張雪敏， 李佳敏， 康圣楠， 李玉舒， 梁佳惠， 張銘芳， 張秀海， 于曉南， 杜運(yùn)鵬

(1.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，北京 100083；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)花卉與景觀生態(tài)研究所, 北京100097；3.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 102442)

百合為百合科(Lilaceae)百合屬(Lilium)植物，是重要的藥食同源植物之一[1]，在北溫帶和亞熱帶地區(qū)分布廣泛。中國(guó)是百合屬的起源和分布中心之一，具有豐富的百合資源[2]。百合經(jīng)常發(fā)生病毒性感染，病毒性感染往往會(huì)導(dǎo)致百合種球的數(shù)量和品質(zhì)下降，最終造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。據(jù)報(bào)道，有10種以上的不同病毒可以造成各地百合的感染[5-7]。其中百合無(wú)癥狀病毒(LSV)、黃瓜花葉病毒(CMV)和百合斑駁病毒病毒(LMoV)被認(rèn)為是最具危害性的種類(lèi)[8]。因此百合繁殖器官抗性的提高或者自身毒性的降低，對(duì)于百合產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。研究表明，在卷丹中珠芽攜帶的病毒種類(lèi)低于其他繁殖器官[8]。在眾多百合資源中，卷丹是具有珠芽發(fā)生能力的種類(lèi)之一。卷丹是在中國(guó)分布范圍最廣的百合科百合屬植物，其花大色艷，抗性強(qiáng)，兼具觀賞、食用、藥用價(jià)值，為中國(guó)食用百合的主要種，種植面積廣，產(chǎn)業(yè)價(jià)值高[9-10]。但卷丹一般為三倍體，難以通過(guò)有性繁殖方式擴(kuò)大種群。因此，珠芽被視為卷丹極具開(kāi)發(fā)潛力的繁殖方式。目前對(duì)珠芽的研究集中在解剖學(xué)和生理學(xué)層面，包括珠芽發(fā)生發(fā)育的組織學(xué)觀察，以及珠芽形成過(guò)程內(nèi)源激素的變化，但對(duì)其發(fā)生發(fā)育的分子機(jī)理的研究很少[11]。珠芽著生于百合的葉腋處，多被認(rèn)為是腋生器官，在其他植物當(dāng)中，對(duì)于葉腋分生組織的形成、腋生器官的啟動(dòng)與生長(zhǎng)，已經(jīng)有一定的研究基礎(chǔ)[12-15]。其中，MADS-box(MCM1/AGAMOUS/DEFICIENS/SRF)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是植物中研究最多的家族之一，這個(gè)家族的成員參與多種植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[16]。最初，MADS-box基因只是被作為花器官中重要的參與者，但近年越來(lái)越多的研究揭示，MADS-box基因在幾乎所有器官的形態(tài)發(fā)生上具有重要的功能，其貫穿植物的整個(gè)生命周期[17]。研究表明，當(dāng)龍舌蘭(Agavetequilana)受精失敗或去除頂端花芽時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)珠芽的形成，且AtMADS1/2/4/6/7參與調(diào)控珠芽的形成[18-19]；狗尾草(Setariaviridis)的simads34突變體能夠顯著改變狗尾草的花序結(jié)構(gòu)，且狗尾草的次生分枝數(shù)量顯著增加[20]；沉默POTM1(potatoMADS1)基因會(huì)導(dǎo)致馬鈴薯(Solanumtuberosum)塊莖產(chǎn)量降低、側(cè)芽生長(zhǎng)增強(qiáng)[21]；在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中AtAGL21可以通過(guò)增強(qiáng)局部生長(zhǎng)素的生物合成，來(lái)調(diào)節(jié)側(cè)根原基和側(cè)根中生長(zhǎng)素的積累，進(jìn)而刺激側(cè)根的起始和生長(zhǎng)，而agl21突變體則表現(xiàn)側(cè)根發(fā)育受損[22]。這些結(jié)果初步證明MADS-box轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于珠芽形成具有重要意義。然而，目前缺少M(fèi)ADS-box基因在百合珠芽發(fā)生過(guò)程的功能研究。本研究通過(guò)對(duì)卷丹、重瓣卷丹、淡黃花和瀘定百合的兩種無(wú)性繁殖器官珠芽和鱗莖的病毒檢測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)了珠芽的低毒優(yōu)勢(shì)，隨后通過(guò)對(duì)卷丹珠芽發(fā)生發(fā)育轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中與珠芽發(fā)生相關(guān)的MADS-box差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，結(jié)合qRT-PCR結(jié)果，最終篩選出一個(gè)可能參與珠芽發(fā)生的注釋為MADS2的關(guān)鍵基因，進(jìn)一步對(duì)LlMADS2進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)其在珠芽發(fā)生過(guò)程中的S0和S1時(shí)期的表達(dá)中具有顯著差異，可能參與調(diào)控百合珠芽的發(fā)生，為探明MADS-box轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控卷丹珠芽發(fā)生機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 卷丹、重瓣卷丹、淡黃花、瀘定百合獨(dú)頭種球種植于北京市農(nóng)林科學(xué)院國(guó)家百合種質(zhì)資源庫(kù)中。從卷丹種植到珠芽成熟的過(guò)程不斷進(jìn)行觀察，在卷丹珠芽尚未發(fā)生時(shí)期(S0)、小白點(diǎn)期(S1)、綠球期(S2)、褐球期(S3)取植株葉腋處(圖1)，每個(gè)階段取9株卷丹，每株卷丹取同一部位的2個(gè)相鄰葉腋，每3株卷丹的葉腋作為一個(gè)混合樣本混樣，錫箔紙包裹后用液氮速凍，在-80 ℃冰箱凍存，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。取卷丹、重瓣卷丹、淡黃花百合、瀘定百合的褐球期珠芽及同株地下鱗莖于液氮速凍，-80 ℃冰箱凍存，用于病毒檢測(cè)。取卷丹S0，S1，S2，S3時(shí)期珠芽所對(duì)應(yīng)的葉腋處，以及卷丹莖稈上部可發(fā)生珠芽部位和下部無(wú)法發(fā)生珠芽的部位的葉腋，以及卷丹植株各部位器官組織在液氮中速凍，在-80 ℃凍存，用于后期時(shí)空表達(dá)模式檢測(cè)。

A,E,F. S0：珠芽尚未發(fā)生期；B,F,J. S1：珠芽小白點(diǎn)期；C,G,K. S2：綠球期；D,H,L. S3：褐球期;紅圈部分代表珠芽?jī)?nèi)部分化的鱗片層。

1.1.2 菌株、載體和試劑 EASYspin Plus多糖多酚植物RNA快速提取試劑盒(愛(ài)博森生物科技有限公司，北京)，大腸桿菌(DH5α)感受態(tài)BC102細(xì)胞(博邁德生物技術(shù)有限公司，北京)，pCE2 TA/Blunt-Zero Vector載體5 min TM TA/Blunt-Zero Cloning Kit，2 × Phanta? Flash Master Mix(Dye Plus) ，2 × Rapid Taq Master Mix和反轉(zhuǎn)錄試劑HiScript Ⅲ SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(諾唯贊，南京)，DNA通用純化回收試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)，熒光定量PCR試劑TB Green? Premix ExTaqTM(寶生物工程(大連)有限公司，大連)。

1.1.3 儀器與設(shè)備 電子天平，瑞安市英衡電器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；高壓蒸汽滅菌器，SANYO Techno Solutions Tottori Co.,Ltd；微波爐，合肥榮事達(dá)三洋電器股份有限公司；振蕩培養(yǎng)箱，上海旻泉儀器有限公司；梯度PCR儀，Life technologies；CFX96TMReal-Time System，Singapore。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中查找到目的基因的轉(zhuǎn)錄本序列，在ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)獲得其開(kāi)放閱讀框(open reading frames, ORF)序列，將獲得的長(zhǎng)度大于200 bp的ORF序列在NCBI protein BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/-Blast.cgi)依次進(jìn)行比對(duì)，與轉(zhuǎn)錄組注釋結(jié)果相吻合即視為比對(duì)成功，保存比對(duì)成功的ORF序列用于定量引物設(shè)計(jì)。將保存的ORF序列提交至GenScript(https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool?page_no= 1& position_no=2&sensors=googlesearch)，調(diào)整參數(shù)organism：other，size range：180～220 bp，Tm≥60 ℃進(jìn)行定量引物設(shè)計(jì)。根據(jù)引物設(shè)計(jì)的原則選擇最好的1～2個(gè)設(shè)計(jì)結(jié)果作為定量引物，后續(xù)再進(jìn)行定量引物的篩選。

利用Primer Premier 5 軟件進(jìn)行克隆引物、病毒檢測(cè)引物及qRT-PCR引物的設(shè)計(jì)，本試驗(yàn)所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

表1 病毒檢測(cè)及定量試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in virus detection and qRT-PCR

1.2.2 總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 利用EASYspin Plus多糖多酚植物RNA快速提取試劑盒提取卷丹葉腋總RNA；根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Ⅲ SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)說(shuō)明書(shū)，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，反應(yīng)結(jié)束后，樣品于-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 百合無(wú)性繁殖器官珠芽和鱗莖病毒檢測(cè) 利用卷丹、重瓣卷丹、淡黃花百合、瀘定百合的珠芽及鱗莖的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)黃瓜花葉病毒(CMV)、百合無(wú)癥病毒(LSV)、百合斑駁病毒(LMoV)進(jìn)行檢測(cè)。擴(kuò)增體系包含2 × Rapid Taq Master Mix 5 μL，上下游引物各1 μL，所用引物見(jiàn)表1，cDNA 2 μL，ddH2O 2 μL，總體系10 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，72 ℃ 5 min，共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4MADS-box基因分析與關(guān)鍵基因篩選 用DESeq2對(duì)卷丹珠芽形成過(guò)程的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行組間差異表達(dá)分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為FDR(False Discovery Rate)<0.05且FC(Fold Change)≥2。將S1、S2、S3作為珠芽已發(fā)生時(shí)期，S0作為未發(fā)生時(shí)期，設(shè)置3個(gè)比較組，分析差異表達(dá)基因，選擇差異表達(dá)基因中所有的轉(zhuǎn)錄因子，繪制維恩圖與熱圖。利用tbtools(https://github.com/CJ-Chen/TBtools)進(jìn)行venn圖與熱圖的繪制。

1.2.5LlMADS2基因克隆 利用卷丹葉腋的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系包含2 × Phanta Master Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 19 μL，總體系50 μL。反應(yīng)程序?yàn)?98 ℃ 30 s，98 ℃ 10 s，56 ℃ 5 s，72 ℃ 15 s，72 ℃ 5 min，共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用DNA回收試劑盒(TIANGEN, 北京)回收目的片段；將目的片段連接至pCE2 TA/Blunt-Zero Vector載體，轉(zhuǎn)化到DH5α(博邁德，北京) 感受態(tài)中，PCR篩選陽(yáng)性菌株，送往北京諾賽基因組研究中心有限公司(北京)測(cè)序。

1.2.6 序列分析、蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 通過(guò)ProtParam對(duì)蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析；利用ProtScale對(duì)蛋白親疏水性進(jìn)行分析；采用TMHMM Serverv2.0分析編碼氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)域；利用NetPhos 2.0 Server 進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)；利用NCBI ORF finder在線(xiàn)程序及Conserved domains數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)測(cè)序獲得的cDNA序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框及保守功能結(jié)構(gòu)域分析；通過(guò)SOPMA及SWISS.MODEL預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用Cell-PLoc 2.0分析亞細(xì)胞定位情況[23-24]；采用geneious進(jìn)行多重序列比對(duì)。利用生物軟件MEGA7.0進(jìn)行Neighborjoining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，采用遺傳距離建樹(shù)法的相鄰連接法，并進(jìn)行1 000次的Bootstrap校正。

1.2.7LlMADS2的表達(dá)分析 以上述用于qRT-PCR的植物材料的cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR分析，每個(gè)樣品設(shè)3次技術(shù)重復(fù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：5 μL TB green、1 μL cDNA模板、0.4 μL上下游引物、3.2 μL ddH2O。擴(kuò)增程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，循環(huán)39次。以卷丹18 S為內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1，采用2-ΔΔCt法計(jì)算LlMADS2的相對(duì)表達(dá)量。利用Excel、SPSS19、GraphPad Prism8等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種百合鱗莖及珠芽的病毒檢測(cè)

本試驗(yàn)以卷丹、重瓣卷丹、淡黃花百合、瀘定百合的珠芽和鱗莖的cDNA為模板對(duì)百合斑駁病毒(LMoV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、百合無(wú)癥病毒(LSV)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明,在淡黃花百合中，同一植株地下鱗莖和珠芽中均存在百合斑駁病毒，但在珠芽中表達(dá)較弱；卷丹鱗莖中存在黃瓜花葉病毒，但珠芽中并未檢測(cè)到3種病毒的存在；重瓣卷丹鱗莖和珠芽中均含有百合斑駁病毒，但珠芽中斑駁病毒的含量明顯低于鱗莖中；瀘定百合鱗莖中存在百合無(wú)癥病毒和黃瓜花葉病毒，而珠芽中僅含有黃瓜花葉病毒(圖2)，由此說(shuō)明珠芽是未攜帶病毒或帶毒率較少的無(wú)性繁殖器官。這種表現(xiàn)在卷丹和重瓣卷丹珠芽尤為明顯。因此以卷丹為材料探究珠芽的發(fā)生機(jī)制對(duì)于百合種球的脫毒及百合新型繁殖方式的開(kāi)發(fā)具有重要的參考價(jià)值。

2.2 卷丹珠芽發(fā)生關(guān)鍵基因篩選

結(jié)合珠芽形成過(guò)程和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，本研究將159，59，47這3處交集作為參與珠芽發(fā)生的重點(diǎn)基因集，從中選擇出了所有的MADS-box基因，并將篩選出的所有MADS-box基因繪制熱圖。依據(jù)熱圖可以發(fā)現(xiàn)，將S1，S2，S3時(shí)期的表達(dá)量與S0相比較，Cluster-16492.37633，Cluster-16492.39107，Cluster-16492.42069，Cluster-16492.60924這4個(gè)轉(zhuǎn)錄本在珠芽發(fā)生后的表達(dá)量均明顯高于珠芽未發(fā)生時(shí)期，本試驗(yàn)檢測(cè)了Cluster-16492.37633，Cluster-16492.42069，Cluster-16492.60924這3個(gè)轉(zhuǎn)錄本在珠芽發(fā)生(S0)與初期未發(fā)生(S1)階段的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)MADS2定量結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組趨勢(shì)一致且存在顯著差異(圖3)，于是，最終選擇LlMADS2作為后續(xù)研究對(duì)象。

圖3 卷丹珠芽發(fā)生相關(guān)MADS-box關(guān)鍵基因篩選Fig.3 Screening of MADS-box key genes related to bulbil formation in Lilium lancifolium

2.3 卷丹LlMADS2基因CDS全長(zhǎng)克隆及其編碼氨基酸序列分析

通過(guò)前期的轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)合定量驗(yàn)證，本研究從差異表達(dá)基因中篩選出了一個(gè)可能參與調(diào)控珠芽發(fā)生的基因LlMADS2。將其轉(zhuǎn)錄本序列提交至ORF Finder找到1條全長(zhǎng)741 bp的CDS序列，使用引物L(fēng)lMADS2-F和LlMADS2-R對(duì)卷丹LlMADS2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1條長(zhǎng)度約為700 bp的條帶(圖4)，純化回收后連接TA/Blunt-Zero Vector載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，通過(guò)菌液PCR挑選條帶正確的陽(yáng)性克隆單克隆菌液送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明LlMADS2基因開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)741 bp，共編碼246個(gè)氨基酸。如圖中紅色框ATG為起始密碼子,藍(lán)色框TAA為終止密碼子(圖4)。

2.4 LlMADS2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，17種MADS-box蛋白聚為5個(gè)小分支，且具有較高的支持率，LlMADS2與臺(tái)灣百合(Liliumformosanum)中的MADS7,卷丹中的AGAMOUS-like序列處于同一個(gè)進(jìn)化分支上，表明他們的親緣關(guān)系最近(圖5)。

2.5 卷丹LlMADS2蛋白的理化性質(zhì)分析

LlMADS2基因全長(zhǎng)741 bp，編碼一個(gè)由246個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白序列。對(duì)卷丹LlMADS2基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，該蛋白分子式為C1 220H1 961N359O381S13，相對(duì)分子質(zhì)量為28 170.95 D，理論等電點(diǎn)為7.05，脂肪系數(shù)為78.90。LlMADS2蛋白的氨基酸中共含有34個(gè)帶負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp + Glu)，34個(gè)帶正電荷氨基酸殘基(Arg + Lys)。不穩(wěn)定系數(shù)為61.14，蛋白親水性平均值為-0.698，因此LlMADS2為不穩(wěn)定疏水性蛋白(圖6-A、6-B)。LlMADS2蛋白從內(nèi)到外無(wú)跨膜區(qū)域，有接近1的概率表明該蛋白位于膜外，推測(cè)是一種非跨膜蛋白(圖6-C)。LlMADS2蛋白含有可能發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)有48個(gè)，均為T(mén)yr(酪氨酸)(圖6-D)。

圖5 LlMADS2與其他物種同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 LlMADS2 Phylogenetic tree and motif analysis of proteins homologous to other species

2.6 卷丹LlMADS2蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析

采用NCBICD search在線(xiàn)網(wǎng)站分析LlMADS2基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，該蛋白有2個(gè)specific-hits，為REC_MEF2_like和K-box位點(diǎn)，分別屬于MADS superfamily、K-box superfamily(圖7-A)。

利用SOPMA在線(xiàn)軟件對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明,LlMADS2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量中：α螺旋(藍(lán)色c)(52.03%)>無(wú)規(guī)則卷曲(黃色c)(35.37%)>延伸鏈(紅色e)(9.35%)>β轉(zhuǎn)角(綠色t)(3.25%)，因此可推斷，無(wú)規(guī)則卷曲和α螺旋是LlMADS2蛋白的主要組成成分(圖7-B)。蛋白質(zhì)的多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行盤(pán)曲或折疊形成具有規(guī)律的三維空間結(jié)構(gòu)。利用在線(xiàn)軟件 SWISS-MODEL對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，獲得了LlMADS2蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型(圖7-C)。

圖6 LlMADS2蛋白理化性質(zhì)分析Fig.6 Physicochemical properties of LlMADS2 protein

圖7 LlMADS2蛋白二三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 Secondary and tertiary structure prediction of LlMADS2 protein

2.7 卷丹LlMADS2在不同時(shí)期與不同部位中的表達(dá)分析

通過(guò)qRT-PCR，對(duì)LlMADS2基因在卷丹葉腋珠芽未發(fā)生(S0)和珠芽發(fā)生初期(S1)及后期的發(fā)育時(shí)期(S2、S3)的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)LlMADS2在卷丹珠芽未發(fā)生的S0時(shí)期與珠芽已發(fā)生的S1，S2，S3時(shí)期表達(dá)量具有顯著差異，與轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)趨勢(shì)整體一致(圖8-A、8-B)。在自然條件下，卷丹莖稈下部是不具備珠芽發(fā)生能力的，而上部則是可以發(fā)生珠芽的部位，于是筆者對(duì)LlMADS2在卷丹珠芽莖稈下部和上部的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)LlMADS2在卷丹莖稈上部的表達(dá)量要顯著高于下部(圖9-C)。這些結(jié)果表明，LlMADS2可能參與珠芽發(fā)生的調(diào)控，并在珠芽發(fā)生起始過(guò)程中發(fā)揮誘導(dǎo)作用。此外,還對(duì)LlMADS2在卷丹中的表達(dá)模式進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其在卷丹的各個(gè)部位均有表達(dá)，但在花柱中表達(dá)水平最高。

圖8 LlMADS2在卷丹中的表達(dá)模式Fig.8 Expression pattern of LlMADS2 in Lilium lancifolium

3 結(jié)論與討論

百合病毒病是僅次于真菌病害的第二大類(lèi)病害，百合在栽培過(guò)程中易受到病毒的危害，易造成鱗莖腐爛、病株枯死等的發(fā)生，嚴(yán)重影響百合的產(chǎn)量和品質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),黃瓜花葉病毒、百合無(wú)癥病毒以及百合斑駁病毒是卷丹的主要病毒病害[25]。目前，種球播種仍是百合主要的繁殖方式，但鱗莖易受病毒侵害，且國(guó)產(chǎn)種球普遍存在的產(chǎn)量低，品質(zhì)差等問(wèn)題尚未解決。而珠芽是部分百合所具有的一種特殊繁殖器官，一株百合可以產(chǎn)生幾十至上百個(gè)珠芽，大大提高了其繁殖效率，且珠芽著生于百合葉腋處，屬于地上器官，具有低毒優(yōu)勢(shì)[9,26]。但目前關(guān)于百合珠芽病毒檢測(cè)的研究很少，僅有張慧等[8]對(duì)卷丹珠芽、鱗莖和葉片中的黃瓜花葉病毒，百合無(wú)癥病毒及斑駁病毒進(jìn)行了檢測(cè)和比較，證實(shí)卷丹珠芽相對(duì)于鱗莖來(lái)說(shuō)確實(shí)具有病毒種類(lèi)少含量低的優(yōu)勢(shì)。本研究增加了對(duì)瀘定百合、淡黃花百合及重瓣卷丹的病毒檢測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)了百合珠芽帶毒率低，是極具開(kāi)發(fā)潛力的百合無(wú)性繁殖器官。珠芽發(fā)生機(jī)制的解析對(duì)于百合脫毒種球的生產(chǎn)及新型繁殖方式的開(kāi)發(fā)具有重要意義。

MADS-box轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是植物中研究最多的家族之一，這個(gè)家族的成員在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起著顯著的作用[27]。前人研究證明，MADS-box基因在側(cè)生器官的形成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20-21,28-29]，其中發(fā)現(xiàn)在龍舌蘭珠芽發(fā)生過(guò)程中，AtMADS1/2/4/6/7可能發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[18]。本研究通過(guò)對(duì)卷丹珠芽形成過(guò)程中轉(zhuǎn)錄組的分析，以定量結(jié)果為輔助，篩選出LlMADS2作為后續(xù)研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，LlMADS2屬于不穩(wěn)定疏水性蛋白，結(jié)構(gòu)也較為簡(jiǎn)單，初步闡述了LlMADS2蛋白的理化性質(zhì)及其二三級(jí)結(jié)構(gòu)。氨基酸多序列同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)LlMADS2與LlMADS7和LlAGAMOUS-like的同源性較高，功能上可能具有部分相似性。對(duì)于LlMADS2在卷丹珠芽形成不同時(shí)期和不同位置的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，LlMADS2在珠芽已發(fā)生時(shí)期的表達(dá)量要顯著高于未發(fā)生時(shí)期，且在具有珠芽發(fā)生能力的莖稈上部的表達(dá)要顯著高于不具備珠芽發(fā)生能力的莖稈下部。這說(shuō)明LlMADS2可能正向調(diào)控卷丹珠芽的發(fā)生，這可能是由于物種間遺傳背景的差異所導(dǎo)致的。時(shí)空表達(dá)模式說(shuō)明LlMADS2在卷丹各部位具有表達(dá)，但在花柱中最高，其屬于MADS-box基因家族這也具有合理性，且有研究表明珠芽的發(fā)生與花芽的分化具有一定聯(lián)系[18]，推測(cè)LlMADS2通過(guò)影響花芽分化進(jìn)而對(duì)珠芽的發(fā)生造成影響。

目前，與MADS-box家族基因調(diào)控珠芽形成的相關(guān)研究較為匱乏，LlMADS2調(diào)控珠芽發(fā)生的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步的探究。本研究通過(guò)對(duì)4種可發(fā)生珠芽的百合鱗莖和珠芽的病毒檢測(cè)，證實(shí)了珠芽的低毒優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明對(duì)于珠芽發(fā)生機(jī)制解析的重要性。且對(duì)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子LlMADS2在卷丹珠芽形成過(guò)程中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，對(duì)其功能進(jìn)行了初步的推測(cè)，為進(jìn)一步探究LlMADS2調(diào)控珠芽形成機(jī)制提供了參考。