謝月樵， 郭丹， 王楠， 尤娜， 黃琬玲， 馬小彤

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所），北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，實驗血液學(xué)國家重點實驗室，國家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，細(xì)胞生態(tài)海河實驗室，天津300020

實體腫瘤的進(jìn)展過程中一般伴隨血管新生，以滿足腫瘤生長的需求。因此，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移速度會間接決定腫瘤的生長速度，同時新生血管也是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至其他組織的重要途徑。腫瘤血管新生的程度可作為腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)[1-2]?？寡苌梢仓饾u成為臨床上腫瘤治療的新途徑[3]。

TWIST1在生物進(jìn)化過程中高度保守，是影響胚胎發(fā)育和腫瘤生成的重要轉(zhuǎn)錄因子[4-5]。TWIST1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，降低腫瘤細(xì)胞凋亡和藥物敏感性[6-7]，此外，TWIST1與腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲和浸潤能力也密切相關(guān)[6,8-10]，是誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，而EMT 是癌癥轉(zhuǎn)移起始的關(guān)鍵過程[11]。

研究表明，TWIST1高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤血管的形成[11]。在乳腺癌和肝癌細(xì)胞中TWIST1 的高表達(dá)被證明是血管形成的關(guān)鍵因素[12-13]；腫瘤細(xì)胞中凝血酶促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，基質(zhì)小管和腫瘤血管的形成也與TWIST1 上調(diào)表達(dá)相關(guān)[14]；此外，TWIST1 還通過激活Jagged-1 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化，促進(jìn)血管擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）生成[15]。

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，TWIST1 與血管內(nèi)皮細(xì)胞密切相關(guān)。在斑馬魚的胚胎脈管系統(tǒng)、豬的動脈內(nèi)皮以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中均有 TWIST1 的表達(dá)[16]。有報道指出，TWIST1 可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞中Tie2的轉(zhuǎn)錄控制小鼠肺血管的通透性[17]，還可通過改變血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular growth factor receptor 2，VEGFR2）的表達(dá)控制新生小鼠的視網(wǎng)膜血管生成[18]。VEGF 和VEGFR 在早期胚胎血管發(fā)育以及后期新生血管形成中均具有關(guān)鍵作用[19]，且VEGF-VEGFR2 是調(diào)控血管通透性的重要信號通路。有研究發(fā)現(xiàn)vegfr2突變體小鼠腫瘤內(nèi)的血管通透性明顯降低，對化療的敏感性增加，且腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散也受到抑制[20]。

HUVECs 常被作為體外實驗的細(xì)胞模型，用于研究內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特性及其與各種疾病的關(guān)系。但目前TWIST1 對HUVECs 的功能是否具有調(diào)控作用，以及是否能影響VEGFR2 的表達(dá)尚不明確。本研究旨在探究TWIST1在HUVECs增殖、遷移和體外血管生成中的作用，以及其與VEGFR2表達(dá)間的關(guān)系，以期為進(jìn)一步揭示TWIST1與腫瘤血管新生和遷移的關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮臍帶由天津中心婦產(chǎn)醫(yī)院提供，293T 細(xì)胞系均由本實驗室保存。pLL3.7-shTwist1-GFP和pLL3.7-shCtrl-GFP 質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建、鑒定并保存[21]。

內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基購自美國Sciencell 公司；FBS、RPMI 1640 均購自美國 GIBCO 公司；MatrigelTMMatrix 購自美國 Corning 公司；RNA 小量提取試劑盒（RNeasy Mini Kit）購自Qiagen 公司；SYBR green PCR 試劑盒購自日本TaKaRa 公司；AnnexinV/7AAD 細(xì)胞凋亡試劑盒購自美國BD 公司；LipofectamineTM2000、OPTI-MEM、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司。StepOnePlus/7500 Realtime PCR 儀購自美國 Applied Biosystems 公司；LSRII 流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自德國Thermo Fisher Scientific 公司；TE2000-S熒光倒置顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞提取與培養(yǎng) 無菌條件下，用預(yù)熱PBS 徹底清洗臍帶。0.25%的胰酶/EDTA 充盈整根臍帶，37 ℃消化15 min 后收集細(xì)胞，用含血清的完全培養(yǎng)基輕輕吹打混勻，接種至25T 塑料培養(yǎng)瓶中，37 ℃5% CO2的孵箱培養(yǎng)24 h 后更換為內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基。換液間隔為2～3 d，觀察待細(xì)胞融合后，以1∶3的比例消化傳代，選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 病毒的制備和感染 將載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒通過脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，包裝慢病毒。分別于48、72 h 后收集病毒上清并濃縮，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs，選用第 2～3 代，以每孔 2×105個接種于6 孔板，待細(xì)胞生長過夜，用有靶向人TWIST1基因shRNA（pLL3.7-shTwist1-GFP）的慢病毒液感染試驗組細(xì)胞，同時以攜帶Scramble shRNA 的慢病毒（pLL3.7-shCtrl-GFP）感染對照組細(xì)胞，37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。感染72 h 后，用流式細(xì)胞儀檢測GFP+細(xì)胞的比例即為感染效率（試驗組和對照組細(xì)胞感染效率均為80%以上）。

1.2.3 qRT-PCR 檢 測 TWIST1 及VEGFR2基 因 的表達(dá) 流式細(xì)胞儀分選pLL3.7-shTwist1-GFP 和pLL3.7-shCtrl-GFP 感染后的 GFP+細(xì)胞，用 RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞mRNA，步驟按說明書進(jìn)行。將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照SYBR PCR Master Mix說明書配置10 μL的混合液體系進(jìn)行qPCR反應(yīng)。以 Actin 為內(nèi)參，采用 2－ΔΔCt法計算TWIST1和VEGFR2的mRNA 相對表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequence of primer in PCR

1.2.4 細(xì)胞計數(shù)法測定HUVECs 細(xì)胞增殖活性取處于對數(shù)生長期的HUVECs-shCtrl 和HUVECsshTwist1細(xì)胞，調(diào)整至合適濃度（1×104cells·mL-1），混合均勻后分別以500 μL·孔-1接種至24 孔板。37℃5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔24 h 兩組各取3個復(fù)孔進(jìn)行消化計數(shù)，取平均值，并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.5 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力 將試驗組和對照組細(xì)胞以合適濃度（2×105個·mL-1）接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度超過80%時，用200 μL 吸頭垂直細(xì)胞平面，作出一條平整均勻的劃痕，使用無菌PBS 洗掉脫落的細(xì)胞，更換新鮮不含血清的培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h 后于顯微鏡下記錄劃痕的寬度，計算方式如公式（1）所示。

1.2.6 小管形成實驗檢測HUVECs 血管形成能力 提前在4 ℃冰箱將基質(zhì)膠解凍過夜，并將所有塑料制品提前冷卻。用無血清培養(yǎng)基將基質(zhì)膠稀釋后，以每孔250 μL 加入提前冷卻好的24孔板中。37 ℃培養(yǎng)箱放置1 h，待基質(zhì)膠固化后備用。將試驗組、對照組細(xì)胞以每孔2×105個接種于基質(zhì)膠表面。孵箱中培養(yǎng)24 h 后，用倒置顯微鏡（×100）拍照記錄。每組細(xì)胞各取3 個視野，記錄總小管分支長度和毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成數(shù)。

1.2.7 Annexin V/7AAD 染色檢測細(xì)胞凋亡 在病毒感染后，取試驗組、對照組細(xì)胞各1×106個，離心后棄上清，用Annexin V-APC/7AAD 進(jìn)行雙染色，1 h內(nèi)上機(jī)檢測，比較兩組細(xì)胞的凋亡比例。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行繪圖，SPSS 24.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 shCtrl 和shTwist1 慢病毒載體感染HUVECs結(jié)果分析

經(jīng) 293T 細(xì)胞包裝后的 shCtrl 和 shTwist1 慢病毒載體感染72 h 后，倒置熒光顯微鏡檢測表明，HUVECs-shCtrl 和 HUVECs-shTwist1 絕大 多 數(shù)細(xì)胞均帶有GFP 標(biāo)記的綠色熒光，表明pLL3.7-shC-trl-GFP和pLL3.7-shTwist1-GFP成功感染HUVECs細(xì)胞（圖1）。對照組和試驗組細(xì)胞中GFP+細(xì)胞占比分別為81%±2.8%和82%±1.4%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 感染72 h后對照組和試驗組HUVECs光鏡和熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果Fig.1 The observation results of HUVECs in the control group and the experimental group under light microscope and fluorescence microscope after 72 hours infection

2.2 感染敲降載體pLL3.7-shTwist1-GFP對HUVECs中TWIST1 mRNA表達(dá)水平的影響

qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，試驗組細(xì)胞TWIST1的表達(dá)水平是對照組的30%（圖2），表明感染pLL3.7-shTwist1-GFP使HUVECs中TWIST1mRNA的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01），提示試驗組的TWIST1成功敲低。

圖2 試驗組和對照組HUVECs中TWIST1 mRNA水平比較Fig.2 Comparison of TWIST1 mRNA levels in HUVECs between experimental group and control group

2.3 TWIST1 表達(dá)對 HUVECs 細(xì)胞增殖、凋亡的影響

通過細(xì)胞計數(shù)法，繪制對照組和試驗組的細(xì)胞生長曲線（圖3A）。結(jié)果顯示，與對照組相比，試驗組生長速度明顯減慢（P＜0.01）。Annexin V/7AAD 檢測凋亡發(fā)現(xiàn)試驗組細(xì)胞凋亡比例顯著高于對照組（P＜0.05）（圖3B），提示TWIST1 表達(dá)降低會抑制HUVECs細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖3 HUVECs生長曲線和凋亡率Fig.3 Growth curve and apoptosis rate of HUVECs

2.4 TWIST1 表達(dá)下降對HUVECs 細(xì)胞遷移的影響

HUVECs 細(xì)胞劃痕實驗表明，劃痕后24 h，試驗組細(xì)胞劃痕愈合率明顯低于對照組（P＜0.01）（圖4），表明TWIST1 表達(dá)下降明顯抑制了HUVECs細(xì)胞的遷移能力。

圖4 HUVECs細(xì)胞劃痕實驗和劃痕愈合率Fig.4 Scratch test and scratch healing rate of HUVECs cells

2.5 TWIST1 表達(dá)下降對HUVECs 血管樣結(jié)構(gòu)形成的影響

體外小管形成實驗表明，與對照組相比，試驗組HUVECs 在體外形成的血管樣結(jié)構(gòu)明顯減少（P＜0.01），試驗組總小管分支長度也顯著短于對照組（P＜0.01）（圖5），表明TWIST1基因沉默抑制HUVECs細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖5 HUVECS血管樣結(jié)構(gòu)、總小管分支長度和毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)數(shù)Fig.5 Vascular-like structure of HUVECs,total tubular branch length and capillary like structure number

2.6 TWIST1敲降對HUVECs中VEGFR2 mRNA水平的影響

如圖6所示，試驗組VEGFR2mRNA水平顯著低于對照組（P＜0.01），提示TWIST1基因下調(diào)抑制了HUVEC中VEGFR2的表達(dá)。

圖6 試驗組和對照組HUVECs中VEGFR2 mRNA水平比較Fig.6 Comparison of VEGFR2 mRNA levels in HUVECs between experimental group and control group

3 討論

腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及侵襲依賴于血管新生，在該過程中，腫瘤細(xì)胞可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榭焖僭鲋碃顟B(tài)，且多以發(fā)芽的方式生成新的毛細(xì)血管，并可以在短時間內(nèi)建立血流供應(yīng)。若失去血管新生的能力，大多數(shù)實體瘤將停止生長，進(jìn)入休眠狀態(tài)[22]。因此，探索調(diào)節(jié)腫瘤血管形成能力的新基因和機(jī)制，已成為抗腫瘤血管新生治療領(lǐng)域的熱點[23]。

在脊椎動物中，TWIST1 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤轉(zhuǎn)移，在各種上皮來源的惡性腫瘤[9,24-26]、肉瘤[27]、黑色素瘤[28]和神經(jīng)膠質(zhì)瘤[29]中均可檢測到TWIST1 的表達(dá)，并且TWIST1 常與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[30]。新生血管也是介導(dǎo)大多數(shù)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的重要途徑。已有報道表明血管內(nèi)皮細(xì)胞中TWIST1 呈高表達(dá)[16-17,31]，提示TWIST1 可能與腫瘤中的血管生成密切相關(guān)。

本研究采用慢病毒載體pLL3.7-shTwist1感染HUVECs 敲降 TWIST1 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) TWIST1 表達(dá)下降能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Valsesia-wittmann 等[32]研究表明 TWIST1 過表達(dá)可使神經(jīng)母細(xì)胞瘤參與凋亡反應(yīng)的ARF/p53通路受到抑制。TWIST1 抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制尚有待后續(xù)試驗闡明。血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移是新生血管形成的基礎(chǔ)。本研究中敲降TWIST1后，明顯抑制了HUVECs 的遷移能力。E-鈣粘素是一種重要的細(xì)胞粘附分子，與細(xì)胞遷移能力密切相關(guān)。有研究報道，TWIST1可以直接與E-鈣粘素啟動子結(jié)合，抑制E-鈣粘素基因的表達(dá)[33]，顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的運(yùn)動能力和侵襲性[34]。在HUVECs中，TWIST1是否通過E-鈣粘素促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移還需要進(jìn)一步研究。VEGF和VEGFR在生理、病理條件下的血管生成中發(fā)揮重要作用[35]。其中，VEGFR2 是導(dǎo)致腫瘤血管生成最重要的通路之一，目前臨床上有多種靶向VEGFVEGFR2 通路的抗體，已廣泛用于癌癥治療[36]。有報道指出VEGFR2 的啟動子區(qū)存在能結(jié)合TWIST1 的 E-box 結(jié)構(gòu)域[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，VEGFR2mRNA 水平隨著TWIST1 的表達(dá)下降而顯著降低，表明TWIST1可能通過調(diào)控VEGFR2的表達(dá)影響血管生成。同時，通過檢測TWIST1 與多種腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特征的關(guān)系，均證實TWIST1具有促進(jìn)作用，提示其可能參與腫瘤血管新生和轉(zhuǎn)移行為。但本研究采用的模式細(xì)胞體外模型仍存在一定的局限性，TWIST1如何影響各類腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞功能，未來還需進(jìn)一步體內(nèi)試驗證實。

綜上所述，TWIST1在血管內(nèi)皮細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用，本研究為進(jìn)一步研究其在腫瘤血管新生中的作用奠定了理論基礎(chǔ)，也為腫瘤的抗血管生成治療提供了新的思路。