王昊寧， 周佩， 劉燕， 劉夢， 朱曉儀， 石力勻， 栗燕， 逯久幸

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林與藝術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省優(yōu)質(zhì)花卉蔬菜種苗工程技術(shù)中心，河南 鄭州 450002)

月季(RosachinensisJacq.)是全球重要的觀賞花卉，具有極高的經(jīng)濟(jì)價值。環(huán)境方面的非生物脅迫問題限制了月季的生長發(fā)育，嚴(yán)重影響其花卉品質(zhì)[1]。研究月季中的非生物脅迫響應(yīng)基因?qū)⒂兄谶z傳改良其脅迫耐受性，應(yīng)對日益嚴(yán)峻的環(huán)境挑戰(zhàn)。

TIFY蛋白含有保守的TIFY結(jié)構(gòu)域，TIFY基因家族根據(jù)具體包含的額外結(jié)構(gòu)域類型分為4個亞家族：TIFY亞家族僅包含TIFY結(jié)構(gòu)域；PPD亞家族除TIFY結(jié)構(gòu)域外，還含獨(dú)特的N端PPD結(jié)構(gòu)域；JAZ家族除TIFY結(jié)構(gòu)域外，還包含1個CCT_2結(jié)構(gòu)域；ZIM亞家族在JAZ亞家族的基礎(chǔ)上，還包含1個ZnF_GATA結(jié)構(gòu)域[2]。最近的研究表明，TIFY蛋白在調(diào)節(jié)植物干旱脅迫和鹽脅迫的抗性中發(fā)揮著重要的作用[3-4]。擬南芥AtTIFY10a和AtTIFY10b以及其野生大豆的同源基因GsTIFY10a和OsTIFY10b，均為調(diào)節(jié)鹽堿脅迫響應(yīng)的正向因子[5]。擬南芥AtTIFY5b過表達(dá)賦予擬南芥耐旱性[6]。水稻中大多數(shù)TIFY蛋白至少參與1種非生物脅迫的響應(yīng)，其中包含耐旱與耐鹽，OsTIFY11a的過表達(dá)可以增強(qiáng)水稻對鹽脅迫和脫水脅迫的耐受性[7]。棉花GaJAZ5基因的過表達(dá)減少了水分流失、氣孔開口和過氧化氫的積累，提高植物的耐旱性[8]。過表達(dá)小麥TdTIFY11a的擬南芥幼苗的發(fā)芽率和生長率均高于野生型，表現(xiàn)出較高的鹽脅迫耐受性[9]。

綜上，TIFY家族的分析對月季干旱脅迫和鹽脅迫的調(diào)控分子機(jī)制的研究具有重要意義。本研究通過對月季基因組的掃描，獲取月季TIFY家族成員序列，對月季TIFY家族成員進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析、理化性質(zhì)分析、基因結(jié)構(gòu)分析、組織表達(dá)模式分析以及順式元件分析。為進(jìn)一步了解TIFY基因在月季干旱脅迫和鹽脅迫的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)，并為月季遺傳改良脅迫耐受性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 月季TIFY家族成員分析所需數(shù)據(jù)來源

月季基因組序列、蛋白序列庫、CDS序列庫來源于https://lipm-browsers.toulouse.inra.fr/pub/RchiOBHm-V2/。擬南芥TIFY家族成員蛋白序列來源于https://www.arabidopsis.org/index.jsp。水稻TIFY家族成員蛋白序列來源于https://www.ncbi.nlm.nih.gov/。擬南芥的基因組數(shù)據(jù)來源https://ngdc.cncb.ac.cn/gwh/Assembly/21820/show。水稻基因組(MH63RS3)數(shù)據(jù)來源http://rice.hzau.edu.cn/cgi-bin/rice_rs3/download_ext。月季轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA587482，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/722055。

1.2 月季TIFY家族成員全基因組鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

通過http://pfam.xfam.org/網(wǎng)站下載TIFY結(jié)構(gòu)域的HMM文件(PF06 200)。以HMM文件作為種子文件，利用HMMER3.0檢索月季蛋白序列庫中TIFY家族成員，參數(shù)設(shè)置E<1e-5。獲取的蛋白序列提交https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi檢測其結(jié)構(gòu)域并保存結(jié)構(gòu)域完整的序列。共獲取13個家族成員，根據(jù)擬南芥同源性重新命名，基因名稱見表1。蛋白序列提交https://web.expasy.org/compute_pi/進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測，提交https://wolfpsort.hgc.jp/進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

通過MEGA X軟件[10]，采用NJ法構(gòu)建月季TIFY家族成員與擬南芥、水稻TIFY家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹，參數(shù)設(shè)置Bootstrap=2 000。進(jìn)化樹結(jié)果通過Evolview線上程序https://evolgenius.info//evolview-v2/#login進(jìn)行美化。

1.3 月季TIFY家族成員的染色體定位與進(jìn)化分析

通過月季基因組FASTA文件與GFF文件獲取染色體長度信息，基因起始中止信息。通過MCScanX程序獲取TIFY基因在月季與擬南芥、水稻的共線性基因，提取具有共線性關(guān)系的月季TIFY家族成員，結(jié)果通過TBtools[11]進(jìn)行可視化。

1.4 月季TIFY家族成員蛋白保守基序、蛋白結(jié)構(gòu)域與基因結(jié)構(gòu)分析

月季、擬南芥和水稻TIFY家族成員蛋白序列提交https://meme-suite.org/meme/進(jìn)行motif預(yù)測，參數(shù)設(shè)置motif=10。蛋白序列提交https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi獲取結(jié)構(gòu)域信息，參數(shù)默認(rèn)。月季基因組GFF文件獲取月季TIFY家族成員UTR區(qū)域、內(nèi)含子和外顯子位置的基因結(jié)構(gòu)信息。TBtools進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

1.5 基于RNA-seq數(shù)據(jù)構(gòu)建月季TIFY家族成員組織表達(dá)熱圖

月季轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)通過trim_galore進(jìn)行質(zhì)控，參數(shù)默認(rèn)。質(zhì)控后clean reads通過kallisto程序[12]進(jìn)行定量，參數(shù)設(shè)置b=100。定量獲取的TPM表達(dá)值通過R包sleuth[13]進(jìn)行結(jié)果校正，校正后的結(jié)果通過TBtools進(jìn)行熱圖可視化。

1.6 月季TIFY家族成員上游順式元件預(yù)測

截取月季TIFY家族成員上游2 000 bp序列提交順式元件線上預(yù)測平臺http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/，結(jié)果通過VB腳本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，TBtools進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 月季TIFY家族成員的鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

為了獲取月季基因組中的TIFY基因家族成員，采取HMM和BLASTP 2種方法進(jìn)行鑒定，初步鑒定結(jié)果通過CDD網(wǎng)站進(jìn)行手動篩選包含完整TIFY結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，共鑒定13個月季TIFY家族成員。為了研究TIFY家族進(jìn)化關(guān)系及對家族成員進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)分，采用N-J法將月季、擬南芥和水稻的TIFY家族成員共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并根據(jù)基因同源性對月季TIFY家族成員進(jìn)行命名，結(jié)果如圖1。TIFY基因根據(jù)特定結(jié)構(gòu)域分為TIFY、JAZ、ZIM和PPD 4個亞家族，13個月季TIFY家族成員中，TIFY亞家族包含1個成員，JAZ亞家族包含8個成員，ZIM亞家族包含3個成員，PPD亞家族包含1個成員。

星形：月季；三角形：擬南芥；方形：水稻;RcTIFY：月季TIFY基因家族；AtTIFY：擬南芥TIFY基因家族；OsTIFY:水稻TIFY基因家族。

月季TIFY家族成員均能找到擬南芥、水稻的同源基因，但未鑒定到AtTIFY7/OsTIFY7、AtTIFY11/OsTIFY11的同源基因。這一結(jié)果可以推測這2個同源基因在月季進(jìn)化過程中出現(xiàn)了丟失。

蛋白質(zhì)序列理化性質(zhì)預(yù)測表明(表1)，蛋白長度123～438 aa；相對分子質(zhì)量為13 813.91～46 086.01 D；等電點(diǎn)為4.87～9.93；RcTIFY1為穩(wěn)定蛋白，其余蛋白均為不穩(wěn)定蛋白。蛋白序列亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，9個成員被定位在細(xì)胞核中，3個成員定位在葉綠體，1個成員定位在線粒體。

表1 月季TIFY基因家族成員信息Table 1 The information of TIFY gene family members in Rosa chinensis

2.2 月季TIFY家族成員分布與共線性分析

13個月季TIFY家族成員不均勻分布在2、4、5、6、7號染色體中(圖2)。其中2號染色體擁有最多的TIFY成員(4個)，5號染色體僅包含1個TIFY成員。除此之外，RcTIFY3、RcTIFY5a、RcTIFY6b、RcTIFY6a、RcTIFY8、RcTIFY10a位于相對較高的基因密度區(qū)域。

為進(jìn)一步探究月季TIFY家族成員的進(jìn)化，基于物種間的共線性分析構(gòu)建了擬南芥與月季，水稻與月季的基因組共線性圖譜。其中月季與擬南芥的TIFY家族成員的同源基因?qū)?shù)為12(圖3-A)，與水稻的為4(圖3-B)。該結(jié)果表明月季與擬南芥具有更多的同源基因，也表明月季與擬南芥的分歧發(fā)生在二者的共同雙子葉植物祖先與稻的單子葉植物祖先的分歧之后。

紅色：基因高密度區(qū)域；藍(lán)色：基因密度低密度區(qū)域。 Red: High gene density region; Blue: Low gene density region.圖2 月季TIFY基因家族成員染色體定位Fig.2 Chromosomal localization of TIFY gene family members in Rosa chinensis

A：月季與擬南芥共線性分析，RcChr:月季染色體，AtChr:擬南芥染色體；B：月季與水稻共線性分析，RcChr:月季染色體，OsChr:水稻染色體。

2.3 月季TIFY家族成員motif序列、結(jié)構(gòu)域以及基因結(jié)構(gòu)分析

通過Motif序列，結(jié)構(gòu)域分布以及內(nèi)含子外顯子的位置，可以獲取月季TIFY家族成員的結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果見圖4。TIFY家族的4個亞家族具有不同的結(jié)構(gòu)特征，Motif1被鑒定為TIFY結(jié)構(gòu)域并分布在所有基因中。Motif2為Jas結(jié)構(gòu)域(CCT2結(jié)構(gòu)域)，該基序僅存在于JAZ和PPD亞家族成員中。Motif2/5為CCT結(jié)構(gòu)域，Motif3為ZnF_GATA結(jié)構(gòu)域，這2種結(jié)構(gòu)域?yàn)閆IM亞家族特有。Motif7為PPD結(jié)構(gòu)域，這種結(jié)構(gòu)域?yàn)镻DD亞家族特有。月季TIFY家族成員均包含完整的UTR區(qū)域，同一分支的成員具有相似的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。

A：RcTIFY蛋白序列保守基序，底部的刻度單位為aa，表示蛋白長度;B：RcTIFY蛋白序列結(jié)構(gòu)域，底部的刻度單位為aa，表示蛋白長度；C：RcTIFY的基因結(jié)構(gòu)，底部的刻度單位為bp，表示基因長度。

2.4 月季TIFY家族成員轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析

13個月季TIFY家族成員在干旱處理下葉片的表達(dá)熱圖如圖5-A所示，RcTIFY3在干旱處理后表達(dá)量先上升，隨后穩(wěn)定，復(fù)水后仍不下降。RcTIFY10a、RcTIFY10b、RcTIFY9、RcTIFY5a在干旱處理60 d時表達(dá)量達(dá)到峰值。RcTIFY6a在干旱處理60、90 d時表達(dá)量顯著高于0、60 d及復(fù)水后7 d。RcTIFY5b在脅迫處理后顯著高表達(dá)，復(fù)水后仍不下降。

13個月季TIFY家族成員在鹽脅迫處理下根的表達(dá)熱圖如圖5-B所示，RcTIFY9在鹽脅迫處理2 h表達(dá)量下降，隨后表達(dá)上升。RcTIFY5b、RcTIFY3、RcTIFY10a、RcTIFY10b、RcTIFY6b、RcTIFY5a具有相似的表達(dá)模式，在鹽處理24、48 h顯著上調(diào)。

綜上，月季TIFY家族6個成員(RcTIFY3、RcTIFY5a、RcTIFY5b、RcTIFY9、RcTIFY10a、RcTIFY10b)在干旱脅迫與鹽脅迫的調(diào)節(jié)中均發(fā)揮著積極作用。

A: RcTIFY基因在干旱脅迫下葉中的表達(dá)量；LF_DR_0 d: 葉干旱處理0 d; LF_DR_30 d: 葉干旱處理30 d; LF_DR_60 d: 葉干旱處理60 d; LF_DR_90 d: 葉干旱處理90 d, LF_RW_7 d: 葉復(fù)水處理7天。B：RcTIFY基因在鹽脅迫下根中的表達(dá)量；RT_SA_0 h:根鹽處理0 h; RT_SA_2 h: 根鹽處理2 h; RT_SA_24 h: 根鹽處理24 h; RT_SA_48 h: 根鹽處理48 h。

2.5 月季TIFY家族成員順式元件分析

通過PlantCARE網(wǎng)站對月季TIFY家族成員上游2 000 bp序列的啟動子分析表明，這些成員上游序列含有豐富的激素響應(yīng)元件與非生物脅迫順式元件。結(jié)果如圖6,激素響應(yīng)元件以脫落酸和茉莉酸甲酯響應(yīng)元件為主。其中脫落酸ABRE響應(yīng)元件是該家族最多的順式元件，結(jié)合2.4結(jié)果，具有豐富的ABRE響應(yīng)元件的RcTIFY5a、RcTIFY5b、RcTIFY6a、RcTIFY6b、RcTIFY10b均在干旱或鹽脅迫下發(fā)揮著積極作用。這一結(jié)果表明，月季TIFY家族部分成員可能主要通過ABA途徑影響植物對脅迫的耐受性。非生物脅迫順式元件有干旱、鹽、熱激、應(yīng)激、低溫、創(chuàng)傷、缺氧脅迫元件，這一結(jié)果表明月季TIFY家族成員可能對多種脅迫均會響應(yīng)。

脫落酸順式元件：ABRE、ABRE4、ABRE3a;茉莉酸甲酯順式元件：TGACG-motif、CGTCA-motif;干旱脅迫順式元件：MYC、MBS;鹽脅迫順式元件：Myb;熱激脅迫順式元件：STRE;應(yīng)激脅迫順式元件：as-1、ARE、WRE3、W box;低溫脅迫順式元件：LTR;創(chuàng)傷脅迫順式元件：WUN-motif;缺氧脅迫順式元件：GC-motif；圖例單位為個。

3 討論與結(jié)論

本研究共鑒定13個月季TIFY家族成員，其中TIFY亞家族1個，JAZ亞家族8個，ZIM亞家族3個，PPD亞家族1個。而其他物種TIFY家族成員數(shù)在15～54，如西瓜15個[14]、擬南芥18個[15]、水稻20個[7]、玉米30個[16]、棉花54個[17]。月季成員數(shù)較少的原因是缺少TIFY7和TIFY11的同源基因，TIFY家族出現(xiàn)的時間早于單子葉和雙子葉植物分化的時間[18]，水稻和擬南芥中均包含這2種基因，可以推測月季這2種同源基因在進(jìn)化過程中出現(xiàn)了丟失。本研究中進(jìn)化樹結(jié)果顯示，PPD亞家族成員僅出現(xiàn)在雙子葉植物中。這一結(jié)果表明PPD亞家族的出現(xiàn)時間晚于單、雙子葉植物分化的時間。本研究結(jié)果支持了單子葉植物中不存在PPD基因的假說[2]。亞細(xì)胞預(yù)測結(jié)果表明，月季TIFY家族成員主要位于細(xì)胞核，但也有位于葉綠體和線粒體的成員。這一結(jié)果與前人研究一致[19]。TIFY家族成員在植物細(xì)胞的廣泛調(diào)控系統(tǒng)中發(fā)揮作用，以參與植物生命活動的調(diào)節(jié)。

TIFY蛋白在調(diào)節(jié)植物對不利環(huán)境條件的反應(yīng)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，6個月季TIFY家族成員在干旱脅迫后出現(xiàn)了上調(diào)表達(dá)，7個成員在鹽脅迫后出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，推測這些月季TIFY家族成員在不利的環(huán)境條件下同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。不同物種的TIFY同源基因具有相似的生物學(xué)功能[20]。擬南芥AtTIFY10a和AtTIFY10b的敲除證明了這兩個基因在鹽堿反應(yīng)中的積極作用[21]，水稻OsTIFY10c基因被證實(shí)通過茉莉酸信號通路提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性[22]，月季中的同源基因RcTIFY10a、RcTIFY10b在鹽脅迫24～48 h上調(diào)表達(dá)，其可能是潛在的增加鹽脅迫的抗性的調(diào)控因子。擬南芥AtTIFY5b基因介導(dǎo)耐旱性[6]，月季中其同源基因RcTIFY5a在干旱脅迫60 d顯著上調(diào)表達(dá)，該基因可能是潛在的抗旱調(diào)控因子。

脫落酸(ABA)信號通路在調(diào)節(jié)各種應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[23]，棉花GbJAZ1、大豆GmTIFY10e和GmTIFY10g通過ABA通路進(jìn)行鹽脅迫調(diào)節(jié)。外源性茉莉酸或其修飾產(chǎn)物處理可以強(qiáng)烈誘導(dǎo)JAZ亞家族基因的表達(dá)，甘藍(lán)中大多數(shù)TIFY家族基因在外源茉莉酸甲酯(MeJA)處理后均上調(diào)[24]。在月季研究中，這2種激素對月季響應(yīng)干旱脅迫與鹽脅迫具有積極意義[25-27]。本研究中，這2種激素響應(yīng)元件在月季TIFY家族成員中最豐富，因此推測脫落酸或茉莉酸甲酯可能是有效的提高月季TIFY家族成員積極參與月季的脅迫響應(yīng)重要因素。

本研究共鑒定13個RcTIFY家族成員，并被分為4個亞家族。其中6個成員(RcTIFY3、RcTIFY5a、RcTIFY5b、RcTIFY9、RcTIFY10a、RcTIFY10b)在干旱脅迫和鹽脅迫中均積極響應(yīng)，轉(zhuǎn)錄組結(jié)果結(jié)合擬南芥與水稻的研究結(jié)果，推測RcTIFY10a、RcTIFY10b為潛在的增加鹽脅迫的抗性的調(diào)控因子；RcTIFY5a是潛在的抗旱調(diào)控因子。脫落酸與茉莉酸甲酯是調(diào)節(jié)該家族成員的潛在關(guān)鍵植物激素。