王蓉 李勇 魏若凡 陳炳蔚 王天佑 丁萬隆

摘要

為調(diào)查我國太子參主產(chǎn)區(qū)病毒病發(fā)生情況，使用RTPCR法對采自福建省柘榮縣，貴州省施秉縣、丹寨縣和安徽省宣城市的71份具有典型病毒病癥狀的太子參樣品進(jìn)行檢測，并根據(jù)CP氨基酸序列對不同地區(qū)病毒進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。RTPCR結(jié)果顯示，65份樣品檢出病毒，檢出率為91.55%，其中，56份樣品檢出蕪菁花葉病毒Turnip mosaic virus（TuMV），49份樣品檢出蠶豆萎蔫病毒2號Broad bean wilt virus 2（BBWV2）， 9份樣品檢測出黃瓜花葉病毒Cucumber mosaic virus（CMV），檢出率分別為78.87%、69.01%和12.68%。未檢測到煙草花葉病毒Tobacco mosaic virus（TMV）。序列和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析顯示，本研究獲得的TuMV、BBWV2和CMV與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列相似度較高，核苷酸相似度分別為98.05%～98.98%、93.61%～94.25%和98.02%～99.17%，氨基酸序列相似度分別為：96.14%～97.47%、97.33%～98.50%和98.00%～100%，分別屬于WorldB組、Ⅰa亞組和Ⅱ組。

??關(guān)鍵詞

太子參;蕪菁花葉病毒;蠶豆萎蔫病毒2號;黃瓜花葉病毒;系統(tǒng)進(jìn)化分析

中圖分類號：

S435.67

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020584

Investigation on the occurrence of virus diseases in the main producing areas of Pseudostellaria heterophylla in China

WANG Rong1，LI Yong1，WEI Ruofan1，CHEN Bingwei1，WANG Tianyou1，2，DING Wanlong1*

（1. Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and

Peking Union Medical College， Beijing100193， China; 2. College of Traditional Chinese

Medicine， Jilin Agricultural University， Changchun130118， China）

Abstract

To investigate the occurrence of viral diseases in the main producing areas of Pseudostellaria heterophylla in China， reverse transcription polymerase chain reaction （RTPCR） was used to detect the viruses in 71 P.heterophylla samples with typical viral symptoms collected from Zherong county in Fujian province， Shibing county and Danzhai county in Guizhou province， and Xuancheng city in Anhui province. Phylogenetic analyses based on the CP amino acid sequences of the viruses from different regions were carried out. The results of RTPCR showed that 65 samples were infected by virus（es）， with a detection rate of 91.55%. Among them， Turnip mosaic virus （TuMV） were detected in 56 samples，Broad bean wilt virus 2 （BBWV2） were detected in 49 samples， while Cucumber mosaic virus （CMV） were detected in nine samples， with the detection rates of 78.87%， 69.01% and 12.68%， respectively. Tobacco mosaic virus （TMV） was not detected in all samples. Sequences and phylogenetic analyses showed that the nucleotide sequences of TuMV， BBWV2 and CMV obtained in this study shared 98.05% 98.98%， 93.61% 94.25% and 98.02% 99.17% nucleotide identities and 96.14% 97.47%， 97.33% 98.50% and 98.00% 100% amino acid identities with the sequences in National Center of Biotechnology Information （NCBI） database， respectively. The TuMV， BBWV2 and CMV isolates obtained in this study belong to group WorldB， subgroup Ⅰa and group Ⅱ， respectively.

Key words

Pseudostellaria heterophylla;Turnip mosaic virus;Broad bean wilt virus 2;Cucumber mosaic virus;phylogenetic tree

太子參Pseudostellaria heterophylla （Miq.） Pax又名孩兒參、童參，石竹科Caryophyllaceae草本植物，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，也可作為保健食品。其塊根入藥具有益氣健脾、生津潤肺之功效[1]。自太子參人工種植以來，病毒侵染引起的太子參花葉病便是影響太子參生產(chǎn)的重要病害之一。其癥狀表現(xiàn)為植株矮小，葉片花葉、環(huán)斑、皺縮，根系減少，塊根變小[2]。太子參以塊根進(jìn)行無性繁殖，病毒經(jīng)無性繁殖材料直接傳播給下一代，使得太子參病毒病呈逐年加重趨勢，嚴(yán)重時導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)太子參品種退化。據(jù)調(diào)查，太子參主產(chǎn)區(qū)病毒病發(fā)病率可達(dá)60%～90%，甚至100%，嚴(yán)重危害太子參的產(chǎn)量和質(zhì)量[2 -3]。

在我國，侵染太子參的病毒主要有4種：蕪菁花葉病毒Turnip mosaic virus（TuMV）、蠶豆萎蔫病毒2號Broad bean wilt virus 2 （BBWV2）、黃瓜花葉病毒Cucumber mosaic virus （CMV）和煙草花葉病毒Tobacco mosaic virus（TMV）[4 -5]。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和反轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR）是兩種常用的太子參病毒病檢測方法。高瑋等[6]、黃勇毅等[3]使用ELISA法分別對太子參中的TMV和CMV進(jìn)行了檢測。匡云波等[7]根據(jù)病毒較保守的外殼蛋白（coat protein， CP）序列，設(shè)計特異性引物，建立了太子參TuMV和BBWV2的雙重RTPCR檢測體系。在RTPCR檢測的基礎(chǔ)上，匡云波等獲得并分析了不同產(chǎn)地太子參TuMV和BBWV2的序列差異，發(fā)現(xiàn)太子參TuMV均聚類在WorldB 組，并呈現(xiàn)一定的地域特異性[8];太子參BBWV2江蘇、貴州、湖南、福建分離物聚類在Ia 亞組，而山東分離物聚類在Ⅱc亞組，遺傳距離較遠(yuǎn)，呈現(xiàn)一定的地域特異性[9]。目前，未見關(guān)于CMV和TMV太子參分離物基因序列和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析的研究報道。

我國太子參已有近百年的栽培歷史，以福建柘榮，貴州施秉、丹寨和安徽宣城的產(chǎn)量較大，占據(jù)了太子參的主流市場[10]。因此，本研究在上述地區(qū)分別采集具有疑似病毒癥狀的太子參葉片樣品71份，提取植物葉片總RNA，通過RTPCR，使用TuMV、BBWV2、CMV和TMV的特異性檢測引物，檢測各樣品中帶毒情況，擴(kuò)增獲得病毒CP基因片段，通過序列測定、BLASTn分析和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建，分析不同地區(qū)TuMV、BBWV2和CMV的遺傳進(jìn)化關(guān)系。這些數(shù)據(jù)對于深入了解我國太子參主產(chǎn)區(qū)病毒病發(fā)生情況，開展太子參病毒病防控策略研究具有重要意義。

1材料和方法

1.1樣品采集與試驗試劑

2020年6月至7月在福建、貴州、安徽三省太子參主產(chǎn)區(qū)采集具有花葉、環(huán)斑、褪綠斑駁、葉片皺縮等疑似病毒癥狀的太子參葉片71份，其中，福建柘榮縣宮溪鎮(zhèn)宮溪村，采集樣品8份，分別編號為GX1～GX8，黃柏鄉(xiāng)黃柏村采集樣品16份，分別編號為HB1～HB16，英山鄉(xiāng)半嶺村采集樣品8份，分別編號為BL1～BL8;貴州施秉縣城關(guān)鎮(zhèn)上翁哨村采集樣品8份，分別編號為CG1～CG8，牛大場鎮(zhèn)牛大場村采集樣品6份，分別編號為NDC1～NDC6，丹寨縣興仁鎮(zhèn)中營村采集樣品12份，編號分別為DZ1、DZ2、DZ3、DZ4、DZ7、DZ11、DZ14、DZ15、DZ17、DZ22、DZ24和DZ28;安徽省宣城市黃渡鄉(xiāng)烏邊村采集樣品13份，分別編號為XC1～XC13，樣品采集后，使用液氮速凍，置于 80℃保存。

試劑：TRNzol、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;MMLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司;pMD19T Vector、T4 DNA Ligase、Ex Taq polymerase、RNase Inhibitor等購自TaKaRa公司;EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs、Random hexamers primer、Oligo d（T）18、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。引物合成和序列測定由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2葉片總RNA提取

取0.1 g太子參葉片在液氮中充分研磨，使用TRNzol試劑提取葉片總RNA，具體步驟參照說明書，提取的總RNA溶于30 μL DEPC處理的超純水，置于 80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3RTPCR檢測

以1 μg總RNA為模板，Random hexamers primer和Oligo d（T）18為引物，使用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。反應(yīng)體系為：總RNA 1 μg，dNTPs（2.5 mmol/L，無RNase）1 μL，Random hexamers primer和Oligo d（T）18各0.5 μL，DEPC處理的超純水補(bǔ)充體系至18.5 μL，70℃金屬浴5 min，冰上1 min，短暫離心后加入5×MMLV反轉(zhuǎn)錄酶buffer 5 μL，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，37℃水浴1 h。獲得的cDNA用于TuMV、BBWV2、CMV和TMV檢測。其中，BBWV2、TuMV和TMV的檢測引物參照文獻(xiàn)合成，檢測區(qū)域均為病毒的CP基因;CMV檢測引物，BBWV2和TuMV CP擴(kuò)增引物根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫病毒序列使用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計，擴(kuò)增區(qū)域為病毒完整的CP基因（表1）。 PCR反應(yīng)體系為： cDNA模板1 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1 μL，10 μmol/L正向、反向引物各1 μL，EasyTaq ? DNA聚合酶（5 U/μL） 0.25 μL，10×EasyTaq buffer 2.5 μL，超純水補(bǔ)充體系至25 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min;94℃ 變性30 s，52～53℃退火30 s，72℃延伸45 s～2 min，32個循環(huán);72℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4TuMV、BBWV2和CMV CP基因擴(kuò)增

以太子參樣品的cDNA為模板，使用Ex Taq DNA聚合酶及病毒CP基因的特異性擴(kuò)增引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收目的條帶，并將目的條帶連接到pMD19T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，送至北京擎科生物科技有限公司測序。

1.5序列比對分析

使用NCBI網(wǎng)站（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLASTn程序和DNAMAN 6.0軟件對所得序列進(jìn)行比對分析。在GenBank數(shù)據(jù)庫下載獲得18個TuMV核苷酸序列，17個BBWV2 核苷酸序列和15個CMV核苷酸序列，使用MEGA X軟件[12]中的ClustalW程序進(jìn)行比對，并使用鄰接法（neighbor joining）分別構(gòu)建TuMV、BBWV2和CMV CP的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，Bootstrap為1 000。

2結(jié)果與分析

2.1福建、貴州、安徽太子參帶毒情況RTPCR檢測結(jié)果

來自福建、貴州和安徽3省的71份樣品中，有65份樣品被檢出病毒，檢出率為91.55%，其中，56份樣品檢出TuMV，49份樣品檢出BBWV2，9份樣品檢測出CMV，檢出率分別為78.87%、69.01%和12.68%。TMV未檢出。福建省的32份樣品全部檢測出TuMV和BBWV2，其中5份樣品還檢測出CMV。貴州省的26份樣品中，18份樣品檢測出TuMV，5份樣品檢測出BBWV2，檢出率分別為69.23%和19.23%，其中，3份樣品同時檢測到TuMV和BBWV2，檢出率為11.54%。未檢測到CMV。牛大場村的6份樣品未檢測到上述4種病毒。安徽省的13份樣品中，6份樣品檢測出TuMV，12份樣品檢測出BBWV2，4份樣品檢測出CMV，檢出率分別為46.15%、92.31%和30.77%。4份樣品檢測到TuMV、 BBWV2和CMV 3種病毒，1份樣品檢測到TuMV和BBWV2 2種病毒（表2）。以上結(jié)果表明，福建省和安徽省太子參病毒病發(fā)生率最高，均為100%，貴州省太子參病毒病發(fā)生率較高，為76.92%。

2.2不同產(chǎn)地太子參TuMV CP基因克隆及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

結(jié)合RTPCR檢測結(jié)果，選擇福建省的GX1、HB1和BL2，貴州省的DZ1、DZ2和CG5，安徽省的XC4 7個TuMV陽性樣品進(jìn)行CP基因的序列及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。使用TuMV CP基因全長擴(kuò)增引物TuMV8435F和TuMV9715R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)測序顯示均為1 281 bp（圖1）。TuMV GX1、HB1、BL2、DZ1、 DZ2、CG5和XC4分離物的序列均上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫，GenBank登錄號分別為：MW192531、MW192527、MW192530、MW192528、MW192529、MW192532和MW192533。 經(jīng)BLASTn分析確定上述7個分離物均與TuMV KW778J分離物（GenBank登錄號：AB252124）核苷酸序列相似性最高，為98.05%～98.98%。經(jīng)ORF Finder分析，7個分離物的擴(kuò)增片段均編碼1個多聚蛋白（395 aa），包含部分NIb蛋白（107 aa）和完整的CP蛋白（288 aa）。BLASTp分析發(fā)現(xiàn)上述7個分離物與已報道的TuMV多聚蛋白氨基酸序列相似性為96.14%～97.47%。

在NCBI數(shù)據(jù)下載了18個TuMV序列，用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示：所有TuMV分離物可分為WorldB、BasalBR、AsianBR和BasalB 4個組，其中，本研究獲得的7個TuMV分離物與已報道的TuMV太子參分離物TuMVGZ1、TuMVJS2、TuMVSD1、TuMVFJ/ZS11和TuMVFJ/ZS22親緣關(guān)系最近，屬于WorldB組（圖2）。福建的HB1和GX1分離物，與貴州的TuMVGZ1分離物和江蘇的TuMVJS2分離物聚為一支;貴州的CG5分離物和安徽的XC4分離物與福建的TuMVFJ/ZS11和山東的TuMVSD1聚為一支;福建的BL2和貴州的DZ1、DZ2分離物與福建的TuMVFJ/ZS22分離物聚為一支（圖2）。說明侵染太子參的TuMV的種群多樣性與地域沒有明顯相關(guān)性。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹，可以看出TuMV太子參分離物與日本的蕪菁Brassica rapa上的C42J分離物、野甘藍(lán)B.oleracea上的Tu3和KWB778J分離物、浙江的蕓苔B.campestris上的CHZJ26A分離物親緣關(guān)系較近（圖2）。

2.3不同產(chǎn)地太子參BBWV2 CP基因克隆及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

結(jié)合RTPCR檢測結(jié)果，選擇7個BBWV2陽性樣品進(jìn)行CP基因的序列及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，7個樣品分別為福建省的GX2、HB1和BL1，貴州省的DZ24和CG5，安徽省的XC2和XC4。使用BBWV2 CP基因全長擴(kuò)增引物BBWV2CPF和BBWV23464R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)測序確定均為1 891 bp（圖3）。BBWV2 GX2、HB1、BL1、DZ24、CG5、XC2和XC4分離物核苷酸序列均上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，GenBank登錄號分別為：MW192525、MW192520、MW192521、MW192526、MW192522、MW192524和MW192523。經(jīng)BLASTn分析，發(fā)現(xiàn)上述分離物均與日本辣椒Capsicum annuum上分離到的BBWV2 IP分離物（AB018698）相似性最高，核苷酸序列相似性為93.61%～94.25%，氨基酸序列相似性為97.33%～98.50%。分析發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段包含完整的LCP基因和SCP基因，預(yù)測編碼LCP和SCP蛋白分別為402 aa和197 aa，與已報道的BBWV2 CP蛋白序列長度一致。

在NCBI數(shù)據(jù)庫下載了17個BBWV2序列，用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，BBWV1 CP作為遠(yuǎn)源對照。 系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示：本研究獲得的7個分離物與已報道的BBWV2太子參分離物BBWVGZ3、BBWVJS1、BBWVSD1、BBWVHN2 和BBWVFJ/ZS11聚為一支。本研究和已報道的12個BBWV2太子參分離物與日本的辣椒上分離到的BBWV2 IP分離物（AB018698）親緣關(guān)系最近，屬于Ia亞組。福建的HB1、GX2和安徽的XC4與已報道的貴州BBWVGZ3分離物聚為一支，貴州的DZ24與已報道的江蘇BBWVJS1、山東BBWVSD1聚為一支，貴州的 CG5、安徽的XC2與河南BBWVHN2和福建BBWVFJ/ZS11聚為一支，福建的BL1和日本的IP分離物聚為一支（圖4），說明侵染太子參的BBWV2的種群多樣性與地域沒有明顯相關(guān)性。

2.4不同產(chǎn)地太子參CMV CP基因克隆及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

結(jié)合RTPCR檢測結(jié)果，選擇3個CMV陽性樣品進(jìn)行CP基因的序列及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，3個樣品分別為福建省的GX6和HB6，安徽省的XC8。使用CMV CP基因的全長擴(kuò)增引物CMVII931F和CMVII2044R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)測序確定均為1 112 bp（圖5）。CMV GX6、HB6和XC8分離物核苷酸序列均上傳至 NCBI數(shù)據(jù)庫，GenBank登錄號分別為MW192518、MW192517和MW192519。BLASTn 分析發(fā)現(xiàn)，HB6、GX6和XC8分離物分別與我國番茄上的Tsh分離物（DQ249298）、Kin分離物（Z12818）、煙草上的Hnt分離物（KC407999）核苷酸序列相似性最高，核苷酸序列相似性分別為98.02%、98.02%和99.17%，氨基酸序列相似性分別為98.00%、98.17%和100%。使用ORF Finder程序分析發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段編碼完整的CP基因，預(yù)測編 碼CP蛋白的長度為218 aa，與已報道的CMV CP蛋白序列長度一致。

在NCBI數(shù)據(jù)庫下載了15個與上述CMV分離物相似性較高的序列用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，花生矮化病毒Peanut stunt virus（PSV）的ER株系作為遠(yuǎn)源對照。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示：所有CMV分離物可分為Ⅰ組和Ⅱ組，Ⅰ組進(jìn)一步可分成IA亞組和IB亞組。本研究獲得的3個CMV分離物屬于Ⅱ組，其中，安徽省的XC8分離物與中國的番茄Lycopersicon esculentum上的SL分離物，煙草上的Hnt分離物和韓國甘露子Stachys affinis上的Ack2分離物親緣關(guān)系最近，福建省的HB6和GX6分離物單獨聚為一支（圖6）。

3討論

本研究對福建柘榮、貴州施秉縣和丹寨縣、安徽宣城等太子參產(chǎn)區(qū)病毒病發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查，病害樣品病毒檢出率為91.55%，其中，福建柘榮縣和安徽省宣城市的檢出率最高（100%），這可能與太子參種苗帶毒和田間管理粗放有關(guān)。福建省柘榮縣采集的32份樣品均被TuMV和BBWV2復(fù)合侵染，其中5份樣品還混合有CMV侵染，安徽省宣城市的13份樣品BBWV2、TuMV和CMV的檢出率分別為92.31%、46.15%和30.77%，推測該地區(qū)太子參病毒病的主要病原為BBWV2。貴州省施秉縣和丹寨縣的26份樣品中，病毒檢出率為76.92%，其中，TuMV的檢出率最高（69.23%），其次為BBWV2（19.23%），未檢測到CMV，推測該地區(qū)太子參病毒病的主要病原為TuMV（表2）。貴州省施秉縣牛大場鎮(zhèn)牛大場村的6個樣品表現(xiàn)出疑似病毒癥狀，但未檢測到TuMV、BBWV2、CMV和TMV，不排除被其他病毒侵染的可能，需借助高通量測序技術(shù)進(jìn)一步檢測其帶毒情況。

本研究明確了TuMV、BBWV2和CMV福建、貴州、安徽分離物的親緣關(guān)系和分類地位。2015年，匡云波等[8 9]曾對福建、江蘇、湖南、貴州、山東5省太子參TuMV和BBWV2的序列差異性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TuMV和BBWV2的序列差異具有地域性。本研究對福建、貴州和安徽TuMV和BBWV2 CP基因核苷酸序列差異性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)太子參TuMV和BBWV2序列差異不存在地域性，推測序列地域性的消失與種苗跨地域運(yùn)輸有關(guān)。

本次調(diào)研發(fā)現(xiàn)，病毒病已經(jīng)成為威脅太子參生產(chǎn)的重要病害，亟須有效的防控措施。目前，生物或化學(xué)手段對植物病毒病的防治效果有限。因此，控制種苗傳毒，切斷病毒病傳播媒介，仍是當(dāng)前最為有效的病毒病防控手段。太子參主要通過無性繁殖，期間病毒極易通過種苗進(jìn)行傳播。目前，已建立成熟的太子參脫毒繁育體系[13]。建立全面、高效的病毒檢測體系，保證脫毒種苗真正“脫毒”是當(dāng)下亟待解決的關(guān)鍵問題，這對于太子參優(yōu)質(zhì)種苗及優(yōu)勢品種的可持續(xù)種植具有重要意義。

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收稿日期：2020 11 02修訂日期：2020 12 23

基金項目：

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程 （2016-I2M-3-017）;中央本級重大增減支項目（2060302）

* 通信作者

Email：wlding@implad.ac.cn