)資源間的遺傳相似度平均值最高的是特色小麥4（71.50%），最低的是蜀紫麥1801（47.60%）。

表2 15份黑、紫色小麥種質(zhì)資源的遺傳相似度Tab.2 Genetic similarities among 15 germplasm resources with black or purple grain %

根據(jù)遺傳相似度構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2），發(fā)現(xiàn)蜀紫麥1801 與其他14 份小麥種質(zhì)資源的遺傳距離較遠(yuǎn)，特色小麥4 與漯珍1 號(hào)遺傳距離最近。按照遺傳距離遠(yuǎn)近，15份小麥種質(zhì)資源大致可分為3類(lèi)；Ⅰ類(lèi)只包括蜀紫麥1801，與其他小麥種質(zhì)資源關(guān)系較遠(yuǎn)；Ⅱ類(lèi)包括永黑麥1 號(hào)、特色小麥3、特色小麥5、周黑麥1 號(hào)、同盟黑小麥、特色小麥4、漯珍1 號(hào)、紫色小麥、稷紫黑麥9 號(hào)和衛(wèi)輝黑小麥等10 份種質(zhì)資源，其中，漯珍1 號(hào)是永黑麥1 號(hào)的母本，也是周黑麥1 號(hào)的母本；Ⅲ類(lèi)包括豫州黑麥2 號(hào)、特色小麥2、豫州黑麥1號(hào)和特色小麥1等4份種質(zhì)資源，豫州黑麥1 號(hào)親本組合為濟(jì)麥22/中普黑麥1 號(hào)//濟(jì)麥22，豫州黑麥2 號(hào)親本組合為濟(jì)麥22/紫優(yōu)21 號(hào)//濟(jì)麥22。Ⅱ類(lèi)、Ⅲ類(lèi)部分種質(zhì)資源間有明確的系譜關(guān)系。部分種質(zhì)資源來(lái)源系譜不明確，根據(jù)遺傳相似度分析結(jié)果，推斷其為遺傳背景相似品系，例如永黑麥1號(hào)與特色小麥3、豫州黑麥1號(hào)與特色小麥1、豫州黑麥2號(hào)與特色小麥2。

圖2 15份黑、紫色小麥種質(zhì)資源的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of 15 germplasm resources with black or purple grain

2.2 15份黑、紫色小麥種質(zhì)資源的籽?；ㄇ嗨睾糠治?/h3>

由表3可知，所有黑、紫色小麥種質(zhì)資源籽粒的總花青素含量均高于普通小麥中國(guó)春和新麥26。大部分黑、紫色小麥種質(zhì)資源（10份）籽粒中僅含有矢車(chē)菊色素、芍藥素、錦葵色素3 種花青素；很少一部分黑、紫色小麥種質(zhì)資源籽粒中除含有矢車(chē)菊色素、芍藥素、錦葵色素3 種花青素外，還含有少量飛燕草色素、矮牽牛色素、天竺葵色素。大部分黑、紫色小麥種質(zhì)資源籽粒中矢車(chē)菊色素含量均高于芍藥素含量?？偦ㄇ嗨睾孔罡叩氖亲仙←?，其次是周黑麥1 號(hào)、衛(wèi)輝黑小麥，分別為9.83、9.44、8.94 mg/kg，三者之間差異不顯著，但顯著高于其他種質(zhì)資源，3 份種質(zhì)資源均含有5 種花青素，多于其他種質(zhì)資源含有的花青素種類(lèi)。在所有種質(zhì)資源中，衛(wèi)輝黑小麥籽粒中含有的天竺葵色素和錦葵色素是最高的，周黑麥1 號(hào)籽粒中含有的飛燕草色素和矮牽牛色素是最高的，紫色小麥含有的矢車(chē)菊色素和芍藥素是最高的。在所有黑、紫色小麥種質(zhì)資源中，蜀紫麥1801 籽粒中總花青素含量最低，為1.23 mg/kg 其次為豫州黑麥2 號(hào)、特色小麥2、豫州黑麥1號(hào)、特色小麥1、漯珍1 號(hào)，籽粒中總花青素含量也較低，在1.50 ～2.23 mg/kg，6 份種質(zhì)資源間差異不顯著。

表3 15份黑、紫色小麥種質(zhì)資源的籽?；ㄇ嗨睾縏ab.3 Anthocyanin contents in grains of 15 germplasm resources with black or purple grain mg/kg

結(jié)合15 份小麥種質(zhì)資源的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和花青素含量結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Ⅰ類(lèi)（蜀紫麥1801）籽?？偦ㄇ嗨睾孔畹停瑑H為1.23 mg/kg；Ⅱ類(lèi)（永黑麥1 號(hào)、特色小麥3、特色小麥5、周黑麥1 號(hào)、同盟黑小麥、特色小麥4、漯珍1號(hào)、紫色小麥、稷紫黑麥9號(hào)和衛(wèi)輝黑小麥）總花青素含量為2.23～9.83 mg/kg；Ⅲ類(lèi)（豫州黑麥2 號(hào)、特色小麥2、豫州黑麥1 號(hào)和特色小麥1）總花青素含量為1.50～1.80 mg/kg?？梢?jiàn)，3 類(lèi)種質(zhì)資源之間總花青素含量有很大差異，總花青素含量表現(xiàn)為Ⅱ類(lèi)＞Ⅲ類(lèi)＞Ⅰ類(lèi)。

3 結(jié)論與討論

目前，利用系譜、農(nóng)藝性狀和分子標(biāo)記分析評(píng)價(jià)小麥品種遺傳多樣性的研究較多[23-28]。本研究選用廣泛分布在小麥21條染色體上的9 227個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)15 份黑、紫色小麥種質(zhì)資源進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SNP 位點(diǎn)多態(tài)性比率為77.12%，高于曹廷杰等[28]對(duì)河南省96個(gè)審定小麥品種的研究結(jié)果，說(shuō)明本研究15 份材料的遺傳背景較審定品種寬。亓?xí)岳俚萚16]利用SNP 分子標(biāo)記進(jìn)行小麥全基因組掃描，發(fā)現(xiàn)不同年份育成的21 個(gè)小麥品種中同一年份的品種一般聚在一起，與系譜關(guān)系吻合。本研究中聚在同一類(lèi)的部分小麥種質(zhì)資源間有明確的系譜關(guān)系，永黑麥1 號(hào)親本來(lái)源為漯珍1 號(hào)/周麥22，周黑麥1 號(hào)親本來(lái)源為周麥9 號(hào)/漯珍1 號(hào)，除了系譜中有共同親本漯珍1號(hào)之外，周麥9號(hào)還是周麥22的父本，所以在聚類(lèi)分析中，永黑麥1 號(hào)與周黑麥1 號(hào)遺傳距離較近，與系譜關(guān)系吻合。但二者與共同親本漯珍1號(hào)的遺傳距離較遠(yuǎn)，這可能是參與聚類(lèi)的種質(zhì)資源數(shù)量和類(lèi)型有限造成的。

劉易科等[29]研究發(fā)現(xiàn)，多態(tài)性SNP 位點(diǎn)在小麥B基因組中最多、D基因組中最少。張德強(qiáng)等[30]利用SNP 標(biāo)記對(duì)周8425B 及其16 份衍生品種和23 份黃淮麥區(qū)主栽品種進(jìn)行全基因組掃描，發(fā)現(xiàn)不同基因組間多態(tài)性SNP 標(biāo)記的分布表現(xiàn)為B＞A＞D。本研究中SNP 位點(diǎn)在B 基因組中最多、D 基因組中最少，與劉易科等[29]和張德強(qiáng)等[30]結(jié)果相似。這主要是因?yàn)槠胀ㄐ←溸M(jìn)化過(guò)程中D基因組與AABB 基因組形成六倍體小麥時(shí)間較短，多態(tài)性較低。

紫外可見(jiàn)分光光度法[31]和pH 示差法[32]僅可分析總花青素含量，而HPLC 法可以測(cè)定6 種花青素的含量[33]。本研究采用HPLC 法測(cè)定的小麥籽?；ㄇ嗨睾扛訙?zhǔn)確，類(lèi)別更加明確。葉琳[34]采用UHPLC-QTOF-MS 測(cè)定紫粒小麥科興617籽?；ㄇ嗨睾堪l(fā)現(xiàn)，其有11 種花色苷單體，芍藥素為第一主要花色苷，矢車(chē)菊色素為第二主要花色苷。本研究中12 份小麥種質(zhì)資源籽粒的第一主要花青素為矢車(chē)菊色素，第二主要花青素為芍藥素，與科興617不同，可能是由種質(zhì)資源差異引起的。李杏普等[35]研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)、紫粒小麥籽?；ㄇ嗨睾渴瞧胀ㄐ←湹?～6 倍。本研究中15 份黑、紫色小麥種質(zhì)資源籽粒中總花青素含量最低的蜀紫麥1801 和最高的紫色小麥，其總花青素含量分別是普通小麥新麥26的21 倍和165 倍，這為挖掘、利用高花青素含量的種質(zhì)資源提供了理論依據(jù)。

黑、紫色小麥中存在多個(gè)粒色相關(guān)的基因[36-37]，本研究中小麥種質(zhì)資源的SNP 位點(diǎn)豐富，為進(jìn)一步挖掘粒色相關(guān)基因提供了依據(jù)。例如：蜀紫麥1801與其他種質(zhì)資源的遺傳差異大，花青素含量較低，可以作為粒色相關(guān)位點(diǎn)的研究材料。高明剛等[38]利用SNP 標(biāo)記進(jìn)行小麥親本評(píng)價(jià)和雜交組合設(shè)計(jì)，已育成10個(gè)審定品種。本研究中，基于SNP標(biāo)記的聚類(lèi)分析將15 份小麥種質(zhì)資源分成3 類(lèi)，可為雜交組合設(shè)計(jì)提供參考。趙善倉(cāng)[39]研究認(rèn)為，小麥籽粒色素含量由遺傳決定，不同小麥品種籽粒中花青素含量差異顯著。本研究中不同小麥種質(zhì)資源間遺傳差異大、花青素含量差異大，與趙善倉(cāng)[39]結(jié)論一致。根據(jù)聚類(lèi)分析結(jié)果，小麥籽粒中總花青素含量表現(xiàn)為Ⅱ類(lèi)＞Ⅲ類(lèi)＞Ⅰ類(lèi)，3 類(lèi)之間總花青素含量有很大差異。董亞兵[40]研究認(rèn)為，貴紫麥1 號(hào)基因型和花青素含量呈正相關(guān)，與本研究結(jié)果一致，這可能是由于控制粒色的基因在系譜相關(guān)品種中的遺傳和選擇引起的。紫色小麥、衛(wèi)輝黑小麥和周黑麥1 號(hào)籽粒中花青素種類(lèi)豐富而且總花青素含量高于其他種質(zhì)資源，可與遺傳相似度低的其他種質(zhì)資源進(jìn)行雜交育種親本組配。

針對(duì)黑、紫色小麥種質(zhì)資源利用，建議繼續(xù)廣泛收集種質(zhì)資源，拓寬育種親本的遺傳基礎(chǔ)；應(yīng)用經(jīng)濟(jì)高效的花青素含量檢測(cè)技術(shù)，篩選花青素含量高的種質(zhì)資源；大力加強(qiáng)種質(zhì)資源的創(chuàng)新研究和利用，利用已有高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小麥骨干親本與搜集到的優(yōu)異基因資源進(jìn)行聚合雜交，創(chuàng)造新的優(yōu)異中間育種材料；借助分子標(biāo)記輔助選擇、雙單倍體育種等手段加快育種進(jìn)度。