張瑩瑩 郝文娟 李宏玉 馬艷 毛偉力

摘要

蕓薹根腫病是一種危害極大的世界性病害。對(duì)此病害的防治多采用化學(xué)藥劑，但過多地使用化學(xué)農(nóng)藥，不僅會(huì)導(dǎo)致病原菌的抗藥性和藥劑防效的不穩(wěn)定，還會(huì)造成環(huán)境污染和食品安全等問題。篩選生防菌株并將其開發(fā)成有效的生物農(nóng)藥，是防治根腫病并保持綠色農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的新途徑。本研究選用了多種生防菌對(duì)蕓薹根腫菌Plasmodiophora brassicae Woron.的休眠孢子進(jìn)行拮抗測(cè)試，篩選出一株能抑制P.brassicae休眠孢子萌發(fā)的多黏類芽胞桿菌Paenibacillus polymyxa菌株 P1。通過液體發(fā)酵和劑型處理，將P1制成懸浮劑（P1SC），用于室內(nèi)生測(cè)和大田試驗(yàn)，測(cè)定其對(duì)廣東菜心根腫病的防治效果。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)菜心根腫病的防治效果與所使用的P1SC濃度呈正相關(guān)，當(dāng)施用P1SC 中P1的濃度≥1×106 cfu/mL時(shí)，對(duì)菜心根腫病的防治效果（83.0%）與化學(xué)農(nóng)藥氟啶胺（500 mg/L）的防治效果（100.0%）沒有顯著性差異，但顯著高于（P≤0.05）一種商品枯草芽孢桿菌（2×107 cfu/mL）的防治效果（29.8%）。 2018年的大田試驗(yàn)結(jié)果表明，P1SC處理（4 L/667m2）對(duì)菜心根腫病的防治效果（53.3%）顯著高于（P≤0.05）枯草芽孢桿菌處理（2 kg/667m2，30.9%），與500 g/L氟啶胺SC（500 mL/667m2）的防治效果（44.6%）沒有顯著差異（P≤0.05）;而在2019年，P1SC處理對(duì)菜心根腫病的防治效果（62.4%）顯著高于（P≤0.05）500 g/L氟啶胺SC（34.6%）和枯草芽孢桿菌處理（31.4%）。

??關(guān)鍵詞

十字花科;蕓薹根腫菌;休眠孢子;多黏類芽胞桿菌;防治效果

中圖分類號(hào)：

S476

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

DOI：10.16688/j.zwbh.2020644

Control effect of Paenibacillus polymyxa P1 strain against cabbage clubroot in Guangdong

ZHANG Yingying1，HAO Wenjuan1，LI Hongyu2，MA Yan2，MAO Weili1*

（1. Shanghai Wanlihua Biotech Corporation， Shanghai201203， China;

2. Dali Plant Protection Station， Yunnan Province， Dali671000， China）

Abstract

Clubroot is a worldwide and harmful disease. Chemical pesticides have been used to control the disease， however， excessive use of chemical pesticides will lead to the resistance of the pathogen and instable control effect of the pesticides，and cause the problems of environmental pollution and food safety. Screening and developing biocontrol agents are necessary for clubroot control and sustainable development of green agriculture. In this study， a variety of biocontrol agents were selected to test their inhibition activity on dormant spore germination of Plasmodiophora brassicae Woron. A strain P1 of Paenibacillus polymyxa was selected， with good inhibiting effect on germination of the dormant spores. Through the processes of fermentation and formulation， a suspension concentrate was made containing P1 （P1SC）， and the control effect against the clubroot of Guangdong cabbage （CGC） was investigated by indoor pot experiment and field test. Pot experiment revealed that there was a positive correlation between the concentration of P1SC applied and the control effect. When the content of P1 spores in? P1SC applied was ≥1×106 cfu/mL， there was no significant difference （P≤0.05） on the control effect of CGC between the treatments of P1SC （83.0%） and the chemical pesticide fluazinam （500 mg/L， 100.0%）， but significantly higher （P≤0.05） than that of a commercial formulation with a strain of? Bacillus subtilis （2×107 cfu/mL， 29.8%）. Field experiments in 2018 showed that the control effect of P1SC （4 L/667m2，? 53.3%） on CGC was significantly higher （P≤0.05） than that of B. subtilis （2 kg/667m2， 30.9%）， but similar to that of 500 g/L? fluazinam SC （500 mL/667 m2， 44.6%）. The results of 2019 showed the control effect of P1SC on CGC （62.4%） was significantly higher （P≤0.05） than that of fluazinam （34.6%） and B.subtilis （31.4%）.

Key words

Cruciferae;Plasmodiophora brassicae;dormant spore;Paenibacillus polymyxa;control effect

蕓薹根腫菌Plasmodiophora brassicae Woron主要侵染十字花科作物并引起根腫病。早在1737年根腫病已出現(xiàn)在地中海西岸及歐洲南部，目前已成為一種世界性的嚴(yán)重影響十字花科作物產(chǎn)量的土傳病害[1 3]。根腫病在中國(guó)大部分地區(qū)均有發(fā)生，約有320～400萬(wàn)hm2的耕地常年受到根腫病的侵染。P.brassicae主要侵染作物根部，形成大小不一、光滑或龜裂粗糙的腫瘤，影響根系生長(zhǎng)及對(duì)水分、養(yǎng)分的吸收，導(dǎo)致地上部分黃化、萎蔫、生長(zhǎng)遲緩，甚至死亡，可造成20%～60%的減產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)損失[4 5]。在無(wú)十字花科寄主的情況下，P.brassicae的休眠孢子可在土壤中存活長(zhǎng)達(dá)20年之久[1]。一旦土壤帶菌，在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)該地塊不能再種植十字花科作物。由于根腫病的傳播速度快，途徑廣，在防控上十分困難。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)根腫病的防治主要采用化學(xué)藥劑，例如氟啶胺、氰霜唑、多菌靈、百菌清等。但長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑，會(huì)造成P.brassicae的抗藥性增強(qiáng)、防效不穩(wěn)定，并會(huì)產(chǎn)生大量的農(nóng)藥殘留，不利于綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。通過施用石灰調(diào)節(jié)土壤pH可降低根腫病的發(fā)病率[6]， 但大量施用石灰會(huì)改變土壤的物理結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，因此也不宜長(zhǎng)期施用。生物防治對(duì)環(huán)境和人畜無(wú)害，且不易產(chǎn)生抗藥性，國(guó)內(nèi)外科研人員利用生物農(nóng)藥對(duì)根腫病的防治進(jìn)行了大量的研究，并取得了一定的成效。王保通等[7]選用一種解淀粉芽胞桿菌生物制劑（Ba168）對(duì)甘藍(lán)根腫病的防治進(jìn)行了溫室試驗(yàn)，結(jié)果顯示，其防治效果在79.84%～81.24%。何有為[8]從土壤中分離出兩株芽胞桿菌F85和T133，對(duì)P.brassicae的休眠孢子侵染油菜根毛有抑制作用，F(xiàn)85和T133的盆栽試驗(yàn)防效均在60%以上。Cheah等[9]在花椰菜溫室和田間試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，3個(gè)木霉菌株Trichoderma spp. （TC32，TC45和 TC63） 和1個(gè)鏈霉菌Streptomyces sp. （S99） 均對(duì)根腫病有抑制作用。

目前全球已登記的，含不同有效成分的生物農(nóng)藥有上千個(gè)產(chǎn)品。僅以木霉為產(chǎn)品活性成分的殺菌劑就有300多個(gè)[10]。在許多發(fā)達(dá)國(guó)家，如：美國(guó)、加拿大、日本、歐盟、澳大利亞、以色列等，生物農(nóng)藥使用量已從20世紀(jì)90年代初的 <5%，到目前的接近或 >20%的全年農(nóng)藥使用總量。在發(fā)展中國(guó)家，例如：巴西、印度、中國(guó)、越南等，生物農(nóng)藥的使用量也有了顯著的提升[10 11]。我國(guó)在生物農(nóng)藥領(lǐng)域的研究起步雖早，但總體發(fā)展較慢且不均衡。直到本世紀(jì)初，在國(guó)家的大力倡導(dǎo)和支持下，生物農(nóng)藥的研究與產(chǎn)業(yè)化有了平衡而快速的發(fā)展[12 13]。2001年我國(guó)注冊(cè)登記的生物農(nóng)藥品種只有80個(gè)，產(chǎn)品694個(gè)（其中大多為農(nóng)用抗生素類產(chǎn)品），到2018年，我國(guó)注冊(cè)登記的生物農(nóng)藥，包括微生物、植物源和生物化學(xué)類，產(chǎn)品數(shù)達(dá)1 366個(gè)[14]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)生物農(nóng)藥的使用量已從2010年前的<5%，上升到目前接近或>10%的全年農(nóng)藥總使用量。

本研究通過拮抗試驗(yàn)，篩選出一株對(duì)P.brassicae休眠孢子萌發(fā)有抑制作用的Paenibacillus polymyxa菌株P(guān)1。將其制成多黏類芽胞桿菌懸浮劑（P1SC）后，在室內(nèi)生測(cè)及大田試驗(yàn)中評(píng)價(jià)其對(duì)根腫病的防治效果。

1材料與方法

1.1供試材料

供試菌株：20株木霉屬真菌、10株芽胞桿菌屬細(xì)菌（表1），由上海萬(wàn)力華生物科技有限公司分離保存。

培養(yǎng)基：真菌用PDB培養(yǎng)基，細(xì)菌用NB培養(yǎng)基。

供試菜心Brassica campestris L.ssp. chinensis var. utilis Tsen品種：‘四九菜心’，青縣純豐蔬菜良種繁育場(chǎng)。

供試藥劑：2×108 cfu/mL P1SC，上海萬(wàn)力華生物有限公司;500 g/L氟啶胺懸浮劑（SC），先正達(dá)集團(tuán);100億個(gè)/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（WP），云南星耀生物制品有限公司。

1.2蕓薹根腫菌休眠孢子懸浮液的制備

稱取10 g菜心根腫組織洗凈，置于24℃室內(nèi)腐爛5 d，加入100 mL蒸餾水，用組織研磨機(jī)攪成勻漿，8層紗布過濾，濾液2 000 r/min離心5 min，重復(fù)3次。將沉淀溶于100 mL蒸餾水中，制成濃度為1×108個(gè)/mL的蕓薹根腫菌休眠孢子懸浮液，冷藏于4℃冰箱備用。

1.3拮抗微生物培養(yǎng)液的制備

將生長(zhǎng)在斜面培養(yǎng)基上的拮抗菌株，分別接入含有100 mL液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于28℃，200 r/min的搖床上培養(yǎng)（真菌5 d，細(xì)菌2 d），鏡檢后，用無(wú)菌水稀釋制成濃度為1×108 cfu/mL拮抗菌培養(yǎng)液。

1.4根分泌物的收集

因?yàn)楦[病菌的休眠孢子不能在植物體外進(jìn)行培養(yǎng)，所以收集廣東菜心根分泌物充當(dāng)寄主，以便對(duì)病原菌休眠孢子進(jìn)行離體測(cè)試。菜心種子經(jīng) 5.25%次氯酸鈉表面消毒后，在28℃下催芽2～3 d;將出芽的種子播種到含有500 mL Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的容器中，在（28±2）℃的培養(yǎng)箱中，L∥D=12 h∥12 h培養(yǎng)7 d后，紗布過濾收集根分泌物，經(jīng)過微孔濾膜（孔徑0.22 μm）濾除細(xì)菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5拮抗菌抑制P.brassicae休眠孢子萌發(fā)的篩選

分別吸取0.5 mL P.brassicae休眠孢子懸浮液和拮抗菌培養(yǎng)液，移至含有3 mL滅過菌的根分泌物的離心管中，以無(wú)菌水代替拮抗菌培養(yǎng)液為空白對(duì)照，24℃黑暗培養(yǎng)5 d，鏡檢觀察孢子萌發(fā)率，重復(fù)3次。

采用地衣紅法[15]判定休眠孢子的萌發(fā)。用1%地衣紅染色劑（45 mL醋酸與55 mL蒸餾水混合，加熱，緩慢加入1 g地衣紅粉末，攪拌溶解后緩慢煮沸2 h，過濾后儲(chǔ)存在棕色瓶中備用）染色3 min后觀察，著色的為未萌發(fā)的休眠孢子，未著色的為萌發(fā)的孢子。

休眠孢子萌發(fā)率=處理前孢子萌發(fā)率-處理后孢子萌發(fā)率;

休眠孢子萌發(fā)抑制率=（對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對(duì)照孢子萌發(fā)率×100%。

1.6P1SC防治菜心根腫病室內(nèi)生測(cè)

選取直徑10 cm的營(yíng)養(yǎng)缽，裝入營(yíng)養(yǎng)土（草炭 ∶珍珠巖 ∶蛭石=7 ∶1 ∶2），移栽生長(zhǎng)情況一致的兩葉期菜心苗。移栽當(dāng)天每缽加入2 mL P.brassicae休眠孢子懸浮液（1×107 cfu/mL）。將P1SC配制成5個(gè)濃度：1×105， 5×105， 1×106，5×106， 1×107 cfu/mL。 其他藥劑處理為枯草芽孢桿菌可濕性粉劑稀釋500倍;500 g/L氟啶胺懸浮劑稀釋1 000倍;清水空白對(duì)照。采用灌根法，分別在移栽當(dāng)天、7 d以及14 d后，將各處理藥劑澆灌于作物根部，每缽50 mL。每個(gè)處理5缽， 設(shè)3次重復(fù)。種植40 d后，統(tǒng)計(jì)根腫病發(fā)病情況。

菜心根腫病病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[16]：0級(jí)：無(wú)任何腫瘤;1級(jí)：主根腫大，其直徑小于2倍莖基，或須根有小腫瘤;3級(jí)：主根腫大，其直徑為莖基的2～3倍;5級(jí)：主根腫大，其直徑為莖基的3～4倍;7級(jí)：主根腫大，其直徑為莖基的4倍以上，或植株死亡。

1.7P1SC防治根腫病大田試驗(yàn)

2018年和2019年的大田試驗(yàn)在上海浦遠(yuǎn)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行，種植方式為撒種直播并適時(shí)間苗。在菜心出苗前，用春豐8HA電動(dòng)噴霧器對(duì)土壤表面進(jìn)行不同處理的噴霧施藥;菜心出苗（兩葉菜心）后，對(duì)不同處 理進(jìn)行葉面噴霧，每隔7 d一次，共3次。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理：a. P1SC用藥量為： 4 L/667m2;b. 氟啶胺SC用藥量為：500 mL/667m2;c. 枯草芽孢桿菌WP用藥量為：2 kg/667m2;d. 清水對(duì)照。每個(gè)處理20 m2，3次重復(fù)，隨機(jī)排列，用水量為50 L/667m2。 成熟期采收后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。

菜心根腫病病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[17]：0級(jí)，無(wú)病害癥狀;Ⅰ級(jí)，僅須根末梢上有少量腫瘤;3級(jí)，側(cè)根上有腫瘤;5級(jí)，側(cè)根腫瘤大且主根末梢有小的腫瘤;7級(jí)，主根全部腫大，但植株生長(zhǎng)正常;9級(jí)，根上腫大部分開始龜裂腐爛、植株萎蔫或死亡。

由于盆栽試驗(yàn)是在可控的特定條件下進(jìn)行，菜心根部的生長(zhǎng)環(huán)境與同時(shí)期的田間試驗(yàn)的環(huán)境有所不同，因此盆栽試驗(yàn)和田間試驗(yàn)分別采用不同的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[18]。試驗(yàn)結(jié)果可靠且對(duì)結(jié)果的比較沒有影響。

1.8數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel整理，采用SPSS 23對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素ANOVA分析。

2結(jié)果與分析

2.1拮抗菌抑制P.brassicae休眠孢子萌發(fā)的測(cè)試結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明（表2）：拮抗真菌TR04、TR13和細(xì)菌P1、P2、P7對(duì)P.brassicae休眠孢子萌發(fā)的抑制率均在50%以上，其中P1的抑制率高達(dá)71.3%，該處理的P.brassica休眠孢子萌發(fā)顯著低于（P≤0.05）其他處理孢子的萌發(fā)率。

2.2P1SC防治菜心根腫病室內(nèi)生測(cè)結(jié)果

室內(nèi)生測(cè)結(jié)果表明（表3，圖1），P1SC對(duì)菜心根腫病的防治效果與用藥濃度呈正相關(guān)。 當(dāng)施用P1SC? 中的P1的濃度≥1×106 cfu/mL時(shí)，對(duì)菜心根腫病的防治效果為83.0%，與化學(xué)農(nóng)藥500 mg/L 氟啶胺SC的防治效果（100.0%）沒有顯著性差異，但顯著高于（P≤0.05）一種商品枯草芽孢桿菌（2×107 個(gè)/mL）的防治效果（29.8%）。

2.3大田試驗(yàn)結(jié)果

2018年的大田試驗(yàn)結(jié)果表明（表4，圖2），P1SC處理（4 L/667m2）對(duì)菜心根腫病的防治效果（53.3%）顯著高于（P≤0.05）枯草芽孢桿菌處理（2 kg/667m2，30.9%），與氟啶胺（500 mL/667m2）的防治效果（44.6%）沒有顯著差異;而在2019年，P1SC處理對(duì)菜心根腫病的防治效果（62.4%）顯著高于（P≤0.05）氟啶胺（34.6%）和枯草芽孢桿菌處理（31.4%）。

3討論

多黏類芽胞桿菌作為一種生防菌，已廣泛應(yīng)用于植物病害生物防治。Kavitha等[19]發(fā)現(xiàn)多黏類芽胞桿菌 VLB16 抑制稻瘟病菌Pyricularia oryzae 和水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani的生長(zhǎng)。劉晶晶等[20]篩選出5株多黏類芽胞桿菌（ShX301、ShX302、ShX303、Hb1、Hb6），通過釋放揮發(fā)性物質(zhì)來(lái)抑制茄子黃萎病菌Verticillium spp. 的生長(zhǎng)。另外多黏類芽胞桿菌還對(duì)人參黑斑病菌Alternaria panax、番茄青枯病菌Ralstonia solanacearum和蘋果樹腐爛病菌Valsa ceratosperma 等有較好的拮抗效果[21 25]。但是，使用多黏類芽胞桿菌防治十字花科根腫病還鮮有報(bào)道。本研究的室內(nèi)生測(cè)試驗(yàn)以及2年的大田試驗(yàn)結(jié)果表明，P1可以抑制P.brassicae休眠孢子的萌發(fā)，P1SC能較好地防控菜心根腫病，其防控效果與化學(xué)農(nóng)藥氟啶胺接近（2018年），或超過氟啶胺的防控效果（2019年）。

生防菌的開發(fā)利用，為解決十字花科根腫病問題提供了新的思路。 多數(shù)生防菌在室內(nèi)盆栽試驗(yàn)的防效高于大田試驗(yàn)。究其原因可能是目前的生物菌劑有效成分為活體微生物，田間應(yīng)用時(shí)易受溫度、濕度、土壤pH等環(huán)境條件的影響，從而降低了生防菌對(duì)根腫病菌的拮抗作用[26]。如何高效、穩(wěn)定地防治根腫病是目前生防菌研究的主攻方向。本研究?jī)赡甏筇镌囼?yàn)結(jié)果表明，P1SC的大田防效相對(duì)穩(wěn)定。但是能否長(zhǎng)期穩(wěn)定地防治根腫病還需要大量的研究來(lái)證明。

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收稿日期：2020 12 03修訂日期：2021 01 27

基金項(xiàng)目：

大理州毛偉力專家工作站（大科聯(lián)發(fā)[2019]6號(hào)）

* 通信作者

Email：weilimao@hotmail.com