王 慧，鐘蘭萍，張先群，黃 威，田星雙，姜 梅，楊思思

(貴陽學(xué)院/貴州省大鯢可持續(xù)利用協(xié)同創(chuàng)新中心/貴州省山地珍稀動物與經(jīng)濟昆蟲重點實驗室，貴陽 550005)

【研究意義】中國大鯢(Andriasdavidianus)俗稱“娃娃魚”，隸屬脊索動物門(Chordata)，兩棲綱(Amphibian)，有尾目(Urodela)，隱鰓鯢科(Cryptobranchidae)，大鯢屬(Andrias)。中國大鯢是我國獨有的珍貴物種，也是世界上現(xiàn)存?zhèn)€體最大的有尾兩棲動物[1]。近年來，由于野生大鯢資源急劇下降，人工養(yǎng)殖也逐漸興起，但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴張，大鯢病害亦日益嚴重[2-5]。因此，探究大鯢被病原菌侵染后的免疫響應(yīng)情況具有重要的科學(xué)意義。【前人研究進展】細菌性病害是引發(fā)大鯢疾病的主要因素，病原菌主要有嗜水氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌、熒光假單胞菌、遲鈍愛德華氏菌和維氏氣單胞菌等[6]。經(jīng)生理生化及分子生物學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，大鯢腐皮膚病由維氏氣單胞菌、點狀產(chǎn)氣單胞菌和嗜水氣單胞菌3種病原菌引起；敗血病由弗氏檸檬酸桿菌感染引起；大鯢爛尾病由熒光假單胞菌引起[7-11]。大鯢體內(nèi)淋巴系統(tǒng)不發(fā)達，不能通過適應(yīng)性免疫抵抗病原微生物侵害，而抗菌肽是大鯢通過非特異性途徑抵御病原微生物侵害的主要成分?？咕木哂锌笹-細菌、G+細菌、真菌、腫瘤細胞和寄生蟲等活性，具備廣譜高效抗菌、增強機體免疫等特點，是機體天生免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分[12-14]?？咕姆肿涌扇〈鷻C體脂多糖與細菌表面的結(jié)合部位(Ca2+、Mg2+)反應(yīng)，從而破壞細菌細胞膜的穩(wěn)定性，使其發(fā)生溶解，形成孔洞[15-16]。從魚類中分離獲得的抗菌肽對單核細胞李斯特菌和一些導(dǎo)致食品腐敗微生物具有抑菌的活性[17]。抗菌肽實現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)可以通過調(diào)整信號通路來調(diào)控抗炎和促炎的反應(yīng)，調(diào)節(jié)傷口的修復(fù)和細胞凋亡。與針對患病大鯢所使用的抗生素相比，由生物體產(chǎn)生抗菌肽不會產(chǎn)生耐藥性?！颈狙芯壳腥朦c】前人研究大都是觀察大鯢感染病原菌后出現(xiàn)的癥狀，目前兩棲無尾類動物蛙類是探究抗菌肽對細菌侵染響應(yīng)的主要試驗對象，而從分子層面分析大鯢感染病原菌后其組織對某個抗菌肽基因的響應(yīng)情況研究少有報道[18-21]。【擬解決的關(guān)鍵問題】AdCath4為大鯢抗菌肽家族基因中的一員，探究大鯢感染病原菌后AdCath4基因?qū)Σ≡拿庖唔憫?yīng)情況，為大鯢抗菌肽基因在病原菌侵染后的響應(yīng)提供分子層面的理論依據(jù)，對其機體啟動天然的免疫應(yīng)答反應(yīng)研究具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 試驗地點及材料

試驗在貴州省山地珍稀動物與經(jīng)濟昆蟲重點實驗室進行。

供試大鯢幼苗60尾，規(guī)格為(270±30) g/尾，購自貴州省翔盛大鯢繁養(yǎng)有限責(zé)任公司。嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)和熒光假單胞菌(Pesudomonasfluorescent)均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 方法

1.2.1 菌種菌液制備 將嗜水氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌以及熒光假單胞菌分別接種于LB固體培養(yǎng)基上，并置于37 ℃恒溫的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床增菌培養(yǎng)24 h，分別用紫外分光光度計檢測其OD值，直到OD600=0.6，將細菌懸液濃度配制為1×108CFU/mL備用。

1.2.2 大鯢病原菌接種 供試大鯢幼苗在相同條件下馴化1周，按15尾/組分為4組，以腹腔注射的方式分別注射0.5 mL/尾的嗜水氣單胞菌懸液、弗氏檸檬酸桿菌懸液、熒光假單胞菌懸液和1倍的磷酸緩沖鹽溶液(1×PBS)(CK)。在病原菌侵染的0、12、24、36和48 h后，各處理分別取3尾大鯢進行無菌解剖，取其皮膚和脾臟組織暫存于液氮中，用于提取總RNA。

1.2.3 RNA提取 按照TransZol試劑盒的試驗步驟分別抽提處理組織的總RNA。使用Nanodrop 2000核酸蛋白濃度測定儀檢測和瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和質(zhì)量，將合格的總RNA溶液置于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩Ｃ總€樣品重復(fù)3次。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA 進行第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄按20.0 μL體系配制混合溶液：Oligo dT Primer 1.0 μL，RI Enzyme Mix 1.0 μL，2×ES Reaction Mix 10.0 μL，RNA 4.0 μL，RNase-free Water 4.0 μL。PCR反應(yīng)條件：37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃ 5 s。保存于-20 ℃冰箱備用。每個樣品重復(fù)3次。

1.2.5 qRT-PCR 按TransScript Top Green qPCR SuperMix試劑盒說明，qPCR反應(yīng)體系20.0 μL：Top Green qPCR SuperMix 10.0 μL，RNase-free ddH2O 7.0 μL，上、下引物各1.0 μL，cDNA 1.0 μL。熒光定量PCR儀的反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，55 ℃ 退火15 s，72 ℃延伸2 min，38個循環(huán)，72 ℃進行終延伸。每個樣品重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用 Excel整理獲得的數(shù)據(jù)，AdCath4基因在皮膚、脾臟組織中的相對表達量采用2-△△Ct法計算。數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標準誤表示，利用SPSS 19.0中的單因素方差分析(ANOVA),假設(shè)方差齊性(LSD、S-N-K)對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，運用Sigma Plot 12.5制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AdCath4基因的 CDS序列

轉(zhuǎn)錄組測序分析獲得大鯢抗菌肽AdCath4基因的CDS全長序列，運用DNAMAN軟件對測序結(jié)果(圖1)分析表明，AdCath4基因的開放閱讀框全長為549 bp，編碼183個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為19 579 Da。使用SignalP-5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)預(yù)測該序列的信號肽為1～19氨基酸MESLVRLTLVLGVITVANC。根據(jù)AdCath4基因序列，運用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計1對qPCR引物，其上、下游引物分別為20 bp，同時篩選出RPL43、EF2作為內(nèi)參基因(表1)，以便用于開展之后的不同組織基因表達量試驗，篩選出相對表達量高的組織進行病原菌侵染試驗。

起始密碼子ATG和終止密碼子TGA黑色加粗；*為終止密碼子的推導(dǎo)結(jié)果Start codon ATG and stop codon TGA are bold in black; * is the derivation of the stop codon圖1 大鯢抗菌肽基因AdCath4的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of A. davidianus antimicrobial peptide gene AdCath 4

2.2 AdCath4基因在大鯢不同組織器官中的相對表達量

從圖2看出，大鯢抗菌肽AdCath4基因在心臟、皮膚、肝臟、腸、胃、肺、脾臟組織器官中均有表達，在皮膚器官中的相對表達量顯著高于其他器官，其次是在脾臟中的相對表達量。因此，選取皮膚和脾臟器官進行病原菌侵染試驗。

表1 目的基因和內(nèi)參基因的qPCR引物序列

2.3 大鯢感染不同病原菌后AdCath4基因在皮膚和脾臟組織中的相對表達量

2.3.1 嗜水氣單胞菌 從圖3看出，感染嗜水氣單胞菌的大鯢皮膚和脾臟組織中AdCath4基因在不同時間均有表達。在皮膚組織中，接種處理AdCath4基因的相對表達量在24～48 h高于對照，在接種48 h后的相對表達量達峰值且相對表達量較對照高7.21倍，表明AdCath4在感染嗜水氣單胞菌大鯢皮膚組織中的表達調(diào)控響應(yīng)積極。在脾臟組織中，接種和對照處理AdCath4基因的相對表達量均較低，接種處理低于對照；其中，24 h后接種處理的相對表達量為對照的20.85%，表明AdCath4在感染嗜水氣單胞菌大鯢脾臟組織中的表達調(diào)控響應(yīng)不積極。

2.3.2 弗氏檸檬酸桿菌 從圖4看出，感染弗氏檸檬酸桿菌的大鯢皮膚和脾臟組織中AdCath4基因在不同時間均有表達。在皮膚組織中，接種處理AdCath4基因的相對表達量在36～48 h顯著高于對照，在36 h時最高，是對照組的4.19倍。在脾臟組織中，接種處理組和對照AdCath4基因的相對表達量均較低，且接種處理均低于對照，24 h時相對表達量為對照的5.61%。

不同小寫字母表示基因表達量在不同組織器官間差異顯著(P<0.05)Different lowercase letters indicate significant differences in gene expression among different tissues圖2 AdCath4基因在不同組織器官中的相對表達量Fig.2 Relative expression of AdCath4 in different tissues

同一時間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Different lowercase letters at the same time point represent significant difference,the same as below圖3 大鯢接種嗜水氣單胞菌后AdCath4基因在其皮膚和脾臟組織中的相對表達量Fig.3 Relative expression of AdCath4 in the skin and spleen of A.davidianus infected with A. hydrophila

圖4 大鯢接種弗氏檸檬酸桿菌后AdCath4基因在其皮膚和脾臟組織中的相對表達量Fig.4 Relative expression of AdCath4 in skin and spleen of A. davidianus infected with C. freundii

圖5 大鯢接種熒光假單胞菌后AdCath4基因在其皮膚和脾臟組織中的相對表達量Fig.5 Relative expression of AdCath4 in skin and spleen of A. davidianus infected with P. fluorescens

2.3.3 熒光假單胞菌 從圖5看出，在感染熒光假單胞菌后AdCath4基因在大鯢皮膚和脾臟組織中的不同時間均有表達。皮膚組織中，接種處理AdCath4基因的相對表達量在24～36 h高于對照，而在其他時間則低于對照。在脾臟組織中，接種處理組和對照AdCath4基因的相對表達量均較低，且各時間接種處理均低于對照，24 h時相對表達量為對照的21.71%。

3 討 論

動物機體受到外界病原微生物侵染時自發(fā)產(chǎn)生用于抵御侵害、保證機體維持正常生理活動的免疫因子?？咕氖且环N具有生物抗性成分、可抵抗病原物感染的生物活性多肽，且廣泛分布于機體的各組織中。由于抗菌肽具有增強免疫和修復(fù)創(chuàng)傷的功能，因此在動物疾病的預(yù)防和治療上被廣泛運用[22-23]。嗜水氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌和熒光假單胞菌是常見的致病于人、畜及水生動物的病原菌。大鯢感染嗜水氣單胞菌會引發(fā)腐皮病和爛腳病，感染弗氏檸檬酸桿菌引起敗血病，感染熒光假單胞菌則引發(fā)腹水病和爛尾病等[7-10]。

抗菌肽的免疫活性主要表現(xiàn)在調(diào)節(jié)促炎和抗炎反應(yīng)，促進細胞分化，直接影響適應(yīng)性免疫，調(diào)節(jié)機體自噬等，而皮膚作為抵御微生物侵染的第一道屏障，在與病原微生物互作的過程中，抗菌肽基因參與免疫調(diào)節(jié)過程，表現(xiàn)出積極響應(yīng)[24-25]。本研究結(jié)果表明：AdCath4基因在皮膚組織中的相對表達量最高，在脾臟組織中的相對表達量次之。大鯢在感染嗜水氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌和熒光假單胞菌后，皮膚組織中AdCath4基因在48、36～48和24 h相對表達量顯著高于對照，脾臟組織中相對表達量則低于對照，且均在接種12 h后顯著下降。說明AdCath4基因在大鯢皮膚組織中免疫響應(yīng)積極，感染后皮膚免疫應(yīng)答反應(yīng)明顯；而AdCath4在大鯢脾臟組織中免疫響應(yīng)不積極。

4 結(jié) 論

大鯢抗菌肽AdCath4基因的開放閱讀框全長為549 bp，編碼183個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為19 579 Da。大鯢抗菌肽AdCath4基因在大鯢的心臟、皮膚、肝臟、腸、胃、肺、脾臟組織器官中均有表達，在皮膚器官中的相對表達量顯著高于其他器官，在脾臟組織中的相對表達量次之。大鯢感染嗜水氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌和熒光假單胞菌后，AdCath4基因在大鯢皮膚組織中免疫響應(yīng)積極，而AdCath4在大鯢脾臟組織中免疫響應(yīng)不積極。