溫玉發(fā)，丁亞軍，王虎斌，喬紅群

(1.南京工業(yè)大學(xué)，南京 211816；2.江蘇省藥物安全性評(píng)價(jià)中心，南京 211816)

19F-磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各種領(lǐng)域，包括分子成像、細(xì)胞示蹤、藥物遞送與定量、氧分壓測(cè)定、肺功能成像等多方面的精準(zhǔn)診斷與治療研究[1]。傳統(tǒng)的氫磁共振(1H-MRI)與19F-MRI相比，由于生物體內(nèi)含水量>60%，H元素易引發(fā)組織內(nèi)部及不同組織間磁共振影像的相互干擾，而人體中只有牙齒含有少量的氟，19F-MRI 具有無背景噪聲干擾且特異性極高的優(yōu)點(diǎn)。此外，反復(fù)使用1H-MRI診斷劑后會(huì)殘余并積累在人體中的潛在毒性風(fēng)險(xiǎn)也引起了廣泛關(guān)注[2]。LL02是一個(gè)以19F標(biāo)記的RGD肽類新型造影劑，能與腫瘤血管高水平表達(dá)的整合素αvβ3特異性結(jié)合，并靶向標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)的磁共振成像，為腫瘤的成像及同步診療開辟了新的途徑，進(jìn)一步推動(dòng)未來醫(yī)療診斷領(lǐng)域的發(fā)展[3]。筆者在本研究通過觀察藥物L(fēng)L02對(duì)清醒狀態(tài)比格(Beagle)犬心血管和呼吸系統(tǒng)的影響，研究該藥物是否存在潛在的對(duì)生理功能的不良影響，為臨床研究和用藥安全提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Beagle犬4只，普通級(jí)，雌雄各半，成年犬，體質(zhì)量9.8～11.2 kg(首次給藥時(shí))，購自北京瑪斯生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0001。飼養(yǎng)于江蘇省藥物安全評(píng)價(jià)中心動(dòng)物房，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：11400600001621；動(dòng)物房間溫度：18～26 ℃；相對(duì)濕度：40%～70%；噪音≤60 dB；換氣次數(shù)：≥8次·h-1；動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，籠具每月更換1次，更換后噴霧消毒。本研究中動(dòng)物已通過江蘇省藥物安全評(píng)價(jià)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施，動(dòng)物倫理編號(hào)：IACUC-20180326-01。

1.2藥物與試劑 LL02(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院，批號(hào)：LL20171229-2，含量：97.5%)；溶媒：0.9%氯化鈉注射液(江蘇淮安雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：1702033C)。

1.3儀器與設(shè)備 DSI植入式生理信號(hào)遙測(cè)采集系統(tǒng)(包括TA11PA-C10-TOX-LA血壓植入子、JET藍(lán)牙接收器、Ponemah Physiology Platform 5.2軟件，美國(guó)Data Sciences International公司)；電子分析天平(型號(hào)：XS105DU，梅特勒-托利多儀器公司，感量：0.01 mg)；雙人單面超凈臺(tái)(型號(hào)：SW-CJ-2D，蘇州凈化設(shè)備有限公司)；電子臺(tái)秤(型號(hào)：AWH-150TC，上海英展機(jī)電企業(yè)有限公司)。

1.4給藥方案及選擇理由 給藥劑量：LL02臨床使用劑量為40 μg·kg-1。按照《藥物安全藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[4]及相關(guān)指導(dǎo)原則要求[5]，分別選擇給藥劑量為3，6，12 μg·kg-1作為L(zhǎng)L02對(duì)心血管和呼吸系統(tǒng)影響試驗(yàn)的小、中、大劑量組，劑量相當(dāng)于人臨床等效劑量的2.8，5.5和11.1倍(人平均體質(zhì)量以60 kg計(jì))；溶媒對(duì)照組給予同等體積氯化鈉注射液。以上各組動(dòng)物給藥體積均為0.5 mL·kg-1(根據(jù)最近一次計(jì)劃稱定質(zhì)量的動(dòng)物體質(zhì)量計(jì)算理論給藥體積)。給藥途徑：靜脈給藥。給藥方法：前肢靜脈注射，注射器推注。給藥頻率及期限：?jiǎn)未谓o藥。

1.5分組及給藥 采用Double 4×4 拉丁方設(shè)計(jì)，設(shè)溶媒對(duì)照組、小劑量組、中劑量組、大劑量組。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前已完成植入子植入手術(shù)，且術(shù)后完全恢復(fù)后開始實(shí)驗(yàn)。由非臨床藥動(dòng)學(xué)研究數(shù)據(jù)表明：LL02在血中的清除迅速。一般給藥后2 h，其血液中的放射性降低至初始濃度約5%。在比格犬中血藥濃度-時(shí)間曲線末端項(xiàng)，清除半衰期(t1/2)為(57.34±11.69) min。而動(dòng)物的洗脫期往往是消除半衰期5～7倍，所以本文以48 h作為兩次給藥間隔的洗脫期。

1.6配制溶液 溶媒對(duì)照：0.9%氯化鈉注射液。LL02：每次于給藥前配制足夠量給藥制劑用于當(dāng)天的給藥。根據(jù)體質(zhì)量，稱取適量的LL02，用0.9%氯化鈉注射液稀釋成濃度為24.0，12.0和6.0 μg·mL-1作為大、中、小劑量組使用。

1.7植入子植入手術(shù) 手術(shù)前提前打開植入子開關(guān)，使其內(nèi)部電子元件穩(wěn)定工作，打開軟件觀察植入子信號(hào)及壓力是否正常，將壓力導(dǎo)管在無菌0.9%氯化鈉溶液中浸泡至少15 min。沿股動(dòng)脈走向切開腹股溝位置皮膚，鈍性分離暴露出股動(dòng)脈1～2 cm。在股動(dòng)脈的近心端、中間、遠(yuǎn)心端分別放置一根不可吸收縫線。確保導(dǎo)管內(nèi)充滿生物膠，如導(dǎo)管內(nèi)產(chǎn)生氣泡，使用灌膠注射器將氣泡移出。使用導(dǎo)管引導(dǎo)器刺破并擴(kuò)張血管，將導(dǎo)管緩緩插入動(dòng)脈腔。確保將導(dǎo)管牢牢得固定到血管上。在腹股溝區(qū)域，用不可吸收縫線通過縫合脊將植入子固定在肌肉上。每只比格犬股動(dòng)脈處已提前植入血壓植入子(PA-C10-TOX-LA)，且術(shù)后完全恢復(fù)后開始實(shí)驗(yàn)。心電及體溫電極放置位置剃毛，穿戴好馬甲內(nèi)衣，固定好呼吸綁帶，預(yù)先進(jìn)行呼吸定標(biāo)，固定心電或體溫電極、血壓天線，穿好馬甲，所有的線穿過馬甲的孔，將電極導(dǎo)線和血壓附件連接到JET設(shè)備上。使用磁鐵打開動(dòng)物體內(nèi)植入子開關(guān)，AM收音機(jī)進(jìn)行確認(rèn)。

1.8測(cè)量指標(biāo)

1.8.1體質(zhì)量 每次給藥當(dāng)天，每只動(dòng)物稱定體質(zhì)量一次，并記錄。

1.8.2血壓測(cè)定 實(shí)驗(yàn)前，打開植入子開關(guān)，通過接收器接收信號(hào)，記錄每只比格犬收縮壓(SYS)、舒張壓(DIA)及平均動(dòng)脈壓(MAP)的變化。

1.8.3心電指標(biāo)的測(cè)定 通過心電導(dǎo)聯(lián)記錄比格犬標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，觀察心率(HR)、心電圖(QRS、PR、QT、QTcB)變化情況。校正QT間期采用Bazett公式計(jì)算，QTcB=QT/(RR)1/2。

1.8.4呼吸指標(biāo)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)前固定每只比格犬的胸部綁帶和腹部綁帶，通過呼吸傳感器和呼吸流量測(cè)定模塊對(duì)每只動(dòng)物進(jìn)行呼吸定標(biāo)，實(shí)驗(yàn)時(shí)通過呼吸綁帶記錄每只動(dòng)物潮氣量及呼吸頻率的變化。

1.8.5指標(biāo)數(shù)據(jù)采集與分析 使用DSI Ponemah Physiology Platform 5.2軟件對(duì)以上指標(biāo)進(jìn)行自動(dòng)采集，連續(xù)記錄給藥前2 h至給藥后2 h的數(shù)據(jù)。分別對(duì)給藥前1 h及給藥后(按給藥結(jié)束時(shí)間點(diǎn)計(jì))5，10，15，30，60，90，120 min各個(gè)檢測(cè)點(diǎn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。人工核對(duì)心電圖波形標(biāo)記是否正確。計(jì)算各指標(biāo)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處1 min內(nèi)的平均值。當(dāng)動(dòng)物身體活動(dòng)導(dǎo)致1 min內(nèi)中有不穩(wěn)定信號(hào)時(shí)，選擇該時(shí)間點(diǎn)附近最接近該時(shí)間點(diǎn)的連續(xù)1 min時(shí)間段的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并將分析結(jié)果作為相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1心電圖 監(jiān)測(cè)小、中、大劑量組給藥前、給藥后5，10，15，30，60，90，120 min各時(shí)間點(diǎn)心電指標(biāo)(心率、QRS、PR、QT、QTcB)，分組因素和時(shí)間因素?zé)o交互作用。與溶媒對(duì)照組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，各給藥組各項(xiàng)心電指標(biāo)均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。結(jié)果見圖1。

圖1 LL02對(duì)比格犬心率和QRS、PR、QT間期及QTcB的影響Fig.1 Effects of LL02 on heart rate， QRS interval， PR interval， QT interval and QTCB of Beagle

2.2血壓 LL02小、中、大劑量組不同時(shí)間點(diǎn)收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓，分組因素和時(shí)間因素?zé)o交互作用。與溶媒對(duì)照組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，各給藥組收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 LL02對(duì)比格犬收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓的影響Fig.2 Effects of LL02 on systolic， diastolic and mean arterial pressure of Beagle

2.3呼吸 LL02小、中、大劑量組不同時(shí)間點(diǎn)潮氣量、呼吸頻率，分組因素和時(shí)間因素?zé)o交互作用。與溶媒對(duì)照組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，各給藥組潮氣量、呼吸頻率均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 LL02對(duì)比格犬潮氣量和呼吸頻率的影響Fig.3 Effects of LL02 on tidal volume and respiratory rate of Beagle

3 討論

安全藥理學(xué)是研究藥物劑量在治療范圍內(nèi)及超過治療范圍時(shí)，潛在不期望出現(xiàn)的生理機(jī)能的藥物作用，主要考察其對(duì)動(dòng)物心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)潛在的影響。根據(jù)需要對(duì)藥物進(jìn)行追加和(或)補(bǔ)充的安全性藥理研究[7]，彌補(bǔ)毒理實(shí)驗(yàn)觀察的不足，為臨床試驗(yàn)所需的藥理及毒理信息提供了參考。

ICH S7A[8]、S7B[9]和《藥物安全藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》在進(jìn)行心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)的安全性評(píng)價(jià)時(shí)，均推薦使用清醒動(dòng)物模型。與傳統(tǒng)麻醉動(dòng)物的方式比較，使用清醒動(dòng)物可提高QT間期、心率和血壓等安全藥理學(xué)參數(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確性;能更好地模擬正常動(dòng)物給藥后在不受束縛情況下的反應(yīng)。另外經(jīng)過藥物洗脫期后動(dòng)物可重復(fù)給藥，符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)減少、優(yōu)化、替代的3R原則[10-11]。

LL02作為一種新型高分辨率、高靈敏度MRI探針造影劑，利用F原子磁共振效應(yīng)，可直接或間接顯示生物體內(nèi)更為豐富的結(jié)構(gòu)信息，在活體內(nèi)無背景信號(hào)干擾且不會(huì)殘留體內(nèi)，其精湛的空間分辨能力使其具有更為準(zhǔn)確的定位能力，更加有利于病理生理學(xué)的評(píng)估[12]。

本研究通過對(duì)預(yù)先埋植有DSI遙測(cè)植入子的清醒Beagle犬靜脈注射3，6，12 μg·kg-1的LL02，發(fā)現(xiàn)Beagle犬心電圖(心率、QRS間期、PR間期、QT間期、QTcB)和血壓(收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓)及呼吸(潮氣量、呼吸頻率)指標(biāo)均未見明顯改變，并未發(fā)現(xiàn)有1H-MRI造影劑在使用中的毒性反應(yīng)，說明在上述劑量下的新型19F-MRI造影劑LL02安全性良好，在較大劑量應(yīng)用于磁共振診療腫瘤時(shí)也較為安全，具有很好的臨床應(yīng)用前景。