李文桂， 陳雅棠

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院傳染病寄生蟲病研究所，重慶400016

金絲雀痘病毒（canarypox virus，CNPV）感染是造成雀痘的主要病因，可通過接種CNPV 的減毒株ALVAC 進(jìn)行免疫。目的基因常見轉(zhuǎn)移載體為pALVAC，一般含有病毒的左右邊界序列（R/L）、合成的牛痘病毒早期/晚期啟動(dòng)子（pEL）、多克隆位點(diǎn)（MCS）、受牛痘病毒H6基因啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的LacZ基因（H6-LacZ）或受牛痘病毒 H6 基因啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的uidA基因（H6-uidA）[1]。ALVAC 的基因組含有大量的復(fù)制非必需區(qū)，將大于30 kb的外源基因插入該區(qū)并不影響該病毒的感染性，因此，可改造為疫苗載體，且ALVAC減毒株僅在禽類細(xì)胞中復(fù)制，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中并不復(fù)制，但能表達(dá)外源基因，誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫應(yīng)答[2]。將目的基因插入轉(zhuǎn)移載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒與ALVAC 的基因組進(jìn)行基因交換，從而獲得重組病毒，通過篩選培養(yǎng)、分離純化即可用于免疫接種。

已有研究構(gòu)建了大量CNPV 載體介導(dǎo)的病原體疫苗，通過肌肉注射、皮下注射或腹腔注射等途徑接種小鼠、猩猩、狒狒、猿猴或健康志愿者后均可誘導(dǎo)細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答（表1）。目前以CNPV 為載體的病原體疫苗包括：馬流感病毒（equine influenza virus，EIV）、犬瘟熱病毒（canine distemper virus，CDV）、麻疹病毒（measles virus，MV）、尼帕病毒（Nipah virus，NiV）、艾滋病毒（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）、非洲馬病病毒4 型（African horse sickness virus type 4，AHSV-4）、藍(lán)舌病毒17 型（bluetongue virus serotype 17，BTV-17）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、巨細(xì)胞病毒（cytomelovirus，CMV）、狂犬病毒（rabies virus）和嬰兒利什曼原蟲（Leishmania infantum）等。本文概述了CNPV 載體介導(dǎo)的病原體疫苗的構(gòu)建及其保護(hù)性免疫機(jī)制等方面的研制現(xiàn)狀，旨在為病毒和寄生蟲病的免疫預(yù)防提供參考。

表1 重組CNPV疫苗誘導(dǎo)的抗病毒和寄生蟲免疫應(yīng)答特征Table 1 Characteristic of immune response induced by recombinant CNPV-vectered vaccines against viruses and parasite

1 已成功構(gòu)建的重組CNPV病毒

1.1 正粘病毒

1.1.1 馬流感病毒 馬流感病毒感染可導(dǎo)致馬呼吸道感染，注射重組血凝素（hemagglutinin，HA）蛋白的兒馬可對(duì)抗H3N8 株，提示HA 是一種候選分子。為研制重組CNPV、提取EIV 的總RNA 作為模板擴(kuò)增HA基因，插入pALVAC 得到pALVAC-HA，將其轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞（chicken embryo fibroblast，CEF），并進(jìn)行篩選和培養(yǎng)，Western blot 方法顯示患者血清可結(jié)合重組病毒表達(dá)的60 kD 的HA 蛋白。同時(shí)通過肌肉注射將105.6半數(shù)組織細(xì)胞感染量（50% tissue cell infective dose，TCID50）重組病毒免疫Welsh 矮種馬，初次注射后5周重復(fù)1次，在初次注射后7周血清的中和抗體明顯升高，此時(shí)采用肌肉注射的方法將107.6半數(shù)雞胚感染量（50% egg infectious dose，EID50）馬流感病毒A 株進(jìn)行攻擊，在攻擊后2 周發(fā)現(xiàn)接種組鼻咽拭子的病毒負(fù)荷明顯降低。此外，rCNPV-HA 疫苗接種于兒馬或狗中均可產(chǎn)生中和抗體，并可對(duì)抗馬流感病毒有毒株的攻擊[3-6]。

1.1.2 禽流感病毒 禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）是爆發(fā)禽流感的主要病因。HA 蛋白是病毒表面的主要抗原，HA 的核酸疫苗免疫宿主可誘導(dǎo)中和性抗體的出現(xiàn)。2010 年，有研究者[7]將 107.2CCID50的 rCNPV-HA 疫苗皮下注射幼貓，并在第一次注射后3 周加強(qiáng)1 次，第1 次注射后10 周發(fā)現(xiàn)血清的中和抗體提升，此時(shí)通過霧化吸入將105CCID50的H5N1 株進(jìn)行感染攻擊，在攻擊后2 周提示接種組鼻咽拭子和肺組織的病毒負(fù)荷明顯降低。

1.2 副粘病毒

1.2.1 犬瘟熱病毒 犬瘟熱病毒感染可導(dǎo)致犬瘟熱。研究發(fā)現(xiàn)重組糖蛋白H 在病毒的融合、生長(zhǎng)和細(xì)胞嗜性等方面發(fā)揮作用。為驗(yàn)證rCNPV-H疫苗的免疫效率，首先將106.8TCID50的rCNPV-H疫苗分別皮下注射狐貍（Vulpes zerda）和筆尾獴（Suricata suricatta），在第 1 次注射后 3 周加強(qiáng) 1次，結(jié)果顯示，血清IgG 在第1 次注射后6 周達(dá)到較高水平。有研究者將rCNPV-H 疫苗接種大熊貓（Ailuropoda melanoleuca），也得到類似的結(jié)果[8-9]。

1.2.2 麻疹病毒 麻疹病毒感染是麻疹的主要病因，將含有HA 和融合蛋白（fusion protein，F(xiàn)）的DNA 疫苗接種于小鼠可產(chǎn)生高滴度的中和抗體。1992 年，有研究者[10]將麻疹病毒的F/HA基因片斷插入pUC19 的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19-F/HA，并與pSPMF75 重組得到pSPMF-F/HA，轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞株，篩選重組病毒，Western blot提示患者血清結(jié)合rCNPV-F/HA 中的F抗原和HA抗原。保護(hù)力試驗(yàn)表明，將1×108噬菌斑形成單位（plaque forming unit，PFU）的rCNPV-F/HA 皮下注射畢格犬，注射后5 周血清中的中和抗體明顯升高，此時(shí)用104TCID50犬瘟熱病毒的SH 株進(jìn)行攻擊，在攻擊后10 d 發(fā)現(xiàn)血清中的病毒負(fù)荷有一定程度的降低。

1.2.3 尼帕病毒 尼帕病毒感染可引起尼帕病毒性腦炎，研究發(fā)現(xiàn)其基因組中的F基因編碼融合蛋白，該蛋白可與糖蛋白（glycoprotein，G）共同作用，誘導(dǎo)病毒囊膜和細(xì)胞膜發(fā)生融合，具有較好的免疫原性。有研究者以NiV 的基因組DNA 為模板擴(kuò)增F基因，插入 pALVAC 得到 pALVAC-F，轉(zhuǎn)化BHK-21細(xì)胞株，挑選rCNPV-G重組病毒，Western blot 結(jié)果表明 rCNPV-G 中的 60 kD F 抗原可與患者的血清反應(yīng)。同時(shí)將108PFU 重組病毒通過肌肉注射于仔豬體內(nèi)，并在第1次接種后2周再重復(fù) 1 次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在第 1 次接種后 4 周血清 IgG 和中和抗體明顯升高，滴度分別為1∶1 280 和1∶2 560，此時(shí)用2.5×105PFU尼帕病毒的有毒株進(jìn)行滴鼻攻擊，在攻擊后6 d發(fā)現(xiàn)接種組腦和肺的病變明顯減輕，且鼻咽拭子未檢查出病毒負(fù)荷[11]。

1.2.4 亨得拉病毒（Hendra virus，HeV） HeV 可感染馬、豬等哺乳動(dòng)物，主要引起急性呼吸道感染或腦炎。提取HeV 的總RNA 作為模板擴(kuò)增G/F基因，插入 pALVAC 得到 pALVAC-G/F，轉(zhuǎn)化BHK-21 細(xì)胞株，挑選重組病毒，免疫熒光結(jié)果表明rCNPV-G 可以表達(dá)融合蛋白，提示成功構(gòu)建了重組CNPV 疫苗。保護(hù)力試驗(yàn)表明，將105.4和107.4PFU 重組病毒分別皮下注射倉(cāng)鼠，在初次免疫后3 周進(jìn)行加強(qiáng)，在初次免疫后6 周提示血清IgG 和中和抗體有一定程度的提升，此時(shí)采用腹腔注射將104PFU 的HeV 進(jìn)行攻擊感染，在攻擊感染后4周計(jì)算105.4PFU接種組、107.4PFU接種組和對(duì)照組的存活率，結(jié)果分別為54%（5/9）、100%（9/9）和0%（0/9）[12]。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒

1.3.1 艾滋病毒 艾滋病毒感染可導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合征。該病毒的env基因編碼前體蛋白gp160，gp160 可分解為 gp120 和 gp41。Cox 等[13]采用靜脈注射的方法將5×107PFU的重組CNPV-env疫苗接種于BALB/c 鼠，并在第1 次接種后4 周重復(fù) 1 次。結(jié)果表明，血清 IgG 在第 1 次注射后 6 周達(dá)到較高水平，脾CTL反應(yīng)在第1次注射后2周達(dá)到較高水平。

有研究表明，CD40 配體（CD40L）與 CD40 相互作用，可促進(jìn)T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的成熟，進(jìn)而促進(jìn)免疫應(yīng)答[14]。2008年，有研究者首先將 107PFU 的 rCNPV-CD40L 和 107PFU 的rCNPV-env 疫苗混合后，通過肌肉注射免疫BALB/c 鼠，并在初次注射后2、4周重復(fù)2次，結(jié)果表明在初次注射后10 周血清IgG 的滴度明顯提升，脾細(xì)胞發(fā)生增殖，并分泌高水平INF-γ、IL-4等細(xì)胞因子，流式細(xì)胞儀證實(shí)脾IFN-γ+CD8+T 細(xì)胞數(shù)增加，隨后通過肌肉注射將105.8TCID50的rCNPV-env 疫苗接種健康志愿者，在初次注射后1、3 和6 個(gè)月重復(fù)3 次，發(fā)現(xiàn)血清的中和抗體滴度在初次注射后182～546 d 明顯提升，且在初次注射后378 d 提升最明顯[15]。外周血單核細(xì)胞的CTL 反應(yīng)在初次注射后42～728 d明顯增強(qiáng)，并在初次注射后182 d 達(dá)到較高水平[16]。2009 年和2015 年，Kim 等[17]先后在泰國(guó)進(jìn)行了Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗(yàn)，結(jié)果表明重組CNPV-env疫苗初次免疫和gp120蛋白加強(qiáng)方案的有效率僅為31.2%，表明該疫苗的免疫效果有待進(jìn)一步提升。

HIV-1 的gag基因編碼核衣殼蛋白 P24、P7 和內(nèi)膜蛋白P14。2002 年，有研究者將107TCID50的rCNPV-gag 疫苗和 50 μg 的重組 GP160 蛋白通過肌肉注射接種14 例AIDS 患者，并在初次接種后1、3 和 6 月重復(fù) 3 次，結(jié)果表明在初次接種后 7 個(gè)月，92.86%（13/14）的患者血清 IgG 滴度明顯提升，流式細(xì)胞儀證實(shí)64.29%（9/14）患者的外周血單核細(xì)胞IFN-γ+CD8+T 細(xì)胞數(shù)目增加。隨后在2005 年，研究者將 106.08TCID50的 rCNPV-gag 疫苗肌肉注射326 例AIDS 患兒，并在初次注射后4、8和12周重復(fù)3次，結(jié)果顯示，患兒外周血單核細(xì)胞的CTL 反應(yīng)在第1 次注射后6～104 周增強(qiáng)，并在初次注射后14周達(dá)較高水平[18-19]。

1.3.2 猴艾滋病毒（simian immunodeficiency virus，SIV） 猴艾滋病毒感染是猴免疫缺陷病的主要病因。2010 年，有研究者進(jìn)行了一項(xiàng)將108PFU rCNPV-env 疫苗肌肉注射恒河猴（Macaca mulatta）的試驗(yàn)，結(jié)果表明在注射后2 周血清IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-15、IL17、TGF-β 等細(xì)胞因子表達(dá)水平明顯升高[20]。

1.3.3 貓白血病病毒（feline leukemia virus，F(xiàn)elv） 貓白血病病毒感染可導(dǎo)致貓白血病，為了構(gòu)建表達(dá)ENV 蛋白的重組CNPV 病毒，提取Felv的總 RNA 為模板擴(kuò)增env基因，插入 pALVAC 得到pALVAC-env，轉(zhuǎn)染CEF 細(xì)胞株，進(jìn)行篩選和培養(yǎng)，免疫印跡提示患者血清識(shí)別重組病毒表達(dá)的70 kD 的 E2 蛋白和 63 kD 的 GAG 蛋白；保護(hù)力試驗(yàn)表明，借助皮下注射將108PFU重組病毒接種仔貓，并在初次接種后3 周重復(fù)1 次，在初次接種后5 周用 2×106PFU 貓白血病病毒 Glasgow 株進(jìn)行口服加滴鼻攻擊，結(jié)果表明在攻擊后12 周血清中的中和抗體明顯升高，血清中的病毒負(fù)荷明顯降低。當(dāng)將重組病毒接種仔豬或仔貓時(shí)，也可得到類似結(jié)果[21-24]。

1.4 雙鏈RNA病毒

1.4.1 非洲馬病病毒4 型 非洲馬病病毒4 型感染是非洲馬病的主要病因之一，外殼蛋白的主要成分VP2 和VP5 蛋白是兩種較好的保護(hù)性抗原。2009 年，有研究者提取 AHSV-4 的總 RNA 為模板擴(kuò)增VP2/VP5基因，并插入 pALVAC 得到pALVAC-VP2/VP5，轉(zhuǎn)染 BHK-21 細(xì)胞株，挑選陽性病毒，免疫熒光檢測(cè)提示陽性病毒可表達(dá)融合蛋白。隨后，將107.1TCID50重組病毒肌肉注射Boerperd 馬，并在初次接種后 4 周重復(fù) 1 次，結(jié)果表明在初次接種后8 周血清中的中和抗體明顯提升，滴度為1∶20～1∶40，此時(shí)靜脈注射105.5TCID50非洲馬病病毒4型的有毒株進(jìn)行攻擊，在攻擊后2周提示血清的病毒負(fù)荷降低。然后將重組病毒接種 Welsh 馬，在第 1 次注射后 8 周提示血清 IgG 升高，流式細(xì)胞儀發(fā)現(xiàn)外周血單核細(xì)胞中IFN-γ+CD8+T細(xì)胞數(shù)明顯增加[25-26]。

1.4.2 傳染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，IBDV） 傳染性法氏囊病病毒的VP2蛋白可誘導(dǎo)小雞產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體。2014年，有研究者以IBDV 的總RNA 為模板擴(kuò)增VP2基因，插入 pALVAC 得到 pALVAC-VP2，轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞株，挑選重組病毒，Western blot 發(fā)現(xiàn)rCNPV-VP2 中 37 kD 的 VP2 蛋白可被患者的血清結(jié)合。隨后通過肌肉注射將5.5×105PFU 重組病毒免疫萊杭雞，并在初次注射后32、53 d 加強(qiáng)2次，在初次注射后74 d發(fā)現(xiàn)血清的中和抗體升高，滴度為 1∶512[27]。

1.4.3 藍(lán)舌病毒17 型 藍(lán)舌病毒17 型感染家畜和野生嚙齒動(dòng)物后引起的疾病稱為藍(lán)舌病。外殼蛋白的主要成分VP2和VP5蛋白接種動(dòng)物可產(chǎn)生中和抗體。2007 年，有研究者提取BTV-17 總RNA 作為模板擴(kuò)增VP2/VP5基因，插入pALVAC得到 pALVAC-VP2/VP5，轉(zhuǎn)染 BHK-21 細(xì)胞株，挑選陽性病毒，免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)陽性病毒能表達(dá)融合蛋白。隨后，將6.3×108PFU 重組病毒皮下注射綿羊，并在第1 次注射后3 周加強(qiáng)1 次，結(jié)果表明，在第1 次注射后5 周血清的中和抗體提升，抗體滴度達(dá)1∶40，此時(shí)，通過皮下注射將105.5TCID50藍(lán)舌病毒17 型的有毒株進(jìn)行攻擊感染，在攻擊后3周免疫組的血清無病毒負(fù)荷[28]。

1.5 黃病毒

1.5.1 西尼羅病毒（west Nile virus，WNV） 西尼羅病毒是西尼羅熱的病原體，WNV 的表面含有前膜蛋白（pre-membrane protein，prM）和包膜蛋白（envelope protein，E），可在WNV 表面形成異二聚體，具有較好的免疫原性。為了驗(yàn)證rCNPV-PrM/E的保護(hù)效果，將105.6TCID50的重組病毒分別皮下注射貓和狗，在第1次注射后4周重復(fù)1次，在第1次注射后120 d 用10 只WNV 感染的白紋伊蚊叮咬30 min，在叮咬后13 d 提示接種貓和狗血清中的中和抗體明顯升高，滴度分別為1∶305 和1∶320，血清的病毒負(fù)荷有一定程度的降低。隨后進(jìn)行的rCNPV-PrM/E 接種兒馬實(shí)驗(yàn)提示接種組的存活率明顯升高[29-30]。

1.5.2 丙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒感染可引起丙型肝炎，非結(jié)構(gòu)蛋白3（nonstructural protein 3，NS3）可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生一定的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。2000 年，有研究者提取 HCV 的 cDNA 作為模板擴(kuò)增NS3基因，插入pRC/ATG 得到pRC-NS3，加ALVAC 轉(zhuǎn)化COS-1 細(xì)胞株，挑選陽性病毒，Western blot 發(fā)現(xiàn)陽性病毒表達(dá)的70 kD 的NS3 蛋白可被患者的血清所識(shí)別。保護(hù)力試驗(yàn)表明，100 μg的pRC-NS3肌肉注射C57BL/6鼠后，在第1次注射后4、8周強(qiáng)化2次，在第1次注射后12周靜脈注射5×107PFU 的rCNPV-NS3疫苗加強(qiáng)1次，結(jié)果表明在第1 次注射后16 周血清IgG 升高，脾細(xì)胞CTL反應(yīng)增強(qiáng)，流式細(xì)胞儀證實(shí)脾IFN-γ+CD8+T細(xì)胞數(shù)增加。隨后，將 50 μg 的 pRC-NS3 肌肉注射 HLA-AI-1+鼠，在第 1 次注射后 3 周加強(qiáng) 1 次，并在 第 1 次 注 射 后 6 周 靜 脈 注 射 5×107PFU 的rCNPV-NS3疫苗加強(qiáng)1次，結(jié)果表明在第1次注射后14 周脾細(xì)胞CTL 反應(yīng)增加，斑點(diǎn)酶聯(lián)吸附實(shí)驗(yàn)證實(shí)脾IFN-γ+SFCs 的數(shù)目增加，此時(shí)腹腔注射107PFU 重組VV-C-NS3/HCV 嵌和病毒株進(jìn)行攻擊感染，結(jié)果表明在攻擊感染后5 d接種鼠卵巢的病毒負(fù)荷明顯減少[31-32]。

1.6 皰疹病毒

1.6.1 巨細(xì)胞病毒 巨細(xì)胞病毒常引起胎兒的先天性畸形。gB 蛋白可誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生。有研究者將106.5TCID50的rCNPV-gB 疫苗肌肉注射健康志愿者，在第 1 次注射后28、180 d 加強(qiáng) 2 次，結(jié)果表明血清IgG 和中和抗體在第1 次注射60～360 d 時(shí)升高，在第 1 次注射后 180 d 達(dá)到較高水平，滴度分別為1∶89 144 和1∶266，且該疫苗可誘導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞免疫應(yīng)答[33]。

1.6.2 馬皰疹病毒1 型（equine herpes virus type 1，EHV-1） 馬皰疹病毒1 型感染是馬流產(chǎn)或神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病因之一，重組gB 蛋白是一種有效的免疫原。為了研制重組CNPV 疫苗，提取EHV-1 的基因組DNA 作為模板擴(kuò)增gB基因，插入 pVR1012 得到 pVR1012-gB，并與 pALVAC 重組得到pALVAC-gB，轉(zhuǎn)染Vero 細(xì)胞株，挑選陽性病毒，免疫熒光技術(shù)提示陽性病毒能表達(dá)融合蛋白。隨后，通過肌肉注射將108TCID50重組病毒免疫Welsh矮種馬，在第1次接種后5周重復(fù)1次，結(jié)果表明在第1 次接種后8 周血清IgG 和中和抗體的滴度升高，此時(shí)用105TCID50馬皰疹病毒1 型的Ab4 株進(jìn)行滴鼻攻擊，在攻擊后2 周發(fā)現(xiàn)血清的病毒負(fù)荷明顯降低[34]。

1.7 狂犬病毒

狂犬病毒的狂犬病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein，RGP）可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較好的保護(hù)力。有研究者將106.5TCID50的rCNPV-RGP 疫苗注射BALB/c 鼠，并在2 周后腦內(nèi)注射16 半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50）狂犬病毒CNS 株進(jìn)行攻擊，在攻擊后4 周顯示免疫組和對(duì)照組的存活率分別為 100%（10/10）和 0%（0/10）。之后，將107TCID50的rCNPV-RGP 疫苗皮下注射畢格犬，在注射后 26 d 發(fā)現(xiàn)血清 IgG 升高，滴度為 1∶5.3，此時(shí)肌肉注射3.52 LD50狂犬病毒NYGS 株進(jìn)行攻擊，在攻擊后4周計(jì)算存活率，結(jié)果顯示接種組和對(duì)照組存活率分別為 100%（4/4）和 0%（0/2）[35]。隨后將rCNPV-RGP 疫苗接種健康志愿者、仔貓或幼鹿，試驗(yàn)結(jié)果表明該疫苗可誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，并持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間[36]。

1.8 兔出血熱病毒

兔出血熱病毒（rabbit haemorrhagic fever virus，RHDV）感染是兔出血熱的病因。重組衣殼蛋白（recombinant capsid protein，Cap）是一種有效的免疫原。1997 年，有研究者提取RHDV 的總RNA 作為模板克隆Cap 蛋白的編碼基因，插入pBSK（+）得到pBSK-cap，并與pALVAC 重組得到pALVAC-cap，轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞株，進(jìn)行篩選和培養(yǎng)，Western blot 方法顯示，患者血清可結(jié)合重組病毒表達(dá)的 60 kD 的 CAP 蛋白。隨后，將 105PFU 和107PFU 重組病毒接種兔，在第1 次接種后4 周重復(fù)1次，在第1次接種后6周顯示，血清IgG和中和抗體的滴度升高，此時(shí)通過滴鼻將100 LD50的L4/90 株進(jìn)行感染攻擊，在攻擊后2 周表明105PFU 接種組、107PFU 接種組和對(duì)照組的存活率分別為75%（3/4）、100%（4/4）和0%（0/6）[37]。

2 重組CNPV抗嬰兒利什曼原蟲

嬰兒利什曼原蟲感染可引起內(nèi)臟利什曼病，俗稱黑熱病。長(zhǎng)須魯蛉（Lutzomyia longipalpis）是一種黑熱病的傳播媒介，LJM17 是該媒介的唾液蛋白，可誘導(dǎo)倉(cāng)鼠產(chǎn)生一定的保護(hù)力。為了研究rCNPV-LJM17 疫苗的保護(hù)效果，有研究者先將250 μg 的 pNB0-LJM17 肌肉注射畢格犬，在第 1次注射后 4、6 周再肌肉注射 108PFU 的rCNPV-LJM17 疫苗強(qiáng)化 2 次，在初次注射后 10 周發(fā)現(xiàn)血清IgG 抗體及其IgG1 和IgG2a 亞類的滴度升高，IgG2a 水平高于IgG1，此時(shí)皮下注射107個(gè)嬰兒利什曼原蟲的前鞭毛體進(jìn)行感染攻擊，在攻擊后10 個(gè)月發(fā)現(xiàn)接種犬皮損處的原蟲負(fù)荷顯著降低[38]。

3 展望

重組CNPV 載體介導(dǎo)的疫苗具有以下優(yōu)點(diǎn)：①CNPV 僅感染禽類細(xì)胞，雖然也可一過性感染哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，但由于其DNA 的合成受到抑制，常導(dǎo)致該類細(xì)胞的流產(chǎn)性感染；②CNPV 的減毒株ALVAC 具有價(jià)格低廉、穩(wěn)定、無需冷鏈存儲(chǔ)等特點(diǎn)；③由于ALVAC減毒株不感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，故在健康人群或免疫受累人群中不產(chǎn)生疾??；④該重組病毒具有自身的酶系統(tǒng)和調(diào)控信號(hào)，其轉(zhuǎn)錄、翻譯和調(diào)控均在胞漿中進(jìn)行，避免了病毒基因組插入宿主細(xì)胞染色體的可能性；⑤該重組病毒可刺激宿主產(chǎn)生全面的細(xì)胞、體液和黏膜免疫應(yīng)答，免疫應(yīng)答的持續(xù)時(shí)間較久。

現(xiàn)有CNPV 載體介導(dǎo)的病原體疫苗大部分只進(jìn)行了接種小鼠、兔、畢格犬、幼貓、狐貍、大熊貓、仔豬、恒河猴、兒馬或矮種馬等的動(dòng)物試驗(yàn)，尚未進(jìn)行志愿者或感染者的接種試驗(yàn)；只有CNPV 載體介導(dǎo)的艾滋病毒、巨細(xì)胞病毒和狂犬病毒疫苗進(jìn)行了健康志愿者的接種試驗(yàn)，但免疫效果不佳，尚需進(jìn)行疫苗接種劑量、次數(shù)和間隔時(shí)間的優(yōu)化，并探究不同類型疫苗的初免加強(qiáng)策略；CNPV 載體介導(dǎo)的艾滋病毒疫苗進(jìn)行了接種艾滋病患者的試驗(yàn)，但治療結(jié)果不佳，可能是因?yàn)榛颊唧w內(nèi)存在一些免疫逃避或抑制策略，導(dǎo)致患者在接種疫苗后不能有效活化相應(yīng)的免疫應(yīng)答，并建立持續(xù)的記憶性免疫應(yīng)答，提示這類疫苗的免疫機(jī)制尚需深入研究；CNPV 載體介導(dǎo)疫苗的非復(fù)制型機(jī)理研究尚不深入；表達(dá)載體缺乏高效啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，表達(dá)效率通常較低；靶向性較差，不良反應(yīng)較大；母源抗體的干擾可影響rCNPV的免疫效果。

隨著科技的進(jìn)步，人們對(duì)病毒和寄生蟲的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及表觀遺傳學(xué)等進(jìn)行了深入研究，從而闡明了病毒和寄生蟲蛋白的抗原結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。隨著各種組學(xué)和規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列/Cas9 基因編輯等高通量篩選和抗原功能鑒定技術(shù)的發(fā)展，可篩選出更多的保護(hù)性抗原分子，構(gòu)建多價(jià)高效的復(fù)合基因疫苗或含有基因佐劑的混合基因疫苗或多表位疫苗。但未來仍需進(jìn)行以下幾個(gè)方面的研究以拓展重組CNPV 載體疫苗的應(yīng)用前景：①探究這些疫苗的免疫原性、轉(zhuǎn)化效率、MHC 限制性以及能否長(zhǎng)期在宿主體內(nèi)表達(dá)；②研究新型佐劑、疫苗載體和制備融合蛋白，提高疫苗的免疫原性；③在宿主體內(nèi)準(zhǔn)確評(píng)估新型疫苗分子的保護(hù)性免疫機(jī)制；④進(jìn)一步探究病毒和寄生蟲蛋白家族及其他相關(guān)蛋白生物學(xué)功能，提升疫苗的設(shè)計(jì)水準(zhǔn)；⑤探究納米微粒技術(shù)引入新型疫苗能否延長(zhǎng)免疫應(yīng)答的時(shí)間，并誘導(dǎo)記憶性T 細(xì)胞的產(chǎn)生。