孟宇珍，龔 鐸，李文越，文 巖,2，樊哲瑜，張 潮，王 濤，傅善林，尉志文,*，贠克明,*

（1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 晉中 030600；2.太原市公安局萬柏林分局刑偵大隊(duì)，太原 030001）

百草枯（paraquat, PQ），一種快速滅生性除草劑[1]，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用，對(duì)人畜有很強(qiáng)的毒性。百草枯可經(jīng)由皮膚、黏膜、呼吸道、消化道等進(jìn)入人體，以肺部分布最多，損傷最大，肺纖維化伴呼吸衰竭是患者中毒后期死亡的主要原因，且因其在臨床上沒有特效解毒的手段，中毒死亡率高達(dá)80%以上[2-3]。中毒患者體內(nèi)百草枯濃度與死亡率有著密切的關(guān)系，所以，測定患者體內(nèi)百草枯濃度不僅有助于準(zhǔn)確診斷，也對(duì)于制定合理的治療方案有重要意義。

近年來，有關(guān)百草枯原體的液質(zhì)聯(lián)用法[4-10]檢測報(bào)道較多，本實(shí)驗(yàn)旨在使用合適的前處理方法，建立靈敏、快速、可應(yīng)用于同時(shí)檢測百草枯中毒患者血液中百草枯原體及其代謝物濃度的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑與材料

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀配有電噴霧電離源（Agilent，美國），Vortex Genie 2渦旋振蕩器（Scientifi c Industries，美國)，Neofuge 15R高速冷凍離心機(jī)（上海力申科學(xué)儀器有限公司），SC-3610低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），AR2130/C電子精密天平（Ohaus Corp，美國），Milli-Q integral系列純水機(jī)（Millipore，美國），全自動(dòng)氮吹濃縮儀ET3301（上海歐陸科技有限公司）。

甲酸銨、甲酸、甲醇、乙腈（色譜純，sigma，美國），乙腈、甲醇、環(huán)己烷（分析級(jí)，天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

百草枯（paraquat, PQ）標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma，德國），百草枯氘代內(nèi)標(biāo)（Paraquat-d8Dichloride, PQ-D8）標(biāo)準(zhǔn)品（Dr.Ehrenstorfer Gmbh，德國），單季銨鹽（monoquat）、百草枯-單吡啶酮（paraquat-monopyridone, MP）、百草枯-聯(lián)吡啶酮（paraquat-dipyridone,DP）、4-羧基-1-甲基吡啶鹽（4-Carboxy-1-methylpyridinium ion, MINA）購自上海美迪西生物醫(yī)藥股份有限公司。

實(shí)驗(yàn)過程中所用標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液均用色譜級(jí)甲醇制得，并于4 ℃冰箱避光保存，使用時(shí)以純甲醇稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 樣品前處理

取血液樣品500 μL，待測組織500 mg，固性檢材經(jīng)超聲細(xì)胞粉碎儀勻漿3 min，加入25 μL內(nèi)標(biāo)（100 ng/mL）混勻后，加入等體積的含0.025%甲酸的水溶液，渦旋30 s；加入3 mL分析純乙腈，渦旋30 s，4 500 r/min離心12 min，取上清液加入3 mL的環(huán)己烷洗滌，4 500 r/min離心8 min，取下層的乙腈層溶劑轉(zhuǎn)移至玻璃試管中，45 ℃氮?dú)饬飨聯(lián)]干，200 μL色譜級(jí)甲醇定容，渦旋1 min，將復(fù)溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，13 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)膜，上機(jī)檢測。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

1）PQ、monoquat、MP、DP

色譜柱：Allure PFPP 柱 (2.1 mm×100 mm,5 μm)，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μL。流動(dòng)相A：2 mmol/L甲酸銨緩沖液-體積分?jǐn)?shù)0.05%甲酸的水溶液；流動(dòng)相B：2 mmol/L甲酸銨緩沖液-體積分?jǐn)?shù)0.05%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脫程序：0～2 min，100% A；2～3min，30% A；3～5 min，100% A；5～8 min，100% A。流速0.60 mL/min。

2） MINA

色譜柱：Infi nityLab Poroshell 120 chiral-V柱（4.6 mm×150 mm, 2.7 μm），柱溫 30 ℃，進(jìn)樣量 5 μL；流動(dòng)相為0.2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）甲酸銨甲醇溶液，等度洗脫，流速0.60 mL/min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧電離源（AJS ESI）；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），正離子模式；電離電壓：3.0 kV；錐孔電壓：30 V；離子源溫度：110 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；錐孔反吹氣流速：45 L/h；脫溶劑氣流速：800 L/h。質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1，結(jié)構(gòu)式見圖1。

2 結(jié)果討論

2.1 色譜柱和提取溶劑的選擇

由于PQ的代謝物MINA與內(nèi)源性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)相似，碎片離子相同，色譜行為相同，質(zhì)譜分析不能解決同分異構(gòu)體的檢測問題，無法選用普通色譜柱進(jìn)行分離，現(xiàn)采用Infi nityLab Poroshell 120 chiral-V柱進(jìn)行手性分離，以萬古霉素（大環(huán)內(nèi)酯類抗生素）作為手性選擇劑（鍵合固定相），極性離子模式（PI），流動(dòng)相選用0.2%甲酸銨甲醇溶液，將緩沖鹽加入極性有機(jī)流動(dòng)相，改善可電離化合物的電離，保留特性分離效果較好，成功解決了內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)MINA的干擾。

PQ及其代謝物monoquat、MP、DP[11-12]的極性相差較大，選用普通親水柱分離效果不佳，峰形易拖尾，使用五氟苯基柱PFPP柱以一定濃度緩沖鹽體系為流動(dòng)相以改善其保留性質(zhì)和峰形，并利用梯度洗脫分離各物質(zhì)，monoquat、MP和DP的色譜行為較為接近，保留時(shí)間接近，通過質(zhì)譜行為可達(dá)到準(zhǔn)確分離。

作為堿性離子型化合物，百草枯及其代謝物易溶于酸性水溶液而不易溶于乙腈等有機(jī)試劑中，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)只加入乙腈沉淀蛋白后回收率差，且雜質(zhì)峰很多，而加入等體積的甲酸水后再加入3倍體積的乙腈溶液并用環(huán)己烷洗滌[13]可以顯著提高百草枯和代謝物的回收率。本文比較了不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸水溶液和提取溶劑、洗滌溶劑的提取效率，對(duì)百草枯及其代謝物的回收率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)無需使用造價(jià)昂貴的固相萃取小柱，用簡單有機(jī)溶劑多次提取，回收率高，確定使用1.2的前處理方法。

2.2 色譜分析

PQ、monoquat、MP、DP和MINA在選定的液相色譜-質(zhì)譜分析條件下，色譜行為良好，保留時(shí)間分別為0.90、3.65、3.65、3.65、6.51 min，TIC及MRM圖譜見圖2～圖7。

2.3 線性范圍

取相應(yīng)檢材分別加入百草枯及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，配制成一系列不同濃度的添加樣品，按照上述的前處理方法和儀器條件進(jìn)行分析。

以目標(biāo)物添加濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)（x），以峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程，考察線性范圍，詳細(xì)結(jié)果見表2。

表2 百草枯及其代謝物工作曲線線性范圍Table 2 Linear ranges of working curves for paraquat and its metabolite

2.4 準(zhǔn)確度與精密度

取空白檢材18份，分別添加百草枯及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成低、中、高加標(biāo)樣品各6份。

按照本研究建立的方法進(jìn)行樣品前處理和檢測，每日測定3次，連續(xù)測定3 d，得到日內(nèi)、日間精密度，并根據(jù)工作曲線計(jì)算準(zhǔn)確度，詳見表3。

表3 百草枯及其代謝物的準(zhǔn)確度及精密度（x±s, n=6）Table 3 Accuracies and precisions of paraquat and its metabolites (x±s, n=6)

2.5 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

在空白檢材前處理液中加入百草枯及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定PQ及其代謝物的峰面積（A）,再測定相同水平溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液中PQ及其代謝物的峰面積（B）,平行測5次。

根據(jù)公式基質(zhì)效應(yīng)＝A/B×100%。提取回收率為空白加標(biāo)樣品中PQ及其代謝物的峰面積（C）與相同水平基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中PQ及其代謝物的峰面積之比，公式為提取回收率=C/A×100%。PQ及其代謝物的評(píng)估水平見表4。結(jié)果顯示，PQ及其代謝物在血液及臟器檢材中存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，可以通過穩(wěn)定同位素稀釋法進(jìn)行定量，校正樣品的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收的不完全。

2.6 穩(wěn)定性

取空白檢材18份，分別添加百草枯及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成低、中、高加標(biāo)樣品各6份。按照本研究建立的方法進(jìn)行樣品前處理，在自動(dòng)進(jìn)樣器上室溫放置72 h，與標(biāo)稱值比較，結(jié)果顯示百草枯及其代謝物的相對(duì)偏差見表5。穩(wěn)定性結(jié)果表明，經(jīng)前處理后的樣品室溫存放72 h后，百草枯原體及其代謝物有所降解，準(zhǔn)確度有不同程度的下降，該結(jié)果可對(duì)百草枯相關(guān)案件的鑒定提供參考。

表5 PQ及其代謝物的偏差Table 5 Deviations of PQ and its metabolites

2.7 案件應(yīng)用

王某，男，2017年7月6日口服百草枯農(nóng)藥，2017年7月18日因肺纖維化致呼吸衰竭而死亡。于2017年7月20日進(jìn)行尸體解剖，取各組織臟器及心血送檢[13]，相關(guān)檢材被存放于-80℃冰箱，2021年對(duì)其檢材依照本文建立的方法進(jìn)行復(fù)檢（部分檢材量少，保存不良，缺失），檢出PQ及其代謝物的定量結(jié)果對(duì)比見表6。

表6 案例中PQ及其代謝物的含量比較Table 6 Comparison of content of PQ and its metabolites from on case

3 討論

百草枯中毒案件逐年增多，與此相關(guān)的法醫(yī)學(xué)鑒定工作也越來越多。當(dāng)前國內(nèi)外對(duì)于百草枯中毒或致死的鑒定主要依據(jù)百草枯原體，對(duì)于代謝物的研究較少，且檢測所需樣品量大，檢測限高，或者技術(shù)難以在實(shí)驗(yàn)室普及。本實(shí)驗(yàn)方法所需樣品量少（僅需血液500 μL、臟器500 mg），對(duì)檢材類型要求少，可以針對(duì)心臟、肝臟、脾、肺、腎等檢材進(jìn)行前處理，對(duì)缺乏液體檢材案件的鑒定提供了幫助，且定量結(jié)果更為精確，達(dá)到pg級(jí)別，建立了可同時(shí)檢測百草枯原體及其主要代謝物濃度的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。

百草枯中毒案件受到染毒途徑、檢材采集及保存條件等因素影響，對(duì)中毒時(shí)間長的死者解剖或檢材存放時(shí)間過長、保存條件不利有可能檢驗(yàn)不到PQ及其代謝物。這就對(duì)PQ中毒后的原體及其代謝物的分解動(dòng)力學(xué)研究提出了要求，以期發(fā)現(xiàn)更好的鑒定指標(biāo)，用于指導(dǎo)檢材提取和保存。

通過對(duì)案件的復(fù)檢研究可以發(fā)現(xiàn)，常規(guī)的PQ中毒案件采取血液檢材復(fù)檢只能檢出PQ，因代謝物在血液中的含量比較低，已接近甚至低于定量限，存在定性、定量不準(zhǔn)的問題，如果儀器靈敏度差，在血液中則有可能檢測不到代謝物。中毒（死）者一般口服百草枯，由腎排出50%～70%，由于中毒持續(xù)時(shí)間長，在肺中蓄積濃度高，且在體內(nèi)很少發(fā)生降解，較小部分以monoquat、MP等代謝物的形式被檢測到，30%原體常隨糞、尿排出，故而PQ及其代謝物的含量在腎臟、肺臟中的分布均較高且穩(wěn)定[13-14]，因此在PQ中毒（死）案件的檢驗(yàn)鑒定中，建議可將腎臟、肺臟組織作為必取檢材進(jìn)行檢驗(yàn)鑒定，也能使后期的復(fù)檢更為可靠。同時(shí)根據(jù)百草枯的分解動(dòng)力學(xué)研究[15]結(jié)果，在檢材的最佳保存條件下、檢測有效期內(nèi)進(jìn)行檢測，能使檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。

PQ在堿性介質(zhì)中極不穩(wěn)定，遇紫外線易分解[13]，有文獻(xiàn)證實(shí)，PQ在外界土壤環(huán)境中會(huì)降解[16]，微生物降解也是很重要的一個(gè)途徑，自然界中的微生物菌群體會(huì)以PQ為氮源；有研究發(fā)現(xiàn)，在百草枯農(nóng)藥產(chǎn)品中也可檢出PQ及代謝物，提示商品在生產(chǎn)過程中可能有副產(chǎn)品或者在存置過程中百草枯產(chǎn)生了分解產(chǎn)物[15]，這可能對(duì)于百草枯相關(guān)案件的鑒定造成影響。也有研究證明，原體及代謝物在生物樣品中有不同的分解速度[15]，故進(jìn)行百草枯案件的法醫(yī)學(xué)鑒定時(shí)，應(yīng)謹(jǐn)慎考慮多種因素的影響。