朱海，孫成松，汪奇志，呼明闖，章樂生，趙蕾，張世清

安徽省寄生蟲病防治研究所，安徽 合肥 230601

食源性寄生蟲病是指因生食或半生食含有感染期寄生蟲的食物而感染的寄生蟲病，其食物來源多半為肉類、魚類、淡水甲殼動物、螺類以及植物等[1]。隨著人們生活水平的提高及烹調(diào)方式的多元化，感染食源性寄生蟲的人數(shù)逐漸增加[2]。華支睪吸蟲是感染淡水魚類的主要致病性寄生蟲之一[3]，其成蟲寄生于人體肝膽管內(nèi)，可引起發(fā)熱、胃痛、腹脹、食欲不振、四肢無力及肝區(qū)痛等癥狀，嚴重時可導致肝硬化、腹水，甚至誘發(fā)膽管癌[4]。因此，按照國家食品安全風險監(jiān)測的有關要求，2019—2021年，安徽省寄生蟲病防治研究所對安徽省部分地區(qū)淡水魚華支睪吸蟲感染情況開展了調(diào)查，現(xiàn)將調(diào)查結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 采樣點選擇 根據(jù)2016—2020年安徽省土源性線蟲及華支睪吸蟲感染監(jiān)測情況[5]，選擇安徽省馬鞍山、宣城、淮南、淮北、阜陽和宿州6個市7個縣的20個鄉(xiāng)（鎮(zhèn)、街道辦事處）作為采樣點。

1.2 樣本采集

1.2.1 采樣環(huán)節(jié) 采樣環(huán)節(jié)包括養(yǎng)殖、流通及餐飲三個環(huán)節(jié)。其中，養(yǎng)殖環(huán)節(jié)主要是農(nóng)村的淡水魚養(yǎng)殖或野生魚塘，流通環(huán)節(jié)主要是城區(qū)帶有淡水魚零售的超市、農(nóng)貿(mào)市場、菜市場等，餐飲環(huán)節(jié)是不同檔次或種類的就餐場所。

1.2.2 采樣要求 在不同采樣環(huán)節(jié)，每個采樣地點每次采集中所獲得某一種淡水魚的總和即為1份樣本。每份淡水魚采樣量不低于500 g。

1.2.3 采樣時間 每年5月和8月各采集1次。

1.3 檢測方法 每份樣本進行消化后平分為2份，1份用于鏡檢法檢測，1份提取DNA采用聚合酶鏈式反應（PCR法）及環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP法）檢測。

1.3.1 樣本消化 配制人工消化液，胃蛋白酶（Solarbio，貨號：P8160）7.0 g，鹽酸（36.5%～38.0%）10 mL，NaCl 12 g，加蒸餾水至1 000 mL，振蕩混勻，放置15 min待用。將魚剖殺后，刮去鱗片與皮，剪取若干條魚的背鰭和尾鰭肌肉，稱量50 g，加入少許人工消化液，用組織搗碎機低速勻漿后，轉(zhuǎn)入500 mL燒杯中，按照1∶10比例添加人工消化液（每10 g樣品加入100 mL消化液），充分攪拌后，37℃放置12 h或過夜，使樣品充分消化。樣本完全消化后，棄去浮渣與上清液，將全部沉渣經(jīng)260目尼龍絹淘洗至水清，然后將沉渣轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中待檢。

1.3.2 鏡檢法 吸取消化所得沉渣，在體視鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)疑似囊蚴，吸取至載玻片上，于顯微鏡下進一步觀察，根據(jù)其囊蚴的長、短徑和囊壁厚度等形態(tài)學特征，鑒定囊蚴種屬。

1.3.3 PCR法

1.3.3.1 樣本DNA提取 用尼龍絹袋集卵法收集魚肉樣本沉渣，使用TIANamp Genomic DNA Kit（北京天根生化科技有限公司，編號：DP304）提取沉渣DNA，測定濃度后DNA樣本-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 引物設計 參考《魚華支睪吸蟲囊蚴鑒定方法》（SN/T 2975—2011）設計引物[6]，序列為CS1引物：5′-CGAGGGTCGGCTTATAAAC-3′；CS2引物：5′-GGAAAGTTAAGCACCGACC-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3.3 PCR擴增 反應總體系50μL，其中DNA模板5μL，20μmol/L引物（CS1/CS2）各0.1μL,10×PCR緩沖液5μL，MgCl2（25 mmol/L）5μL，dNTPs（25 mmol/L）1μL，Taq酶（5 U/μL）1μL。反應條件為94℃3 min，94℃40 s，62℃30 s，72℃30 s，共40個循環(huán)，最后72℃10 min，擴增產(chǎn)物4℃保存[7]。取6μL擴增產(chǎn)物和2μL樣本緩沖液在2%瓊脂糖平板上進行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察擴增產(chǎn)物并成像，目標產(chǎn)物長度為315 bp[8]。

1.3.4 LAMP法

1.3.4.1 樣本來源 LAMP法檢測所用樣本同樣為通過TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒提取的DNA樣本。

1.3.4.2 引物設計 根據(jù)華支睪吸蟲核糖體第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS2）基因序列設計引物體系，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成3對引物序列，分 別 為F3：TGCCTTATCCCGGGTACG；B3：AAACCCATGGCCGCAATA；FIP：GTGATCCACCGCTCAGAGTTGTACTGATAACGCCTCGGTCAT；BIP：CCGTGTGTCGATGAAGAGCGCATGCGTTC AAGATGTCGATGT；LF：CATCTCAATCAACTGGTAACCCAG；LB：TTAATGCGAACTGCATACTGCT[9]。

1.3.4.3 LAMP擴增 反應體系為25μL，反應條件為63～65℃，30～60 min。結(jié)果判斷：陽參出現(xiàn)顯色反應（反應管由黃色變?yōu)榫G色）后，80℃10 min終止反應，觀察其他標本是否有顯色反應[9]。

1.4 結(jié)果判定 消化鏡檢法、PCR法、LAMP法任意一種檢測陽性即判定為陽性樣本。

2 結(jié)果

2.1 淡水魚樣本采集情況

2.1.1 采樣點分布 2019—2021年共對39個淡水魚華支睪吸蟲采樣點開展了調(diào)查。其中，2019年宿州市靈璧縣采樣點4個、馬鞍山市和縣11個；2020年馬鞍山市當涂縣3個、宣城市涇縣3個、淮南市壽縣6個、阜陽市太和縣6個；2021年淮北市濉溪縣6個。

2.1.2 樣本種類及數(shù)量 2019—2021年分別采集了98、137、63份淡水魚樣本，共298份、51種。采集淡水魚種類主要為黑魚（27份，占9.06%）、鰱魚（25份，占8.39%）、麥穗魚（24份，占8.05%）、鳙魚（24份，占8.05%）、草魚（24份，占8.05%）、鳑鲏（23份，占7.72%）、黃顙魚（23份，占7.72%）、餐條（22份，占7.38%）、棒花魚（19份，占6.38%）、鯽魚（19份，占6.38%）、鰍魚（16份，占5.37%）、蝦虎魚（12份，占4.03%），其他不常見魚種42份（占14.09%）。

2.1.3 各采樣環(huán)節(jié)樣本構(gòu)成 養(yǎng)殖、流通和餐飲環(huán)節(jié)采樣點數(shù)分別占35.90%（14/39）、35.90%（14/39）、28.21%（11/39）；采樣份數(shù)分別占34.90%（104/298）、42.95%（128/298）和22.15%（66/298）。

2.2 淡水魚華支睪吸蟲檢出情況 2019—2021年安徽省淡水魚華支睪吸蟲陽性份數(shù)檢出率分別為8.16%（8/98）、3.65%（5/137）、7.93%（5/63），總陽性份數(shù)檢出率為6.04%（18/298），見表1。2019—2021年消化鏡檢法陽性份數(shù)檢出率為4.70%（14/298），PCR法和LAMP法檢測出的陽性份數(shù)檢出率均為6.04%（18/298）。消化鏡檢法檢測為陽性的樣本PCR法及LAMP法檢測均為陽性，PCR法和LAMP法檢測結(jié)果具有一致性，且通過雙向測序驗證確為華支睪吸蟲DNA序列。

表1 不同檢測方法華支睪吸蟲檢出情況

2.2.1 地區(qū)分布 2019—2021年安徽省調(diào)查的7個縣中有6個縣淡水魚樣本檢出華支睪吸蟲，39個采樣點中有12個檢出華支睪吸蟲，各地淡水魚華支睪吸蟲檢出情況見表2。

表2 不同調(diào)查地點淡水魚華支睪吸蟲檢出情況

2.2.2 不同采樣環(huán)節(jié)華支睪吸蟲檢出情況 養(yǎng)殖、流通及餐飲環(huán)節(jié)淡水魚樣本均檢測出華支睪吸蟲，陽性份數(shù)檢出率分別為5.77%（6/104）、7.81%（10/128）、3.03%（2/66），三個采樣環(huán)節(jié)間陽性份數(shù)檢出率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.775，P＞0.05），見表3。

表3 不同采樣環(huán)節(jié)淡水魚華支睪吸蟲檢出情況

2.2.3 不同魚種華支睪吸蟲檢出情況 檢出華支睪吸蟲的淡水魚有6種，分別為麥穗魚、餐條、棒花魚、蝦虎魚、鳑鲏、草魚，見表4。麥穗魚、餐條、棒花魚等小型魚種共采樣140份，陽性17份，陽性份數(shù)檢出率為12.14%；其他大型魚種采樣158份，陽性1份，陽性份數(shù)檢出率為0.60%，兩者陽性份數(shù)檢出率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=17.327，P＜0.05）。

表4 不同淡水魚種華支睪吸蟲檢出情況

3 討論

華支睪吸蟲病是我國流行較為嚴重的食源性寄生蟲病之一，90%以上的華支睪吸蟲感染者分布于廣東、廣西、黑龍江和吉林等省份[10-11]。安徽省是我國華支睪吸蟲感染率相對偏低的省份，2015年第三次全國人體重點寄生蟲病調(diào)查結(jié)果顯示全省華支睪吸蟲感染率為0.01%[10]，2016—2020年安徽省人體華支睪吸蟲感染監(jiān)測結(jié)果顯示全省5年總感染率為0.04%[5]。

華支睪吸蟲病的防治不僅需要對人群感染情況進行監(jiān)測，還需要加強對其中間宿主感染情況的監(jiān)測。2019—2021年安徽省淡水魚寄生蟲感染監(jiān)測結(jié)果顯示，安徽省淡水魚華支睪吸蟲陽性份數(shù)檢出率為6.04%。安徽省的調(diào)查覆蓋了養(yǎng)殖、流通及餐飲多個環(huán)節(jié)，并采用病原學與分子生物學進行平行檢測。本研究采用了LAMP檢測方法[9]，并將其與消化鏡檢法及PCR方法結(jié)合用于現(xiàn)場平行檢測。這種檢測方法，不僅克服了消化鏡檢法中形態(tài)學特征不易判定，容易漏檢的缺點；又彌補了PCR方法中樣本DNA濃度可能達不到檢測要求的不足[12]。在今后的淡水魚華支睪吸蟲監(jiān)測工作中，可將LAMP法作為常規(guī)消化鏡檢法的重要補充，以滿足淡水魚華支睪吸蟲感染情況監(jiān)測工作的要求[13]，提高華支睪吸蟲的檢出率。

本調(diào)查顯示，7個縣中6個縣存在淡水魚華支睪吸蟲感染，其中以當涂縣淡水魚的陽性占比最高，這可能與該縣的淡水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達有關。在本次采樣過程中，養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的采樣點多選擇野生或半野生環(huán)境的養(yǎng)殖水面，流通及餐飲環(huán)節(jié)的采樣點則多選擇與養(yǎng)殖環(huán)節(jié)采樣點存在供應關系的農(nóng)貿(mào)市場和餐飲點，這可能是各環(huán)節(jié)均檢出華支睪吸蟲的原因之一。在采集到的51個魚種中，共有6種魚存在華支睪吸蟲感染，除在壽縣捕獲的草魚為大型魚種外，其余都是麥穗魚、棒花魚等小型魚種，其中麥穗魚的陽性份數(shù)檢出率高達33.33%，這可能與小型魚種的主要棲息區(qū)域更靠近華支睪吸蟲中間宿主淡水螺的孳生區(qū)域，更易受華支睪吸蟲尾蚴感染有關。

盡管安徽省不是我國華支睪吸蟲病高度流行區(qū)，但監(jiān)測結(jié)果顯示目前安徽省部分地區(qū)淡水魚華支睪吸蟲感染情況仍處于較高水平，并具有點多面廣的特征，提示人群感染華支睪吸蟲的風險較大。因此，應重視魚源性寄生蟲病的防控工作，加強對野生魚塘的管理，以及淡水魚養(yǎng)殖及流通環(huán)節(jié)管理，做好淡水魚溯源及檢測。同時，還需加強食品安全的宣傳教育，促進人群養(yǎng)成良好的飲食習慣。此外，還需進一步加大監(jiān)測范圍，為安徽省華支睪吸蟲病等魚源性寄生蟲病的防控提供依據(jù)。