譚姚姚，何賀賀，王宏萌，梁 蒙，林 宇，黃日波，杜麗琴**

(1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西微生物與酶工程技術(shù)研究中心，廣西南寧 530005；2亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530005)

糖苷類(lèi)化合物通常是指由單糖或多糖的半縮醛羥基與配體兩部分縮合而成的含糖衍生物，配體可以是糖類(lèi)，也可以是非糖類(lèi)物質(zhì)——蛋白質(zhì)、脂肪醇等[1]。糖苷類(lèi)化合物不僅可為生物體提供能量、調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)，而且在生產(chǎn)和生活中使用也非常廣泛[2]。如在醫(yī)藥行業(yè)當(dāng)中，環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物、芳香碳糖苷化合物、三萜苷類(lèi)化合物等糖苷類(lèi)化合物因具有極大的藥理性?xún)r(jià)值，被用于治療營(yíng)養(yǎng)不良、中風(fēng)等多種癥狀[3,4]。在化妝品行業(yè)，α-熊果苷是一種十分有效的美白成分，而甘油糖基化后生成的2-O-(α-D-glucopyranosyl) -sn-glycero是一種很好的保濕劑(Glycoin?)[5,6]。此外，烷基糖苷作為一類(lèi)可降解、毒性低的優(yōu)質(zhì)非離子型表面活性劑被大家所熟知[7]。因此，具有極大應(yīng)用價(jià)值的糖苷類(lèi)化合物引起了人們的研究熱潮。除了直接從自然界獲取外，人們還可以使用多種方法來(lái)合成糖苷類(lèi)化合物，如化學(xué)法、生物催化法等，通過(guò)對(duì)糖類(lèi)或非糖類(lèi)化合物糖基化修飾來(lái)形成新的糖苷鍵，從而合成糖苷類(lèi)化合物。

蔗糖磷酸化酶主要存在于微生物體內(nèi)，屬于糖基水解酶GH13家族。除了能夠水解蔗糖外，蔗糖磷酸化酶還具有催化糖苷鍵轉(zhuǎn)移的作用[8,9]，因此它可以作為一種生物催化劑，將底物合成糖苷類(lèi)化合物[10]。Wang等[11]利用蔗糖磷酸化酶合成曲二糖，使得益生元曲二糖得到了大規(guī)模的生產(chǎn)；對(duì)減輕過(guò)敏性皮炎癥狀有益的低聚糖——蜜二糖也可以通過(guò)蔗糖磷酸化酶來(lái)催化合成[5]；經(jīng)過(guò)蔗糖磷酸化酶的作用，可以將苯二酚分子催化加上葡萄糖基，形成具有美白作用的熊果苷[12]。Gudiminchi等[13]利用蔗糖磷酸化酶對(duì)維生素C進(jìn)行葡萄糖糖基化，使其不穩(wěn)定性得到很大程度的改善。此外，蔗糖磷酸化酶還可對(duì)兒茶素[14]、白藜蘆醇[15]、甜菊醇[16]、槲皮素[17]等進(jìn)行轉(zhuǎn)糖苷催化。因此，蔗糖磷酸化酶在轉(zhuǎn)糖苷催化方面有較大的應(yīng)用價(jià)值。目前，未有關(guān)于丁酸梭菌Clostridiumbutyricum中蔗糖磷酸化酶的相關(guān)報(bào)道，本研究對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)和轉(zhuǎn)糖苷功能進(jìn)行探討，并進(jìn)一步討論不同來(lái)源的蔗糖磷酸化酶的差異性，以挖掘出具有利用價(jià)值的蔗糖磷酸化酶，提高其在工業(yè)應(yīng)用中的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

丁酸梭菌C.butyricumDSM10702、表達(dá)載體pQE30、感受態(tài)細(xì)胞Escherichia.coliXL1-blue等均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器

試劑：PrimerSTARTMHS DNA聚合酶、T4DNA 連接酶、dNTP、λ/Hind Ⅲ DNA marker、限制性?xún)?nèi)切酶BamH Ⅰ、PstⅠ等均購(gòu)買(mǎi)自Takara(寶)生物股份有限公司；膠回收/PCR純化試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒以及純化試劑盒均購(gòu)自Fluxion Biosciences公司；蔗糖購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)、兒茶素等購(gòu)買(mǎi)自上海源葉生物科技有限公司。

儀器：PCR儀(T-Gradient Thermoblock、MJ Reserch PTC-2000，蘇州亞凡生物技術(shù)有限公司)，離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5415D，上海智巖科學(xué)儀器有限公司)，高效液相色譜儀(Agilent G1314F，杭州瑞析科技有限公司)，隔水式恒溫培養(yǎng)箱(Binder，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)，恒溫振蕩搖床(ZHWY-211B，上海知楚儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 蔗糖磷酸化酶基因的克隆

通過(guò)對(duì)高通量全基因組從頭測(cè)序丁酸梭菌的結(jié)果分析，查找糖基水解酶13家族中被注釋為蔗糖磷酸化酶的核苷酸序列，并對(duì)丁酸梭菌的蔗糖磷酸化酶基因所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)組件分析，充分了解其結(jié)構(gòu)，然后利用軟件Vector NTI Advance 11.5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，所設(shè)計(jì)的引物序列如下(其中下劃線(xiàn)表示酶切位點(diǎn))：

cbsp-F：5′-CTCGGATCCGATAAGATAAAA-

AATGAAATAATG-3′；

cbsp-R：5′-CTACTGCAGCTCAATAGTAAA-

ATCATAACTCTT-3′。

PCR程序：98℃ 3 min；98℃ 15 s，56.5℃ 10 s，72℃ 110 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。將PCR擴(kuò)增所得的DNA片段及提取的質(zhì)粒pQE30分別經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切處理后，在T4DNA 連接酶下進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化到E.coliXL1-blue中。轉(zhuǎn)化子送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒命名為pQE30-cbsp。

1.2.2 重組酶Cbsp的生物信息學(xué)分析

在http://smart.embl-heidelberg.de/網(wǎng)站對(duì)蔗糖磷酸化酶基因cbsp編碼的氨基酸序列進(jìn)行SMART Main page分析，在http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/網(wǎng)站對(duì)重組酶Cbsp進(jìn)行SignalP 4.1信號(hào)肽分析。

1.2.3 重組酶Cbsp的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliXL1-blue感受態(tài)細(xì)胞中，于37℃、220 r·min-1培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol·L-1的 IPTG，在20℃、180 r·min-1條件下誘導(dǎo)22 h，離心收集菌體。超聲儀破胞后經(jīng)鎳親和層析(Ni-NTA)純化重組酶Cbsp，并進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。

1.2.4 重組酶Cbsp的酶學(xué)性質(zhì)分析

酶活力測(cè)定方法[18]：取170 μL的磷酸-檸檬酸緩沖液、20 μL 10%的蔗糖溶液，放置在最適溫度水浴鍋中水浴2-3 min后,加入10 μL適當(dāng)稀釋的酶液，精確反應(yīng)20 min,然后加入400 μL DNS終止反應(yīng)，沸水浴5 min顯色。冷卻至室溫后，取200 μL混合液置于96孔酶標(biāo)板中，在540 nm波長(zhǎng)處讀取樣品的吸光值。對(duì)照為用10 μL滅活后的酶液替代原反應(yīng)體系的酶液。酶活單位(U/mL)=(葡萄糖含量×103×稀釋倍數(shù))/(198.17×20×0.01)，其中：198.17為葡萄糖分子量，20為反應(yīng)時(shí)間(min)，0.01為粗酶液體積(mL)。

(1) pH值對(duì)重組酶的影響。

在常溫條件下，測(cè)定不同pH值(3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0)的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液對(duì)重組酶酶活力的影響，得到重組酶的最適pH值。將重組酶保存在不同pH值(3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸；8.0，8.5，9.0的硼酸-硼砂；9.0，9.5，10.0，10.5的甘氨酸-氫氧化鈉)的緩沖液中，于4℃冰箱放置12 h；然后，根據(jù)酶活力測(cè)定方法，將經(jīng)不同pH值緩沖液處理過(guò)的酶液加入反應(yīng)體系中，測(cè)定重組酶的pH穩(wěn)定性。每組3個(gè)平行，計(jì)算不同pH值下重組酶的酶活力。相對(duì)酶活力是指以最高酶活力為100%，計(jì)算出其他條件下酶活力的相對(duì)比例。

(2)溫度對(duì)重組酶的影響。

在最適pH值條件下，測(cè)定不同反應(yīng)溫度(25-65℃，間隔5℃)對(duì)重組酶酶活力的影響，得到重組酶的最適溫度。將重組酶放置在不同溫度(4℃、35℃、40℃、45℃和50℃)下，測(cè)定隨時(shí)間變化重組酶的酶活力，即重組酶的熱穩(wěn)定性。每組3個(gè)平行，計(jì)算不同溫度條件下重組酶的酶活力。

(3)Km和Vmax的測(cè)定。

在最適pH值和最適溫度條件下，測(cè)定以不同濃度(1.5-234.0 mmol·L-1)蔗糖為底物時(shí)重組酶的酶活力，使用軟件GraphPad Prism 5通過(guò)非線(xiàn)性回歸分析擬合出重組酶的Km、Vmax。

(4)化學(xué)試劑對(duì)重組酶的影響。

在最適反應(yīng)條件下，分別測(cè)定N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、2,3-丁二醇等醇類(lèi)(各試劑濃度設(shè)為5%、10%、15%、20%、25%、30%，V∶V)對(duì)重組酶酶活力的影響，同時(shí)還測(cè)定0.05%(W∶V,下同)SDS、1%(V∶V，下同)Triton X-100、5%(V∶V，下同)Tween-80、0.01 mol·L-1咪唑、4 mol·L-1脲、1%(V∶V，下同)巰基乙醇等蛋白質(zhì)還原劑和變性劑對(duì)重組酶酶活力的影響。以不添加化學(xué)試劑的反應(yīng)作為對(duì)照，每組3個(gè)平行，計(jì)算不同濃度化學(xué)試劑存在時(shí)重組酶的酶活力。

1.2.5 轉(zhuǎn)糖苷功能的測(cè)定

(1)以糖類(lèi)和糖醇類(lèi)為受體。

在最適反應(yīng)條件下，分別以終濃度15% (V∶V,下同)的G-1-P和8% (W∶W,下同)的蔗糖為糖基供體，以終濃度10% (V∶V)的D-/L-阿拉伯糖、L-山梨糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-果糖、D-木糖、D-甘露糖、纖維二糖、海藻糖、麥芽糖、甘露醇和木糖醇為糖基受體，加入適量的純酶反應(yīng)12 h后煮沸10 min終止反應(yīng)，通過(guò)HPLC檢測(cè)產(chǎn)物。

檢測(cè)條件：儀器設(shè)備為Agilent 1260系列液相色譜儀、示差折光檢測(cè)器，色譜柱為Alltima Aminoz氨基柱(4.6 μm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為70% (V∶V)乙腈，等度洗脫，進(jìn)樣量10 μL，柱溫25°C，流速1 mL·min-1。

(2)以醇類(lèi)為受體。

①在最適反應(yīng)條件下，分別以終濃度15%的G-1-P和8%的蔗糖為糖基供體，以終濃度5%(V∶V)的甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、乙二醇和丙三醇為糖基受體，加入適量的純酶反應(yīng)12 h后煮沸10 min終止反應(yīng)，通過(guò)HPLC檢測(cè)產(chǎn)物。

檢測(cè)條件：儀器設(shè)備為Agilent 1260系列液相色譜儀、示差折光檢測(cè)器，色譜柱為Alltima Aminoz氨基柱(4.6 μm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為83% (V∶V)乙腈，等度洗脫，進(jìn)樣量10 μL，柱溫25℃，流速1 mL·min-1。

②在最適反應(yīng)條件下，分別以終濃度15% 的G-1-P和8%的蔗糖為糖基供體，以200 μL正己醇、正辛醇、正壬醇和正癸醇為糖基受體，加入適量的純酶反應(yīng)12 h后煮沸10 min終止反應(yīng)，通過(guò)HPLC檢測(cè)產(chǎn)物。

檢測(cè)條件：儀器設(shè)備為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為75% (V∶V)甲醇，等度洗脫，進(jìn)樣量10 μL，流速0.8 mL·min-1。

(3)以烷基糖苷類(lèi)物質(zhì)為受體。

在最適反應(yīng)條件下，分別以終濃度15%的G-1-P和8%的蔗糖為糖基供體，以終濃度1%的己基-β-D-葡萄糖苷、庚基-β-D-葡萄糖苷、N-辛基-β-D-葡萄糖苷、壬基-β-D-葡萄糖苷和0.5%的癸基-β-D-葡萄糖苷為糖基受體，加入適量的純酶反應(yīng)12 h后煮沸10 min終止反應(yīng)，通過(guò)HPLC檢測(cè)產(chǎn)物。

檢測(cè)條件：儀器設(shè)備為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為75% (V∶V)甲醇，等度洗脫，進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL·min-1。

(4)以L(fǎng)-抗壞血酸和兒茶素類(lèi)物質(zhì)為受體。

在最適反應(yīng)條件下，分別以終濃度15%的G-1-P和8%的蔗糖為糖基供體，以終濃度120 mmol·L-1L-抗壞血酸和終濃度35 mmol·L-1兒茶素為糖基受體，加入適量的純酶反應(yīng)12 h后煮沸10 min終止反應(yīng)，通過(guò)HPLC檢測(cè)產(chǎn)物。

L-抗壞血酸檢測(cè)條件：儀器設(shè)備為Agilent 1260系列液相色譜儀、紫外檢測(cè)器，色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為98% (V∶V)甲醇，等度洗脫，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30℃，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm。

兒茶素檢測(cè)條件：儀器設(shè)備為Agilent 1260系列液相色譜儀、紫外檢測(cè)器，色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為95% (V∶V)的甲醇，等度洗脫，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35°C，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

蔗糖磷酸化酶的糖苷轉(zhuǎn)化率=(實(shí)驗(yàn)組底物減少量/對(duì)照組底物的量)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析及基因的克隆

經(jīng)SMART Main page分析發(fā)現(xiàn)，其N(xiāo)端23-382位氨基酸為α-淀粉酶結(jié)構(gòu)域[圖1(a)]。結(jié)合SignalP 4.1分析，結(jié)果顯示重組酶Cbsp不含信號(hào)肽[圖1(b)]。以丁酸梭菌的基因組DNA為模板，利用引物cbsp-F、cbsp-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因，得到一條大小約為1.5 kb的特異性條帶，測(cè)序正確后將其命名為cbsp[圖1(c)]。

圖1 蔗糖磷酸化酶生物信息學(xué)分析及重組質(zhì)粒酶切電泳圖

2.2 重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

如圖2所示，含有重組質(zhì)粒的菌株和重組酶Cbsp純化物在約55 kDa大小處均有明顯的蛋白質(zhì)特征條帶，與理論分子質(zhì)量一致，可進(jìn)行下一步測(cè)定。

圖2 Cbsp的SDS-PAGE分析

2.3 重組酶Cbsp的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 溫度和pH值對(duì)酶活力的影響

如圖3(a)所示，Cbsp的最適pH值為7.0，在 pH值為6.0-7.5時(shí)可以保持60%以上的相對(duì)酶活力，當(dāng)pH值大于7.5時(shí)，Cbsp酶活力急劇下降；當(dāng)pH值達(dá)到8.0時(shí)，Cbsp僅剩20%左右的相對(duì)酶活力。如圖3(b)所示，Cbsp的最適溫度為45℃，在35-50℃時(shí)能保持40%以上的相對(duì)酶活力，當(dāng)溫度大于55℃時(shí)則完全失活，說(shuō)明Cbsp熱穩(wěn)定性不佳，會(huì)對(duì)后續(xù)相關(guān)功能的研究造成一定的影響。如圖3(c)(d)所示，在35℃、40℃和4℃條件下保存36 h，Cbsp的相對(duì)酶活力仍然可以保持在80%以上，在45℃條件下保存42 h后，酶活力完全喪失，半衰期為210.4 min；在50℃保存0.5 h相對(duì)酶活力僅殘余20%，1 h后酶活力完全失去，半衰期為9.57 min。如圖3(d)所示，Cbsp在pH值為6.5-9.0時(shí)酶活力較為穩(wěn)定，能夠保持80%以上的相對(duì)酶活力，表現(xiàn)出較好的堿耐受性。

圖3 pH值和溫度對(duì)Cbsp的影響

2.3.2 重組酶Cbsp的Km和Vmax

利用軟件GraphPad Prism 5，通過(guò)雙倒數(shù)作圖法擬合出Cbsp的Km為(62.4±4.749) mmol·L-1，Vmax為(957±23.29) μmol·mg-1·min-1，如圖4所示。

圖4 Cbsp的Km和Vmax

2.3.3 化學(xué)試劑對(duì)酶活力的影響

如圖5:(a)-(c)所示，除了低濃度的DMSO和甲醇對(duì)酶活力有輕微的促進(jìn)作用外，其他一元醇、二元醇和有機(jī)試劑都不同程度地抑制酶活力，并且抑制強(qiáng)度隨有機(jī)試劑濃度的增大而增強(qiáng)。如圖5(d)所示，1% Triton X-100、5% Tween-80和20 mmol·L-1DTT 對(duì)于酶活力具有促進(jìn)作用，其中20 mmol·L-1DTT可明顯提高酶活力；0.05% SDS和4 mol·L-1脲則使酶完全失去活力。由此可知，后續(xù)研究可以通過(guò)試劑來(lái)增強(qiáng)重組酶的酶活力，促進(jìn)底物的溶解，進(jìn)而提高其轉(zhuǎn)化效率。

圖5 化學(xué)試劑對(duì)于Cbsp的影響

2.4 轉(zhuǎn)糖苷功能的測(cè)定

以終濃度15%的G-1-P為糖基供體時(shí)，Cbsp對(duì)D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-山梨糖、木糖醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、乙二醇、丙三醇、L-抗壞血酸、(-)-兒茶素和己基-β-D-吡喃葡萄糖苷都具有轉(zhuǎn)糖苷活性；以終濃度8%的蔗糖為供體時(shí)，Cbsp僅對(duì)己基-β-D-吡喃葡萄糖苷和(-)-兒茶素有轉(zhuǎn)糖苷活性。其中以終濃度8%的蔗糖為糖基供體時(shí)，Cbsp對(duì)終濃度1%的己基-β-D-吡喃葡萄糖苷具有較高的轉(zhuǎn)糖苷能力，轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。從圖6可知，以終濃度8%的蔗糖為糖基供體時(shí)，Cbsp對(duì)己基-β-D-吡喃葡萄糖苷的轉(zhuǎn)糖苷效率為42.0%[圖6(a)箭頭所指為轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物]。而當(dāng)以終濃度15%的G-1-P為糖基供體時(shí)，己基-β-D-吡喃葡萄糖苷的轉(zhuǎn)化率為5.5%[圖6(b)箭頭所指為轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于以蔗糖為糖基供體時(shí)的轉(zhuǎn)化效率。另外，Cbsp只有在以蔗糖為糖基供體時(shí)才對(duì)(-)-兒茶素具有轉(zhuǎn)糖苷活性，其結(jié)果如圖7所示。從圖7可以看出Cbsp催化(-)-兒茶素轉(zhuǎn)糖苷生成了兒茶素葡萄糖苷[圖7(a)箭頭所指]，經(jīng)計(jì)算其轉(zhuǎn)化率約為6.8%。

圖6 以己基-β-D-吡喃葡萄糖苷為受體時(shí)Cbsp的轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物分析

圖7 以-(-)兒茶素為受體時(shí)Cbsp的轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物分析

3 討論

如今，隨著蔗糖磷酸化酶的應(yīng)用愈加廣泛，對(duì)于其性能的研究需求也越來(lái)越大。何賀賀等[19]研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自腸膜明串珠菌Leuconostocmesenteroides的蔗糖磷酸化酶的最適反應(yīng)溫度為37℃，來(lái)源于BacillusmegateriumNCIB 8508的蔗糖磷酸化酶最適反應(yīng)溫度為50℃。來(lái)自Bifidobacteriumlongum的蔗糖磷酸化酶在20-50℃時(shí)，相對(duì)酶活性為98%以上；在60-90℃時(shí)，相對(duì)酶活性為70%以上[18]。本研究中的重組酶Cbsp最適反應(yīng)溫度是45℃，在40℃以下保存36 h時(shí)酶只有80%的相對(duì)活性，一旦溫度上升到50℃且只保存1 h酶便會(huì)完全失活。這些研究不僅表明了不同的來(lái)源會(huì)造成酶活力的差異，而且還說(shuō)明了大多數(shù)的蔗糖磷酸化酶都不是嗜熱型酶。

本研究中的Cbsp與Kitao等[20]報(bào)道的來(lái)自腸膜明串珠菌的蔗糖磷酸化酶相比，都對(duì)部分單糖及糖醇類(lèi)具有受體特異性，有利于對(duì)人體健康十分有幫助的益生元低聚糖如曲二糖等的合成，這些益生元通過(guò)蔗糖磷酸化酶轉(zhuǎn)糖苷功能來(lái)催化合成，極大地降低了工業(yè)成本，帶來(lái)非常大的經(jīng)濟(jì)效益。另外，本研究中的重組酶Cbsp還對(duì)烷基糖苷類(lèi)物質(zhì)己基-β-D-吡喃葡萄糖苷具有42.0%的轉(zhuǎn)糖苷效率，能夠有效地發(fā)生轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)，得到的產(chǎn)物可以作為一類(lèi)具有低刺激度、可生物降解、毒性低、無(wú)污染等優(yōu)良性狀的新型的非離子表面活性劑，在食品、洗滌劑、農(nóng)藥和醫(yī)療等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景[21]。

本研究的重組酶Cbsp雖對(duì)(-)-兒茶素具有轉(zhuǎn)糖苷活性，但轉(zhuǎn)化率僅有6.8%，而且部分受體底物無(wú)法發(fā)生轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)，可能是由于受體親和力太低，無(wú)法與反應(yīng)系統(tǒng)中的水分子等其他物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)。De Winter等[22]利用液態(tài)雙相體系進(jìn)行糖基化轉(zhuǎn)換，大大提高了轉(zhuǎn)糖苷效率，證明了親和力低會(huì)影響糖基化反應(yīng)。因此，水相系統(tǒng)、非水相系統(tǒng)和微水相系統(tǒng)等不同的反應(yīng)系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)有明顯的影響。下一步可改善反應(yīng)體系，以提高轉(zhuǎn)糖苷活性。

4 結(jié)論

本研究克隆了來(lái)源于丁酸梭菌DSM10702中的蔗糖磷酸化酶基因cbsp，并在感受態(tài)細(xì)胞E.coliXL1-blue中成功實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。重組酶蛋白分子質(zhì)量大小約為55 kDa。以蔗糖為底物時(shí)，蔗糖磷酸化酶最適反應(yīng)溫度為45℃，最適pH值為7.0，在35-45℃、pH值6.0-9.0條件下能保持酶活力穩(wěn)定；Km為(62.4±4.749) mmol·L-1，Vmax為(957±23.29) μmol·mg-1·min-1。當(dāng)G-1-P為糖基供體時(shí)，Cbsp對(duì)于大部分單糖及糖醇類(lèi)受體表現(xiàn)出轉(zhuǎn)糖苷活性，對(duì)(-)-兒茶素、己基-β-D-吡喃葡萄糖苷和L-抗壞血酸表現(xiàn)出一定程度的轉(zhuǎn)糖苷活性。對(duì)來(lái)自丁酸梭菌的蔗糖磷酸化酶的酶學(xué)性質(zhì)的研究，為蔗糖磷酸化酶相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)增添了新的內(nèi)容，但相比之下，重組酶Cbsp相對(duì)較弱的熱穩(wěn)定性十分不利于工業(yè)應(yīng)用，未來(lái)可加強(qiáng)這方面的研究改造。