桑世飛，王亞男，王君怡，曹夢(mèng)雨，孫曉涵，姬生棟

（1. 河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2. 河南省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新工程研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453007）

我國(guó)是世界上最大的水稻生產(chǎn)與消費(fèi)國(guó)，平均每年水稻生產(chǎn)與消費(fèi)量超過(guò)全世界總量的30%[1-2]。因此，確保水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)與國(guó)家糧食安全緊密相關(guān)。水稻稻瘟病是水稻生產(chǎn)中一種重要的病害，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量。在稻瘟病較流行的年份，其可致水稻減產(chǎn)10%～40%；在稻瘟病暴發(fā)的年份，其可致水稻減產(chǎn)50%～60%[3-4]。而生產(chǎn)上應(yīng)用的水稻品種由于稻瘟病菌生理小種的快速變異、栽培環(huán)境和生態(tài)環(huán)境的改變致使生態(tài)遺傳抗性減弱，品種的抗病性下降，極大地制約了水稻的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[5]。因此，為降低因稻瘟病暴發(fā)帶來(lái)的產(chǎn)量及經(jīng)濟(jì)損失，選育抗稻瘟病水稻品種顯得尤為重要。

近年來(lái)，關(guān)于廣譜稻瘟病抗性基因的克隆、鑒定與分析的研究已取得一系列突破，為水稻稻瘟病抗性改良奠定了基礎(chǔ)。目前，已鑒定出100 多個(gè)抗稻瘟病主效基因與500個(gè)稻瘟病抗性數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）[6-7]，其中有37 個(gè)基因被成功克隆和鑒定，NBS-LRR（Nucleotide binding site-leucine-rich repeats）類基因是水稻中應(yīng)用較廣泛的稻瘟病抗性基因，在水稻抗稻瘟病方面具有重要作用。例如，已經(jīng)克隆的廣譜稻瘟病抗性基因有Pi2、Pi9、Pi-kh、Pi50、Pi54、Pi54rh、Pi56（T）、Pi64、Pigm、Pizh和Pita-2等[8-11]。其中，位于6號(hào)染色體上的Pi50、Pigm、Pizh、Pi2、Pi9同為Piz 位點(diǎn)上的復(fù)等位基因[12]。一部分NBS-LRR 類基因已被應(yīng)用于水稻抗稻瘟病品種的選育，例如，吳婷婷等[13]應(yīng)用Pi9基因改良了水稻不育系豐源A的稻瘟病抗性。

隨著水稻功能基因組與分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇與傳統(tǒng)育種方法相結(jié)合成為現(xiàn)代育種的趨勢(shì)，其克服了傳統(tǒng)育種效率低、周期長(zhǎng)等問(wèn)題。目前，已經(jīng)利用分子標(biāo)記輔助選擇選育出一些稻瘟病抗性種質(zhì)。例如：何彎彎等[14]將含有Pib抗稻瘟病基因的品種津稻179 與徐稻3 號(hào)進(jìn)行雜交，通過(guò)水稻系譜法選育及田間接種和自然誘發(fā)鑒定，對(duì)受體的抗病性進(jìn)行改良，最終獲得具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀且水稻稻瘟病抗性增強(qiáng)的X13、X40、X41 和X42 四個(gè)品系；呂軍等[15]利用分子標(biāo)記輔助選擇聚合水稻抗稻瘟病基因Pita和香味基因fgr，最終篩選出含有抗稻瘟病基因Pita和香味基因fgr的4 個(gè)遼粳香系列品系；何光明等[16]通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)合回交轉(zhuǎn)育，首次成功地將抗衰老基因IPT（Isopentenyl transferase）、抗白葉枯病基因Xa23和抗稻瘟病基因Pi26聚合到一起；宋澤等[17]以攜帶Pi1和Pi9抗病基因的BC4F2群體為基礎(chǔ)材料，利用分子標(biāo)記輔助選擇完成BC5F5株系的構(gòu)建，改良了水稻特異種質(zhì)大粒溪香的稻瘟病抗性；曾曉強(qiáng)等[18]通過(guò)連續(xù)回交結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，將抗稻瘟病基因Pi2導(dǎo)入到高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)晚粳品種長(zhǎng)農(nóng)粳1 號(hào)中，改良了長(zhǎng)農(nóng)粳1 號(hào)的稻瘟病抗性；姚姝等[19]利用分子標(biāo)記輔助選擇選育出產(chǎn)量高、抗病性好的品系南粳0051；潘存紅等[20]用攜帶Pizt和Pib基因的粳稻品種武運(yùn)粳21 號(hào)與優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、感稻瘟病的中間材料L0 雜交，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇獲得6 個(gè)不同類型的穩(wěn)定株系，顯著提高了L0的稻瘟病抗性。然而對(duì)于品種或品系內(nèi)的稻瘟病抗性基因組合特征缺乏系統(tǒng)性研究。為進(jìn)一步深入研究當(dāng)前水稻品種（品系）中稻瘟病抗性基因的組合特征，對(duì)收集的291份水稻種質(zhì)資源進(jìn)行抗稻瘟病基因組合分析，系統(tǒng)分析當(dāng)前生產(chǎn)上水稻品種（品系）中的稻瘟病抗性基因組合特征，為今后抗稻瘟病分子標(biāo)記輔助選擇育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為來(lái)自河南（177份）、江蘇（39份）、天津（23 份）、浙江（9 份）、國(guó)際水稻所（8 份）、寧夏（4份）、山東（5 份）、安徽（5 份）、湖南（3 份）、河北（2份）、福建（2份）、上海（1份）及東北三?。ê邶埥⒓?、遼寧）（13 份）等?。ㄊ?、區(qū)）的共計(jì)291 份水稻種質(zhì)資源，以黃淮海區(qū)域種質(zhì)為主，主要由新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、鹽城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、河南師范大學(xué)水稻新種質(zhì)研究所等單位提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抗稻瘟病基因分子標(biāo)記收集及Pib基因分子標(biāo)記開(kāi)發(fā) 通過(guò)查閱文獻(xiàn)收集相關(guān)稻瘟病抗性基因的分子標(biāo)記（表1）。其中，有5 個(gè)共顯性標(biāo)記，分別為Pi9、Pi5、Pi2、Pita、Pi-kh；3個(gè)顯性分子標(biāo)記，分別為Pikm、Pit、Pb1。所有分子標(biāo)記的引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

從 GenBank（https://www. ncbi. nlm. nih. gov/genbank/）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索下載Pib抗病基因型序列（登錄號(hào)：AB013448.1）以及感病種質(zhì)資源9311的Pib等位基因序列，設(shè)計(jì)引物（F:5＇-TCCTGTCCCAGAAGACATAT-3＇；R:5＇-GTGACGGCGGATGCCTGACG-3＇）擴(kuò)增收集的種質(zhì)資源津稻10 號(hào)（Jindao 10）、新科稻29（Xinkedao 29，簡(jiǎn) 稱XKD 29）、新 科 稻89（Xinkedao 89，簡(jiǎn)稱XKD 89）的基因組序列，擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序，采用MEGA 5.1 進(jìn)行序列比對(duì)分析，以Pib感病、抗病基因型差異位點(diǎn)開(kāi)發(fā)特異引物。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增及電泳檢測(cè) 采用CTAB 法[25]提取水稻幼嫩葉片基因組DNA，以諾唯贊GreenTaqMix推薦濃度，設(shè)置10 μL PCR體系，根據(jù)各分子標(biāo)記引物的Tm 值設(shè)定退火溫度進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。150 V 電壓、1%瓊脂糖凝膠電泳15 min 檢測(cè)擴(kuò)增的目的條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pib分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

將Pib基因抗病基因型序列與水稻9311、津稻10 號(hào)、新科稻29、新科稻89 中的Pib等位基因序列進(jìn)行比對(duì)（圖1），發(fā)現(xiàn)序列比對(duì)區(qū)間存在多處變異，基于變異序列設(shè)計(jì)2 個(gè)分別針對(duì)性擴(kuò)增Pib感病與抗病基因型的分子標(biāo)記，且互相不干擾，能夠混合在一起實(shí)現(xiàn)共顯性擴(kuò)增。在Pib抗病基因型特異區(qū)域 開(kāi) 發(fā) 出1 個(gè) 顯 性 抗 病 分 子 標(biāo) 記（PibFk：5＇-AGCGAGGAAGCGGAGGGTGG-3＇，PibR：5＇-CAATGCATTTAA（G/A）CGTGCTCAC-3＇）；同時(shí)在Pib感病基因型特異區(qū)域設(shè)計(jì)1 個(gè)顯性感病分子標(biāo)記（PibF：5＇-CTGCTCGTTTGCGACCAATG-3＇，PibRg：5＇-GTTGAAGCCCTAGGATCCGCT-3＇）。理論上抗病材料可擴(kuò)增出500 bp 的目的片段，感病材料可擴(kuò)增出350 bp的目的片段。

圖1 不同水稻種質(zhì)資源Pib基因序列比對(duì)分析Fig.1 Sequence alignment analysis of Pib gene in different rice germplasm resources

將上述2 對(duì)引物混合在一起，選取12 份種質(zhì)資源進(jìn)行Pib基因型檢測(cè)，結(jié)果篩選出6 份含有Pib抗病基因型的水稻種質(zhì)（玉粳3、聯(lián)豐88、華粳5 號(hào)、新稻59、新糧310、武運(yùn)粳21），擴(kuò)增出500 bp 的目的條帶，6 份含有Pib感病基因型的水稻種質(zhì)（圣稻806、鎮(zhèn)稻99、新稻89、菡香1 號(hào)、新豐5 號(hào)、華粳5號(hào)），擴(kuò)增出350 bp 的目的條帶（圖2），表明Pib分子標(biāo)記可應(yīng)用于水稻抗稻瘟病基因型的檢測(cè)。

圖2 基于Pib基因分子標(biāo)記的抗（感）稻瘟病水稻種質(zhì)資源中Pib基因型鑒定Fig.2 Identification of Pib genotype in rice germplasm resources with blast resistance（susceptibility）based on molecular markers of Pib gene

2.2 9個(gè)抗稻瘟病基因在水稻種質(zhì)資源中的分布

本研究利用前人報(bào)道以及本研究開(kāi)發(fā)的Pib基因分子標(biāo)記（2 對(duì)引物混合）共計(jì)9 個(gè)抗稻瘟病基因分子標(biāo)記對(duì)291份水稻種質(zhì)資源中的抗稻瘟病基因進(jìn)行檢測(cè)（部分結(jié)果見(jiàn)圖3），發(fā)現(xiàn)Pi9、Pi2、Pib、Pikh、Pita、Pi5這6 個(gè)基因的分子標(biāo)記具有共顯性標(biāo)記特征。

圖3 部分水稻種質(zhì)資源中9個(gè)抗稻瘟病基因的分子檢測(cè)Fig.3 Molecular detection of nine blast resistance genes in some rice germplasm resources

對(duì)水稻種質(zhì)資源攜帶的抗稻瘟病基因數(shù)目進(jìn)行分析（圖4），發(fā)現(xiàn)單份水稻種質(zhì)資源攜帶的抗稻瘟病基因數(shù)目為0～6 個(gè)，其中攜帶6 個(gè)抗稻瘟病基因的種質(zhì)資源僅有1 份，即墾香48，占比最低，為0.4%；攜帶5 個(gè)抗稻瘟病基因的種質(zhì)資源有26 份，占比8.9%，包括武運(yùn)粳80、玉粳3、新稻59、藝稻628、新稻58 等；攜帶4 個(gè)抗稻瘟病基因的種質(zhì)資源有56份，占比19.2%；攜帶3個(gè)抗稻瘟病基因的種質(zhì)資源有119份，占比最高，為40.9%；攜帶2個(gè)抗稻瘟病基因的種質(zhì)資源有59份，占比20.3%；攜帶1個(gè)和0 個(gè)抗稻瘟病基因的種質(zhì)資源分別有24 份和6 份，分別占比8.2%和2.1%。

圖4 水稻種質(zhì)資源攜帶抗稻瘟病基因數(shù)目分析Fig.4 Analysis on the number of rice blast resistance genes carried by rice germplasm resources

對(duì)291份水稻種質(zhì)資源中各個(gè)抗稻瘟病基因的出現(xiàn)頻率進(jìn)行分析（圖5），發(fā)現(xiàn)9 個(gè)抗稻瘟病基因在水稻種質(zhì)資源中出現(xiàn)的頻率存在較大差異，介于7.2%～59.1%。其中，Pi9基因出現(xiàn)頻率最高，為59.1%；Pi-kh次之，為50.8%；Pib基因出現(xiàn)頻率為41.2%；Pi5基因出現(xiàn)頻率為36.4%；Pita基因出現(xiàn)頻率為29.2%；Pb1基因出現(xiàn)頻率為28.8%；Pi2基因出現(xiàn)頻率為19.5%；Pikm基因出現(xiàn)頻率為17.1%；Pit基因出現(xiàn)頻率最低，為7.2%。

圖5 9個(gè)抗稻瘟病基因在水稻種質(zhì)資源中的出現(xiàn)頻率Fig.5 Occurrence frequency of nine blast resistance genes in rice germplasm resources

2.3 291份水稻種質(zhì)資源中9個(gè)抗稻瘟病基因的組合類型

對(duì)291份水稻種質(zhì)資源的抗稻瘟病基因組合進(jìn)行分析（表2），發(fā)現(xiàn)291 份水稻種質(zhì)資源中共有抗稻瘟病基因組合93 個(gè)。其中，Pi9+Pi-kh+Pita組合水稻種質(zhì)資源最多，有18 份；其次為Pi9+Pi-kh+Pib組合，有17 份；組合為Pi9+Pb1的水稻種質(zhì)資源有11份；組合為Pi9+Pi5+Pb1、Pi9+Pi-kh和Pi-kh+Pita的種質(zhì)資源各有9 份；含有Pi9+Pi5+Pi-kh+Pib+Pita、Pi9+Pi5+Pi-kh和Pi-kh組合的種質(zhì)資源各有8份；含有Pi9+Pi5+Pib和Pi9組合的種質(zhì)資源各有7份；含有Pi2+Pib+Pit、Pi2+Pi5+Pi-kh和Pi5+Pi-kh組合的種質(zhì)資源各有6份。而其余組合數(shù)目則相對(duì)較少，如含有Pi9+Pi-kh+Pib+Pb1和Pi5+Pi-kh+Pib組合的種質(zhì)資源各有5份；含有Pi9+Pib+Pita+Pikm+Pb1、Pi9+Pi-kh+Pib+Pita、Pi9+Pi5+Pi-kh+Pib、Pi2+Pi-kh+Pib+Pb1、Pi2+Pib+Pikm+Pb1、Pi9+Pi5+Pikm、Pi2+Pita+Pikm、Pi5+Pb1、Pi9+Pi5和Pi5組合的種質(zhì)資源各有4份；含有Pi9+Pi5+Pib+Pita+Pikm、Pi2+Pib+Pita+Pikm+Pit、Pi9+Pi5+Pi-kh+Pb1、Pi9+Pi5+Pikm+Pb1、Pi9+Pi-kh+Pita+Pb1、Pi2+Pi5+Pi-kh+Pib、Pi9+Pib+Pb1、Pi9+Pita+Pb1、Pi9+Pi-kh+Pb1、Pi2+Pib+Pikm、Pi2+Pi-kh+Pib、Pi5+Pib和Pi9+Pib組合的種質(zhì)資源各有3 份；含有Pi9+Pi5+Pi-kh+Pib+Pb1、Pi9+Pi5+Pita+Pikm+Pb1、Pi9+Pi5+Pi-kh+Pita、Pi9+Pib+Pikm+Pit、Pi9+Pi5+Pib+Pb1、Pi2+Pib+Pikm+Pit、Pi2+Pi-kh+Pib+Pit、Pi9+Pib+Pita、Pi2+Pi5+Pib、Pi2+Pi-kh、Pib+Pita、Pb1和Pita組合的種質(zhì)資源各有2份；其余均僅有1份，如表2所示。

表2 291份水稻種質(zhì)資源9個(gè)抗稻瘟病基因組合分布Tab.2 Distribution of nine blast resistant gene combinations in 291 rice germplasm resources

續(xù)表2 291份水稻種質(zhì)資源9個(gè)抗稻瘟病基因組合分布Tab.2（Continued） Distribution of nine blast resistant gene combinations in 291 rice germplasm resources

3 結(jié)論與討論

稻瘟病是當(dāng)前水稻生產(chǎn)中威脅最大的一個(gè)真菌性病害，且稻瘟病菌變異快，育成品種稻瘟病抗性容易喪失[11]。因此，解析水稻稻瘟病抗性、選育抗稻瘟病水稻新品種已經(jīng)成為當(dāng)前解決稻瘟病的一個(gè)重要途徑。

利用廣譜抗性基因分子標(biāo)記檢測(cè)水稻品種中含有的抗稻瘟病基因類型、組合，分析各地區(qū)抗稻瘟病基因的分布比例，對(duì)特定地區(qū)種質(zhì)資源的稻瘟病抗性改良具有重要的指導(dǎo)意義。研究發(fā)現(xiàn)，在不同地區(qū)抗稻瘟病基因的利用頻率存在一定的差異。王亞等[22]對(duì)河南省139 份水稻種質(zhì)資源中的Pi-kh和Pi5基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Pi-kh基因出現(xiàn)頻率為48.4%，而浙江省水稻種質(zhì)資源中Pi-kh基因出現(xiàn)頻率則為41.3%[24]。說(shuō)明不同地區(qū)可能由于稻瘟病生理小種的不同選育出來(lái)的水稻品種所攜帶的抗稻瘟病基因存在一定的差異。本研究發(fā)現(xiàn)，Pi9和Pi-kh基因在291 份水稻種質(zhì)資源中的出現(xiàn)頻率均高于50%，Pib基因出現(xiàn)頻率超過(guò)40%，表明這些基因在收集的種質(zhì)資源中的應(yīng)用頻率較高，另外這些種質(zhì)分布較廣，可選擇部分?jǐn)y帶這類抗稻瘟病基因的種質(zhì)作為以后育種的主要抗性材料。本研究還發(fā)現(xiàn)，Pi5、Pit、Pi2、Pb1、Pita、Pikm基因在291 份水稻種質(zhì)資源中的出現(xiàn)頻率相對(duì)較低，在未來(lái)抗稻瘟病基因改良中有必要加大對(duì)Pi5、Pit、Pi2、Pb1、Pita、Pikm基因的利用率，以便提高稻瘟病抗性及持久性。

在育種實(shí)踐中，聚合抗稻瘟病基因可以提高水稻種質(zhì)資源稻瘟病抗性。例如：陳紅旗等[26]利用分子標(biāo)記技術(shù)聚合Pi-1、Pi-2和Pi-33三個(gè)抗稻瘟病基因，提高了金23B 的稻瘟病抗性。然而水稻種質(zhì)資源中聚合過(guò)多的抗稻瘟病基因可能會(huì)出現(xiàn)連鎖負(fù)效應(yīng)[27]；聚合數(shù)目過(guò)少，則難以維持水稻種質(zhì)資源的稻瘟病長(zhǎng)期抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，含有3～4 個(gè)抗稻瘟病基因的水稻種質(zhì)資源共占60.1%，意味著在水稻抗稻瘟病基因聚合育種時(shí)，聚合3～4 個(gè)稻瘟病抗性主效基因基本可以滿足生產(chǎn)或品種審定的需求，然而聚合稻瘟病抗性基因數(shù)目大于4的種質(zhì)資源依舊相對(duì)稀少，若要繼續(xù)維持老舊品種的生命力，則有必要對(duì)當(dāng)前推廣的品種做進(jìn)一步的抗稻瘟病基因聚合，以提升對(duì)多種稻瘟病生理小種的抗性，延長(zhǎng)水稻品種的生命周期。吳云雨等[28]研究發(fā)現(xiàn)，不同生態(tài)區(qū)選擇合適的抗性基因組合，才能夠保證水稻稻瘟病的持久抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶Pi9+Pi-kh+Pib和Pi9+Pi-kh+Pita2 種組合的水稻種質(zhì)資源較多。由于本研究選取的黃淮海區(qū)域的水稻種質(zhì)資源較多，或許意味著這2 種抗稻瘟病基因組合較適宜黃淮海區(qū)域的生態(tài)環(huán)境，這為今后黃淮海區(qū)域的抗稻瘟病育種提供了較有價(jià)值的參考，有助于加速黃淮海區(qū)域的抗稻瘟病育種進(jìn)程。