王澤泰, 婁丹丹, 彭 燕, 朱道琦, 李愛武, 宮鳳英, 呂 英, 范 欽

（1.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院分子生物學(xué)教研室，廣東 廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院古中醫(yī)科，廣東 廣州 510515）

鼻咽癌是一種于我國南方地區(qū)高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤，目前的治療手段有放療、化療、手術(shù)和靶向治療等［1］，但放化療抵抗的產(chǎn)生和嚴(yán)重的不良反應(yīng)常導(dǎo)致鼻咽癌患者治療失?。?］。因此，尋找治療鼻咽癌新型有效藥物成為亟待解決的問題。中藥具有多靶點(diǎn)效應(yīng)、不良反應(yīng)少和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢，因而成為抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)。

姜黃素是從姜黃根莖中提取的天然中藥單體，為姜黃的主要活性成分［3］，中醫(yī)認(rèn)為其具有破血消瘀作用?，F(xiàn)代研究［4］表明：姜黃素具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、增強(qiáng)放化療和抗腫瘤等多種藥理作用。目前姜黃素抗鼻咽癌的研究仍以細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠模型為主，因此建立更多的鼻咽癌動物模型對研究鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展規(guī)律和防治措施具有重要作用。

斑馬魚是一種原產(chǎn)于印度和巴基斯坦等國家的小型熱帶淡水魚，目前已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域公認(rèn)的脊椎動物模型［5］。與經(jīng)典的小鼠/大鼠模型比較，主要有以下優(yōu)勢［6-7］：①體外受精、體外發(fā)育，易于獲得胚胎進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)研究和藥物實(shí)驗；②胚胎透明，可直接觀察體內(nèi)器官，結(jié)合活體染料、抗體和核酸探針等方法，有利于了解體內(nèi)腫瘤的生物學(xué)特性；③易于繁殖，產(chǎn)卵量大，發(fā)育較快，研究耗時短，實(shí)驗通量高；④與哺乳動物的生理、發(fā)育和代謝途徑相似，且與人類基因組同源性高，是預(yù)測疾病的良好模型。基于以上優(yōu)點(diǎn)，斑馬魚已被廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、分子生物學(xué)、腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和免疫學(xué)等多種研究領(lǐng)域。近幾年來，斑馬魚移植瘤動物模型在腫瘤研究領(lǐng)域迅速興起，不僅可以用于研究腫瘤血管生成、細(xì)胞遷移和藥物反應(yīng)，還可以作為個性化癌癥治療的實(shí)時體內(nèi)平臺［8-9］，憑借高通量和低成本的特色在醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著不可替代的作用。

本研究以斑馬魚為動物載體，建立鼻咽癌斑馬魚移植瘤模型，明確姜黃素對鼻咽癌的抑制作用，并研究了姜黃素對CNE-2 細(xì)胞增殖和遷移的影響，旨在探討鼻咽癌斑馬魚移植瘤模型能否準(zhǔn)確評價姜黃素的治療效果，為該模型應(yīng)用于腫瘤藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物和細(xì)胞

人低分化鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞株（中山大學(xué)腫瘤防治中心惠贈），37 ℃、5% 二氧化碳（CO2） 的孵育條件下，在含有10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每天換液，細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶70%～80% 時用0.25% 胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。AB 野生型斑馬魚，由國家斑馬魚資源中心提供。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)于28.5 ℃恒溫斑馬魚培養(yǎng)系統(tǒng)中，光照條件為14 h：10 h 明暗交替，每日2 次喂食孵化后的千年蟲。

1.2 主要試劑和實(shí)驗器材

RPMI 1640 培養(yǎng)基、 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS） 和胰酶（美國Gibco 公司），CCK-8試劑（中國Abbkine 公司），姜黃素（中國曼斯特公司），細(xì)胞膜紅色熒光染色劑CM-Dil （上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。斑馬魚培養(yǎng)系統(tǒng)（中國海圣公司），斑馬魚注射儀（日本Nikon 公司）。

1.3 CM-DiI 染色檢測CNE-2 細(xì)胞熒光強(qiáng)度CNE-2 細(xì)胞分為對照組和CM-Dil 組，2 組細(xì)胞初始密度一致。CM-DiI 組細(xì)胞用胰酶消化后重懸吹打為單細(xì)胞懸液，1 mL 細(xì)胞懸液加入5 μL 活細(xì)胞染色劑CM-DiI。置于5% CO2培養(yǎng)箱中孵育10～15 min。PBS 緩沖液清洗3 次后用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，連續(xù)5 d 進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，觀察熒光強(qiáng)度。每組重復(fù)3 次，并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4 人鼻咽癌斑馬魚模型的構(gòu)建

1.4.1 斑馬魚胚胎收集 挑選性成熟的AB 型斑馬魚4～5 對進(jìn)行繁殖，于次日將胚胎收集至培養(yǎng)皿中，每皿約100～200 個受精卵，用吸管吸干凈雜質(zhì)及未受精的乳白渾濁卵，置于28 ℃孵箱進(jìn)行孵育，每日更換培養(yǎng)液。

1.4.2 瓊脂板的制備 稱取1g 瓊脂糖粉在燒瓶中，加入100 mL 去離子水，微波爐加熱沸騰后倒進(jìn)干凈培養(yǎng)皿，待冷卻后制作成擺放斑馬魚的平板，以供顯微注射時用。

1.4.3 細(xì)胞染色 CNE-2 細(xì)胞用胰酶消化后重懸吹打為單細(xì)胞懸液，取5 μL CM-Dil，加入到1 mL細(xì)胞懸液中。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育10～15 min，PBS 緩沖液洗3 次后用RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸，顯微鏡下計數(shù)并調(diào)整濃度為2×107mL－1，置于冰上備用。

1.4.4 斑馬魚胚胎的麻醉及注射 斑馬魚胚胎分為對照組、PBS 組和模型組。每皿取30 個受精后天數(shù)（days postfertilization，dpf） 為2 的斑馬魚胚胎，用0.001% 三卡因溶液麻醉后，用吸管輕輕吸至濕潤的濃度為1.0% 的瓊脂板上，整齊均勻擺放以方便注射。將盛放斑馬魚胚胎的瓊脂板置于顯微鏡視野中央，將注射針插入到模型組斑馬魚胚胎的卵黃囊中，注入已染色的鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞，每個胚胎注射細(xì)胞懸液10 nL，約200 個細(xì)胞；對照組斑馬魚胚胎不進(jìn)行處理，PBS 組斑馬魚胚胎注射等量PBS 緩沖液。注射后立即于熒光顯微鏡下成像，評估是否注射成功。之后將注射成功的斑馬魚置于孵箱中培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗。

1.5 HE 染色觀察斑馬魚移植瘤組織形態(tài)表現(xiàn)

取對照組（未注射CNE-2 細(xì)胞） 和模型組斑馬魚于10% 甲醛固定液中固定，4 ℃過夜，以保持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。洗滌脫水，浸蠟包埋后制備病理切片。蘇木素和伊紅（HE） 染色后封片，于顯微鏡下觀察模型組斑馬魚移植瘤組織形態(tài)表現(xiàn)，進(jìn)行圖像采集分析。

1.6 姜黃素體內(nèi)用藥濃度篩選

將3 dpf 的斑馬魚胚胎分為對照組（ 0 μ mol·L－1姜黃素組） 和不同濃度（0.625、1.250、2.500、5.000、7.500 和10.000 μmol·L－1）姜黃素組，每組30 條，姜黃素作用48 h 后統(tǒng)計各組斑馬魚死亡數(shù)和致畸數(shù)，并計算斑馬魚死亡率。

1.7 姜黃素干預(yù)后各組斑馬魚移植瘤熒光強(qiáng)度和發(fā)生移植瘤頭尾部轉(zhuǎn)移的斑馬魚數(shù)

用飼養(yǎng)水將姜黃素終濃度調(diào)整至篩選出的工作濃度0、0.625、1.250、2.500 和5.000 μmol·L－1，0 μmol·L－1姜黃素組為對照組。將3 dpf 的斑馬魚模型置于上述配制好的姜黃素飼養(yǎng)水中，置于孵箱中48 h。分別選取3 和5 dpf （姜黃素作用48 h） 的斑馬魚模型于宏觀體式顯微鏡熒光狀態(tài)下拍照。利用Image J 軟件分析處理熒光圖片，對各組的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。統(tǒng)計各組發(fā)生移植瘤頭尾部轉(zhuǎn)移的斑馬魚數(shù)。

1.8 CCK-8 法檢測各組細(xì)胞增殖率

取處于對數(shù)生長期的CNE-2 細(xì)胞，用含10%FBS 的完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104mL－1，96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔接種100 μL ，設(shè)空白組（不加細(xì)胞）、 對照組和10 及20 μmol·L－1姜黃素組，每組5 個復(fù)孔。37 ℃培養(yǎng)24 h 后終止培養(yǎng)，每孔加入10 μL CCK-8 溶液。37 ℃孵育2 h 后，酶標(biāo)儀檢測波長450 nm 處的吸光度（A） 值，計算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=（加藥組A 值－空白組A 值） /（對照組A 值－空白組A 值） ×100%。

1.9 劃痕試驗檢測各組細(xì)胞遷移率

細(xì)胞分組同“1.8”，取處于對數(shù)生長期的CNE-2 細(xì)胞，均勻接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入5×105個細(xì)胞。常規(guī)條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長鋪滿板底時，用200 μL 移液器吸頭于6 孔板孔中心軸處劃1 條均勻直線。用PBS 緩沖液洗去劃落的細(xì)胞，對照組細(xì)胞中加入RPMI 1640 培養(yǎng)基，不同劑量姜黃素組細(xì)胞中分別加入含10 和20 μmol·L－1姜黃素的培養(yǎng)基。按0 和24 h 取樣，于倒置熒光顯微鏡下拍照，采用Image J 軟件處理分析記錄劃痕面積，計算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=（0 h 劃痕面積－24 h 劃痕面積） /0 h 劃痕面積×100%。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。2 組細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度，各組斑馬魚存活數(shù)、畸形數(shù)和移植瘤熒光強(qiáng)度，各組細(xì)胞增殖率和遷移率均符合正態(tài)分布，以x±s表示，2組間樣本均數(shù)（2組細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度） 比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差不齊采用Tamhane’s T2 （M） 法分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CM-DiI 標(biāo)記后2 組細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度

體外實(shí)驗中，通過細(xì)胞膜紅色熒光染色劑CM-DiI 標(biāo)記，連續(xù)5 d 細(xì)胞計數(shù)，與對照組比較，CM-Dil 組細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.642，P＞0.05）（圖1）。顯微鏡下觀察：紅色熒光強(qiáng)度隨著細(xì)胞數(shù)的增加而增強(qiáng)（圖2），表明CM-Dil 染料對細(xì)胞增殖無明顯影響，可用于體外活細(xì)胞標(biāo)記并反映細(xì)胞的生長情況。

圖1 CM-DiI 標(biāo)記后各組CNE-2 細(xì)胞數(shù)Fig.1 Number of CNE-2 cells in various groups after CM-DiI labeling

圖2 CM-DiI 標(biāo)記后不同時間CNE-2 細(xì)胞熒光強(qiáng)度（×40）Fig.2 Fluorescence intensities of CNE-2 cells after CM-DiI labeling (×40)

2.2 各組斑馬魚存活數(shù)和體內(nèi)移植瘤熒光強(qiáng)度

在5 dpf 時，與對照組（71±1） 比較，PBS 組斑馬魚存活數(shù)（72±2） 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與對照組和PBS 組比較，模型組斑馬魚存活數(shù)（58±3） 明顯減少（P＜0.01）。注射后第1、3 和5 天（即3、5 和7 dpf） 模型組斑馬魚體內(nèi)紅色熒光細(xì)胞數(shù)隨時間的延長而增加，熒光強(qiáng)度分別為（21.084±1.102）、（24.351±0.365） 和（28.572±1.36） 像素×106；與3 dpf 比較，7 dpf 模型組斑馬魚體內(nèi)移植瘤熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。提示CM-Dil 染料可用于體內(nèi)活細(xì)胞標(biāo)記反映細(xì)胞的生長情況。見圖3。

圖3 顯微注射后各組斑馬魚存活數(shù)和斑馬魚體內(nèi)移植瘤熒光強(qiáng)度Fig.3 Survival number and fluorescence intensity of transplanted tumor of zebrafish in various groups after microinjection

2.3 模型組斑馬魚移植瘤組織形態(tài)表現(xiàn)

與對照組比較，模型組斑馬魚腫瘤組織生長良好，無明顯壞死，細(xì)胞核形態(tài)大且明顯，邊緣清晰，細(xì)胞膜完整，偶有空泡。見圖4。

圖4 斑馬魚移植瘤組織形態(tài)表現(xiàn)Fig.4 Morphology of transplanted tumor tissue of zebrafishes

2.4 姜黃素體內(nèi)給藥濃度

斑馬魚暴露于含姜黃素的飼養(yǎng)水2 d，在濃度小于或等于5.000 μmol·L－1姜黃素處理組中，斑馬魚未發(fā)生死亡及毒性反應(yīng)，而姜黃素濃度增加至7.500 和10.000 μmol·L－1時，可誘發(fā)斑馬魚死亡以及畸形，死亡率分別為（16.7±3.3）% 和（46.7±3.3）%。見圖5 和表1。根據(jù)上述實(shí)驗結(jié)果，將5.000 μmol·L－1作為最大安全濃度。選取0.625、1.250、2.500 和5.000 μmol·L－1姜黃素進(jìn)行后續(xù)試驗，用于評價姜黃素對鼻咽癌移植瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用。

表1 不同濃度姜黃素作用48 h 后斑馬魚死亡率和畸形數(shù)Tab.1 Rates of death and number of deformity of zebrafishes after treated with different concentrations of curcumin for 48 h(n=30，±s）

表1 不同濃度姜黃素作用48 h 后斑馬魚死亡率和畸形數(shù)Tab.1 Rates of death and number of deformity of zebrafishes after treated with different concentrations of curcumin for 48 h(n=30，±s）

Group Control Curcumin（μmol·L－1）0.625 1.250 2.500 5.000 7.500 10.000 Number of death 0 0 0 0 0 5±1 14±1 Rate of death (η/%)0 0 0 0 0 16.7±3.3 46.7±3.3 Number of deformity 0 0 0 0 0 6±1 11±2

圖5 不同濃度姜黃素作用后斑馬魚的畸形情況Fig.5 Malformation of zebrafishes after treated with different concentrations of curcumin

2.5 姜黃素干預(yù)后各組斑馬魚移植瘤熒光強(qiáng)度

姜黃素干預(yù)48 h 后，顯微鏡下觀察各組斑馬魚移植瘤熒光強(qiáng)度。與對照組（0 μmol·L－1組） 比較，0.625 和1.250 μmol·L－1姜黃素組斑馬魚移植瘤熒光強(qiáng)度有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），2.500 和5.000 μmol·L－1姜黃素組斑馬魚移植瘤熒光強(qiáng)度明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），且呈劑量依賴性。見圖6 和表2。

表2 姜黃素作用48 h 后各組斑馬魚移植瘤熒光強(qiáng)度Tab.2 Fluorescence intensities of transplanted tumor of zebrafishes in various groups after treated with curcumin for 48 h (n=30，±s，pixel×106）

表2 姜黃素作用48 h 后各組斑馬魚移植瘤熒光強(qiáng)度Tab.2 Fluorescence intensities of transplanted tumor of zebrafishes in various groups after treated with curcumin for 48 h (n=30，±s，pixel×106）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control Curcumin（μmol·L－1）0.625 1.250 2.500 5.000 Fluorescence intensity 24.351±0.298 24.187±0.660 24.356±0.752 22.510±0.211*18.844±0.154**

圖6 體式顯微鏡下觀察各組斑馬魚移植瘤的熒光強(qiáng)度Fig.6 Fluorescence intensities of transplanted tumor of zebrafishes in various groups

2.6 各組發(fā)生頭尾部轉(zhuǎn)移的斑馬魚數(shù)

與對照組比較，0.625、1.250和2.500 μmol·L－1姜黃素組發(fā)生頭尾部轉(zhuǎn)移的斑馬魚數(shù)有所減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），5.000 μmol·L－1姜黃素組發(fā)生頭尾部轉(zhuǎn)移的斑馬魚數(shù)明顯減少（P＜0.05）。見圖7。

圖7 各組斑馬魚移植瘤表現(xiàn)（A,B）和發(fā)生頭尾部轉(zhuǎn)移的斑馬魚數(shù)（C）Fig.7 Performance of transplanted tumor of zebrafishes (A,B) and number of zebrafishes with head and tail metastasis (C)after treated with different concentrations of curcumin

2.7 姜黃素作用后各組CNE-2 細(xì)胞增殖率

給藥24 h 后，對照組和10 及20 μmol·L－1姜黃素組CNE-2 細(xì)胞增殖率分別為100%、（80.8±1.0） % 和（63.8±2.7） % 。與對照組 比較，10 和20 μmol·L－1黃素組CNE-2 細(xì)胞增殖率明顯降低（P＜0.01），且呈劑量依賴性。

2.8 各組CNE-2 細(xì)胞遷移率

與對照組（93.7%±2.0%） 比較，10 和20 μmol·L－1姜黃素組細(xì)胞遷移率（87.9%±2.0%和 79.0%±3.0%） 明顯降低（P＜0.01） 。見圖8。

圖8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗檢測各組CNE-2 細(xì)胞遷移情況(×40)Fig.8 Cell migration of CNE-2 cells in various groups detected by wound healing assay(×40)

3 討 論

目前，斑馬魚疾病模型涉及廣泛，包括血液疾?。?0］、心血管疾?。?1］、癌癥［12］、骨骼疾?。?3］、代謝疾?。?4］和傳染?。?5］等?；诎唏R魚研究平臺，結(jié)合中醫(yī)藥優(yōu)勢和特色，中藥的活性篩選和毒性評價相關(guān)研究正逐漸深入［16］。LI 等［17］研究發(fā)現(xiàn)：補(bǔ)骨脂酚能夠降低斑馬魚異種移植中乳腺癌MCF-7細(xì)胞數(shù)量而死亡率并未升高。YANG 等［18］利用斑馬魚模型對西藏大戟化合物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：大戟化合物對人肺癌A549 細(xì)胞的生長表現(xiàn)出抑制作用和抗血管生成作用。GUO 等［19］建立乳腺癌異種移植瘤斑馬魚模型，檢測防己黃芪湯對異種腫瘤斑馬魚上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT） 生物標(biāo)志物表達(dá)的調(diào)控，結(jié)果顯示：防己黃芪湯可以明顯降低Snail 家族轉(zhuǎn)錄抑制因子2 （Snail family transcriptional repressor 2，Snail2）、鋅指E-box 結(jié)合同源框2 （zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2）、 Twist 家 族BHLH 轉(zhuǎn)錄因子1 （Twist family bhlh transcription factor 1，TWIST1） 和轉(zhuǎn)化生長因子β （transforming growth factor-β，TGF-β） 等的表達(dá)，并增加上皮鈣黏蛋白（epithelial cadherin，E-cadherin） 的表達(dá)，從而揭示了防己黃芪湯在體內(nèi)抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲的相關(guān)作用機(jī)制。ZHOU 等［20］證明：涼膈散在斑馬魚炎癥模型和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 刺激的RAW 264.7 細(xì)胞中具有抗炎活性，且與磷酸化c-Jun 氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK） 和磷酸化神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)的基因B （phosphorylated nerve growth factor-induced gene B，NGFI-B） 的抑制有關(guān)。

然而，斑馬魚模型也有一定的局限性［12，21］：與哺乳動物比較，斑馬魚特殊的給藥方式和藥物吸收方式會影響藥效學(xué)和藥動學(xué)評價；斑馬魚胚胎和幼魚體積較小，不易操作，且較難收集足夠的組織；異種胚胎保持在35 ℃時有利于斑馬魚的發(fā)育，但可能會對研究結(jié)果產(chǎn)生影響；斑馬魚研究方法和檢測指標(biāo)尚不完善，目前可用的實(shí)驗儀器和抗體較少。因此，必須進(jìn)一步推進(jìn)斑馬魚動物模型標(biāo)準(zhǔn)化，并結(jié)合CRISPR 基因編輯技術(shù)、新興成像技術(shù)和新的行為方法等前沿技術(shù)［22］，開展全面深入的分子機(jī)制研究，從而推動醫(yī)學(xué)對疾病的認(rèn)識和治療。

本研究構(gòu)建了斑馬魚鼻咽癌移植瘤模型，確定2.5 和5.0 μmol·L－1姜黃素作為干預(yù)模型的藥物濃度，證實(shí)了姜黃素對斑馬魚鼻咽癌移植瘤細(xì)胞增殖和遷移具有抑制作用，并在體外CNE-2 細(xì)胞中得到了一致的結(jié)論。本研究結(jié)果表明：姜黃素具有成為抗鼻咽癌藥物的潛能，同時斑馬魚移植瘤模型也可以成為鼻咽癌腫瘤研究和藥物評價的重要模型。未來本課題組將在基因和蛋白水平探討姜黃素體內(nèi)抗腫瘤的分子機(jī)制，為中藥抗腫瘤的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。