王靖陽 ，韓立峰 ，張晨 ，趙亞楠 ，徐強

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，天津 300150）

腦卒中（亦稱中風(fēng)）是最常見的腦血管疾病，是造成全球范圍內(nèi)死亡和殘疾的第3大原因，缺血性卒中在新發(fā)卒中的比例可達(dá)60%以上，位居腦卒中數(shù)量之首[1-3]，其病因主要是由腦部血液循環(huán)障礙，腦血流與氧氣供給受限[4-5]。目前溶栓是缺血性卒中最常見的治療方式，但其局限性主要是時間窗狹窄及禁忌癥較多，并且對前循環(huán)卒中效果并不理想[6-7]。因此，采取局限性更少、受用群體更廣，且有益于中風(fēng)后期恢復(fù)的治療方法來預(yù)防及治療缺血性卒中已迫在眉睫。

丹參作為一種多年生草本植物，廣泛分布于全國各地。丹參的根和根莖具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效[8]。注射用丹參多酚酸是國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的中藥注射劑（國藥準(zhǔn)字Z20110011），主要是丹參中的水溶性有效成分，因其具有良好的抗血栓、抗腦缺氧、縮小腦缺血及腦血栓所致梗塞面積，改善行為障礙、減輕水腫的作用，目前已被廣泛應(yīng)用于缺血性腦卒中的治療[9]。雖然丹參藥效研究較多，但目前關(guān)于注射用丹參多酚酸對代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究較少。

代謝組學(xué)是由Nicholson教授提出，主要定量研究生命體在病理、生理刺激下的小分子代謝物的動態(tài)變化，目前已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個研究領(lǐng)域[10-11]。有研究在動物模型上證實了中藥及其提取物對缺血性卒中的治療的作用機制及保護作用，為臨床提供了可靠依據(jù)及實驗基礎(chǔ)[12-15]。在臨床中，缺血性腦卒中患者的生理病理具有特異性改變，特別是其血液樣本，會呈現(xiàn)出與本身中風(fēng)前或與正常人具有明顯差異及特定的指標(biāo)改變，但指標(biāo)的改變與藥物使用與否之間的關(guān)系機制仍不明確。因此相應(yīng)臨床試驗[16-21]從缺血性卒中的急性期與恢復(fù)期不同的角度，從人體生理病理改變的不同角度闡述其疾病發(fā)展原理，表明了藥物的作用機制，證實了作用靶點的臨床效應(yīng)，并為疾病的預(yù)后及預(yù)防提供了方向。因此本研究通過代謝組學(xué)技術(shù)分析缺血性腦卒中恢復(fù)期患者使用注射用丹參多酚酸治療前后體內(nèi)血漿代謝的變化，從代謝水平探討其治療的作用機制，為臨床的精準(zhǔn)應(yīng)用提供一定參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病例來源 本研究經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，倫理號：2019-034-01，并獲得所有受試者的書面知情同意。2020年10月—2021年7月從天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院、天津市北辰區(qū)中醫(yī)院總計招募患者39人，其中男性32例，占比 82.05%，女性 7 例，占比 17.95%；年齡（62.33±8.11）歲；體重指數(shù)（24.57±3.53）kg/m2；合并高血壓16例，占比41.03%，合并高脂血癥2 例，占比 5.13%。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)與疾病分期標(biāo)準(zhǔn) 西醫(yī)診斷采用2018年中華醫(yī)學(xué)會制定的《中國急性缺血性腦卒中診治指南》[22]，中醫(yī)中風(fēng)病的辨證及診斷參考周仲瑛主編的《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》[23]《中醫(yī)臨床診療指南釋義》[24]及《中國腦梗死中西醫(yī)結(jié)合診療指南（2017）》[25]；疾病分期參照2018年《中國急性缺血性腦卒中診治指南》[22]與《中國腦梗死中西醫(yī)結(jié)合診療指南（2017）》[25]，急性期：發(fā)病兩周內(nèi)；恢復(fù)期：輕型 1 周后，危重型2周～6個月。

1.3 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 1）缺血性腦卒中（恢復(fù)期：發(fā)病7 d～3個月，不包含7 d，包含3個月）者。2）美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（簡稱NIHSS評分量表）評分在4～20分（包含邊界值）。3）年齡18歲以上（包括18歲），無性別要求。4）首次發(fā)病或有發(fā)病史，但無肢體癱瘓等后遺癥，不影響本研究評分，改良Rankin量表（簡稱mRS）評分≤1分。5）符合缺血性腦卒中診斷，經(jīng)頭顱CT或頭顱MRI確診為腦梗塞，且發(fā)病在要求以內(nèi)的患者。

1.3.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 1）頭顱影像學(xué)檢查證實有腦腫瘤、腦炎、腦膿腫等導(dǎo)致相似癥狀的疾病，或證實有出血性腦梗死，硬膜外血腫，顱內(nèi)血腫，腦室出血，蛛網(wǎng)膜下腔出血等。2）對研究中使用的藥物成分過敏者。3）有消化道潰瘍、出血病史者。4）有嚴(yán)重的內(nèi)臟疾病者、血液疾病者、內(nèi)分泌系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病者。5）妊娠期、哺乳期婦女。6）藥物或酒精濫用者。7）精神疾病患者。8）短暫性腦缺血發(fā)作患者。9）1個月內(nèi)參加過其他臨床試驗者。10）研究者認(rèn)為不宜入選者。

1.4 研究方法

1.4.1 臨床資料收集及方法步驟 收集、記錄相應(yīng)入組患者的基本信息，完成NIHSS評分量表及Barthel指數(shù)評定表（以下簡稱BI指數(shù)），并在符合入組標(biāo)準(zhǔn)后連續(xù)靜脈輸液給藥（14±2）d，分別于入組前、出組時，采集符合入組標(biāo)準(zhǔn)的患者血漿，進行后續(xù)代謝組學(xué)檢測分析。

1.4.2 血漿樣本采集及保存 受試者在禁食過夜后，于空腹?fàn)顟B(tài)下抽取化驗標(biāo)本，使用肝素鈉抗凝管采集5 mL靜脈血，并于30 min內(nèi)進行血漿分離，4℃下離心，離心半徑8 cm，3 000 r/min離心10 min，取上層，分裝至1.5 mL離心管中，封口膜密封后，按相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)進行編號，進行書面記錄。將樣本于-80℃冰箱凍存。

1.5 血漿代謝組學(xué)分析

1.5.1 實驗儀器 超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀UHPLC/HESI-Q-Orbitrap MS（Thermo Fisher Scientific，USA）；Mettler Toledo AL204型天平（Mettler Toledo儀器上海有限公司，中國）；DW-86L628型-80℃立式超低溫保存箱（海爾公司，中國）；Eppendrof冷凍離心機5424R（艾本德股份有限公司，德國）；XW-80A渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠，中國）。

1.5.2 實驗試劑 色譜純乙腈、甲醇（Thermo Fisher Scientific，美國）；超純水（北京屈臣氏蒸餾水有限公司，中國）；甲酸（ACS，Wilmington，美國）；乙酸銨（Sigma-Aldrich公司，美國）。

1.5.3 血漿質(zhì)譜代謝組學(xué)樣品的制備 每個樣品分別吸取100 μL血漿，加入400 μL冰乙腈沉淀蛋白，離心半徑10 cm，14 000 r/min離心10 min，吸取上清液，氮氣吹干，100 μL 80%的甲醇（v/v）復(fù)溶，待測。QC樣本：從每個樣本中取10 μL，輕微震蕩混勻，加4倍體積的乙腈，同法處理?？瞻讟颖荆褐苯釉谶M樣小瓶中加入80%甲醇。

1.5.4 代謝組學(xué)色譜條件 采用U3000超高效液相系統(tǒng)配備一個ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動相 0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（D）。梯度洗脫：0～7 min，3%～100%D；7～9 min，100%D；9～9.1 min，100%～3%D；9.1～10 min，3%D。流速 0.4 mL/min，進樣量 2 μL，柱溫 35 ℃。

1.5.5 代謝組學(xué)質(zhì)譜條件 質(zhì)譜分析在Thermo Fisher Q-Orbitrap MS（Q-Exative）系統(tǒng)下完成，離子源為高能電噴霧離子源（HESI源），掃描模式為Fullms/dd-ms2，正負(fù)離子模式下同時采集，源參數(shù)：源噴霧電壓（SV）正離子為 3.5 kV，負(fù)離子為 2.8 kV，毛細(xì)管溫度320℃，離子源加熱溫度350℃，鞘氣（N2）為 35，輔助氣（N2）為 10，S-lens水平為 50 V，歸一化碰撞能量為20/40/60 V，掃描范圍為m/z 100～1 500 Da，分辨率為 70 000。

1.5.6 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理 原始數(shù)據(jù)進行預(yù)處理后導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件中進行無監(jiān)督的主成分分析（PCA），Scaling（標(biāo)度化）方式為等方差法（UV），隨后對數(shù)據(jù)采用有監(jiān)督的正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）對樣品進行分析。結(jié)合t檢驗，篩選具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）和 VIP 值大于 1.0 的變量作為潛在生物標(biāo)志物。將獲得的生物標(biāo)志物導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0在線分析軟件的Pathway Analyst模塊，進行代謝路徑分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料的統(tǒng)計分析 本研究共納入符合入選標(biāo)準(zhǔn)的患者39例。經(jīng)丹參多酚酸治療2周后，患者的NIHSS評分、BI指數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表 1。

表1 丹參多酚酸治療缺血性腦卒中臨床效果[M（P25，P75）]Tab.1 Clinical effect of salvianolic acid in the treatment of ischemic stroke[M（P25，P75）]

2.2 代謝組學(xué)分析 使用丹參多酚酸2周后，將患者血漿進行主成分分析后，PCA分析結(jié)果如圖1所示。患者給藥前后各組間分離趨勢明顯，組內(nèi)分布集中，表明給藥前、給藥后樣本存在明顯的差異。

圖1 主成分分析結(jié)果（PCA）Fig.1 Principal component analysis(PCA)

為了進一步篩選給藥前后樣品間的差異，采用有監(jiān)督模式的識別方法OPLS-DA對樣本進行進一步的分析，發(fā)現(xiàn)給藥前后樣本如圖2所示。給藥前與給藥后進一步分離。

為了檢驗OPLS-DA有無過擬合，進行隨機分組200次的置換檢驗OPLS-DA模型，結(jié)果見圖3，表明所建立的OPLS-DA模型無過擬合現(xiàn)象，能夠準(zhǔn)確描述數(shù)據(jù)。

圖3 置換驗證圖Fig.3 Permutation verification diagram

2.3 差異代謝物分析 基于OPLS-DA分析的VIP值識別和揭示給藥前后各離子含量具有差別的代謝物基礎(chǔ)上，進一步做火山圖（Volcano Plot）得分圖如圖4所示。當(dāng)同時滿足以下2個條件，t檢驗差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）和 VIP 值在 1.0 以上時，候選代謝產(chǎn)物被認(rèn)為是潛在的生物標(biāo)記物。所得生物標(biāo)記物根據(jù)m/z及元素組成數(shù)據(jù)，結(jié)合HMDB線數(shù)據(jù)庫，對這些生物標(biāo)記物進行初步確認(rèn)，結(jié)果鑒定出42個與治療相關(guān)的生物標(biāo)記物，分別是：3-脫氫肉堿、尿酸、乙酰左旋肉堿、肌酸、尿嘧啶核苷、3-羥基異戊酰肉堿、1-苯乙胺、3，5-二羥基苯甲酸、5-羥基阿魏酸鹽、纈氨酸、己酰肉堿、4-羥基辛?；鈮A、L-辛?；鈮A、癸二烯酰肉堿、順式-4-癸烯酰肉堿、癸酰肉堿、4，8-二甲基壬酰基肉堿、N-棕櫚酰谷氨酸、反式-2-十二碳烯酰肉堿、四氫皮質(zhì)酮、脫氧膽酰甘氨酸、溶血磷脂酰膽堿（14∶0）、甘油苯基丁酸酯、12-羥基十二烷酸、膽紅素、亞油酰胺、溶血磷脂酰膽堿（16∶1/0∶0）、溶血磷脂酰膽堿（18∶2）、溶血磷脂酰乙醇胺（0∶0/18∶0）、溶血磷脂酰膽堿（20∶4）、溶血磷脂酰膽堿（16∶0）、溶血磷脂酰膽（22∶5）、磷酸膽堿、十六碳烯酰肉堿、溶血磷脂酰膽堿（20∶2）、鞘磷脂（d18∶1/14∶0）、棕櫚酸、甲基咪唑乙醛、單?；视停?8∶2/0∶0/0∶0）、13-二十二烯胺、N-十六烷基吡咯烷、二十二烷酸。差異代謝物具體信息見表2。

表2 差異代謝物匯總表Tab.2 Summary table of differential metabolites

圖4 火山圖分析Fig.4 Volcanic map analysis

對所鑒定的生物標(biāo)記物作熱圖（heatmap）分析，結(jié)果見圖5，反映了各組的生物標(biāo)記物相對增加（藍(lán)色）或減少（紅色）的情況。差異代謝物相關(guān)性分析如圖6。

圖5 差異代謝物熱圖Fig.5 Differential metabolite heat map

圖6 差異代謝物相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis of differential metabolites

2.4 代謝組學(xué)通路分析 將獲得的潛在生物標(biāo)記物導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0在線分析軟件的Pathway Analyst（通路分析）模塊，進行代謝路徑富集分析，結(jié)果見圖7。42個潛在生物標(biāo)志物主要涉及到22個代謝通路，分別為：支鏈脂肪酸的氧化、磷脂生物合成、磷脂酰膽堿生物合成、超長鏈脂肪酸的β氧化、甘油脂代謝、短鏈飽和脂肪酸的線粒體β-氧化、膽汁酸生物合成、線粒體中的脂肪酸伸長率、脂肪酸生物合成、卟啉代謝、鞘脂代謝、丙酸酯代謝、組氨酸代謝、脂肪酸代謝、類固醇生成、類固醇生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、甘氨酸和絲氨酸代謝、嘧啶代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、花生四烯酸代謝、嘌呤代謝。

圖7 .通路富集分析Fig.7 Pathway enrichment analysis

使用氣泡圖進行表示，其中不同的顏色表明了不同代謝途徑的重要性。從黃色到紅色，重要程度逐漸增加，結(jié)果見圖8?？梢源_定在所有物質(zhì)代謝途徑中起到重要作用的共6種，分別為：磷脂生物合成、磷脂酰膽堿生物合成、卟啉代謝、組氨酸代謝、類固醇生成、嘧啶代謝。

圖8 通路分析Fig.8 Pathway analysis

3 討論

中醫(yī)始終強調(diào)整體觀念，認(rèn)為人體是不可分割的，疾病也是需要從整體角度去理解。因此在中醫(yī)觀念的“證候”及“病理產(chǎn)物”可能是在病理因素下，刺激體內(nèi)基因、蛋白質(zhì)的調(diào)控后，繼而影響下游代謝產(chǎn)物發(fā)生偏離正常范圍的一種情況。因此，代謝組學(xué)能夠從微觀角度闡明中醫(yī)的相關(guān)理念，對疾病的發(fā)生機制、治療效果提供更加客觀的展現(xiàn)。

本實驗中共鑒定出42個與治療相關(guān)的生物標(biāo)記物中，其中有31種在用藥后呈相對增加，分別是尿酸、乙酰左旋肉堿、3-羥基異戊酰肉堿、3，5-二羥基苯甲酸、纈氨酸、己酰肉堿、4-羥基辛?；鈮A、L-辛酰基肉堿、癸二烯酰肉堿、順式-4-癸烯酰肉堿、癸酰肉堿、4，8-二甲基壬?；鈮A、N-棕櫚酰谷氨酸、反式-2-十二碳烯酰肉堿、四氫皮質(zhì)酮、脫氧膽酰甘氨酸、溶血磷脂酰膽堿（14∶0）、甘油苯基丁酸酯、12-羥基十二烷酸、亞油酰胺、溶血磷脂酰膽堿（16∶1/0∶0）、溶血磷脂酰膽堿（18∶2）、溶血磷脂酰乙醇胺（0∶0/18∶0）、溶血磷脂酰膽堿（20∶4）、溶血磷脂酰膽堿（16∶0）、溶血磷脂酰膽（22∶5）、磷酸膽堿、十六碳烯酰肉堿、溶血磷脂酰膽堿（20∶2）、鞘磷脂（d18∶1/14∶0）、N-十六烷基吡咯烷；有 11 種在用藥后相對減少，分別是3-脫氫肉堿、肌酸、尿嘧啶核苷、1-苯乙胺、5-羥基阿魏酸鹽、膽紅素、單?；视停?8∶2/0∶0/0∶0）、棕櫚酸、甲基咪唑乙醛、13-二十二烯胺、二十二烷酸。基于42種生物標(biāo)記物及代謝通路，本文將以磷脂與磷脂酰膽堿生物合成、卟啉代謝、組氨酸代謝、類固醇生成以及嘧啶代謝為重點進行討論。

磷脂主要分為甘油磷脂與鞘磷脂，是哺乳動物細(xì)胞膜中含量最多的一種成分[26]。甘油磷脂主要包括磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）等。溶血磷脂酰膽堿與溶血磷脂酰乙醇胺是由磷脂酶A2水解磷脂酰膽堿及磷脂酰乙醇胺的產(chǎn)物之一，是維持細(xì)胞膜正常組成的磷脂成分，并與其上游產(chǎn)物的功能密切相關(guān)。PC可通過CDP-膽堿（Kennedy）途徑及磷脂酰乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（PEMT）催化磷脂酰乙醇胺兩種途徑生成[27]。對肝細(xì)胞內(nèi)極低密度脂蛋白（VLDL）的合成以及分泌轉(zhuǎn)運不可或缺。PEMT通路生成的PC可以限制膽固醇、低密度脂蛋白（LDL）的生成或分泌速率，保證高密度脂蛋白（HDL）的正常代謝[28-30]。PE又稱腦磷脂，以腦和神經(jīng)組織中含量較高，且相對濃度會因細(xì)胞器而異[31]。由于磷脂酰絲氨酸脫羧酶的存在，使線粒體內(nèi)膜比其他細(xì)胞器存在更多的PE[32]，因此，PE參與線粒體的生理功能，影響能量產(chǎn)生。繼而在腦組織缺氧、缺血時，通過反饋調(diào)節(jié)增加脂肪酸的降解，維持能量的供應(yīng)[33]。在腦組織缺氧的區(qū)域中，氧化應(yīng)激會引起線粒體功能障礙并可能損害線粒體自身，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝發(fā)生變化[34]，進一步加重缺血區(qū)域病變。因此在使用注射用丹參多酚酸后，PC、PE代謝較用藥前發(fā)生改變，表明溶血磷脂酰膽堿與溶血磷脂酰乙醇胺含量的變化，可能與改善能量供應(yīng)及調(diào)節(jié)血脂相關(guān)。

鞘磷脂是由鞘氨醇、脂肪酸、磷酸及膽堿組成，由鞘磷脂合酶1和鞘磷脂合酶2在高爾基體和質(zhì)膜上催化形成。鞘磷脂是神經(jīng)細(xì)胞髓鞘的主要成分，在腦和神經(jīng)組織中含量比其它組織更豐富，參與關(guān)鍵的神經(jīng)系統(tǒng)過程，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞對外界的反應(yīng)及生理和病理過程。鞘磷脂的代謝失調(diào)作為腦損傷的主要原因，會影響髓鞘的穩(wěn)定性，參與炎癥反應(yīng)，促進動脈粥樣硬化形成[35-36]。鞘磷脂在鞘磷脂酶作用下，會水解生成神經(jīng)酰胺和磷酰膽堿，神經(jīng)酰胺與細(xì)胞死亡及衰老相關(guān)，可以通過抑制線粒體誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[37]。本實驗使用注射用丹參多酚酸后多種溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺（0∶0/18∶0）、鞘磷脂（d18∶1/14∶0）的代謝均發(fā)生改變，表明注射用丹參多酚酸可以影響磷脂的生物合成，可以改善缺血病灶情況及預(yù)防的雙重作用。

卟啉因其分子結(jié)構(gòu)的特異性，存在多種種類，并且不同的修飾對卟啉的物理性質(zhì)均會產(chǎn)生影響。卟啉對人體損傷的主要機制是誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，但在內(nèi)臟器官中卟啉通過改變蛋白質(zhì)核變形與聚集狀態(tài)，擴張內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷，通過抑制蛋白質(zhì)降解機制導(dǎo)致來蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)失常、細(xì)胞生長停滯，最終加劇了卟啉的蛋白毒性，破壞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)[38]。造成卟啉積累，引起卟啉癥，使全身多器官病變。在卟啉癥中，δ-氨基乙酰丙酸、膽色素原的增加會導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)臟癥狀，同時進入神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)卟啉積累，導(dǎo)致蛋白質(zhì)集聚[39]。

組氨酸在人體內(nèi)代謝有脫羧與解氨兩種途徑[40]，組氨酸脫羧酶作用下轉(zhuǎn)化為組織胺（亦稱組胺），具有擴張血管、降低血壓、促進血管平滑肌及胃液分泌，同時腦組胺也是大腦中一種神經(jīng)遞質(zhì)，具有強效興奮性，可參與調(diào)節(jié)多種神經(jīng)系統(tǒng)功能，包括睡眠覺醒周期、應(yīng)激反應(yīng)、記憶力[41-42]。有研究表明[43]，組胺能神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙與各種神經(jīng)疾病有關(guān)，增加腦組胺的水平含量可能有助于腦部疾病的治療改善。解氨途徑則是在組氨酸解氨酶作用下生成多種中間產(chǎn)物，最終可轉(zhuǎn)化為N5，N10-甲基四氫葉酸、谷氨酸和氨。N5，N10-甲基四氫葉酸參與核酸的合成以及參與能量代謝和信號傳導(dǎo)[44]。谷氨酸和氨參與并影響體內(nèi)氨的動態(tài)代謝平衡及腦組織能量代謝。

膽固醇因環(huán)核結(jié)構(gòu)，無法在體內(nèi)徹底分解，因此會代謝轉(zhuǎn)化成多種化合物。膽固醇在細(xì)胞色素P450酶和羥基類固醇脫氫酶[45]的作用下以及部分轉(zhuǎn)運蛋白及脂質(zhì)結(jié)合蛋白的攝取及轉(zhuǎn)運協(xié)作下，將膽固醇運輸至線粒體內(nèi)[46]。在上述酶的共同作用下，膽固醇轉(zhuǎn)化為類固醇。由于類固醇結(jié)構(gòu)特點及可在不同器官合成，所以其種類繁多，腎上腺合成糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素，性腺可合成孕激素、雄激素及雌激素[47]。腦組織可自主合成的具有生物活性的神經(jīng)類固醇，參與調(diào)節(jié)各種神經(jīng)生理和行為過程，同時神經(jīng)類固醇的產(chǎn)生受到神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽的精細(xì)調(diào)節(jié)[48]。有研究表明[49-50]，雌性動物的神經(jīng)元對多巴胺的毒性作用具有更高的耐受性，并且在腦組織梗塞后面積明顯比雄性動物更小、恢復(fù)時間更短。雌激素對腦組織的保護作用可能與增加神經(jīng)元一氧化氮合酶的表達(dá)有關(guān)，同時在血管內(nèi)皮細(xì)胞中釋放一氧化氮，使得促進血管舒張成為可能。并且雌激素還可以促進前列環(huán)素的產(chǎn)生，增加血管的舒張[51-52]。動脈粥樣硬化作為缺血性卒中的最常見病因，其本質(zhì)是脂類的代謝異常。低密度脂蛋白是血漿脂蛋白的一種，由脂肪和膽固醇組成，其膽固醇含量較多，因此低密度脂蛋白的增加及結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，會導(dǎo)致血液中膽固醇累計、增加血液黏度，在血管壁沉著形成斑塊，最終形成血小板血栓，造成不可逆的損傷。膽固醇作為斑塊的根本原因，改善其代謝有益于對疾病治療。膽酸是膽固醇的一種衍生物，且種類繁多。在體內(nèi)大部分膽汁酸會形成膽鹽，具有促進脂肪乳化和吸收，加速脂肪消化分解，也是體內(nèi)膽固醇的最重要排泄途徑。膽汁酸的生成量增加，有利于降低膽固醇含量。膽固醇生成減少，使更多的乙酰輔酶A可以進入三羧酸循環(huán)，增加三磷酸腺苷（ATP）生成，進一步恢復(fù)梗死組織的能量供應(yīng)。在本實驗中，膽固醇作為類固醇前體物質(zhì)，后者生成途徑的改變反應(yīng)了膽固醇代謝途徑的調(diào)整，表明注射液丹參多酚酸可通過調(diào)節(jié)類固醇與膽固醇代謝達(dá)到治療卒中的目的，同時因激素的改變也可以起到保護及預(yù)防作用。

嘧啶作為組成核苷的堿基成分之一，與戊糖、磷酸共同組成了核酸，因此嘧啶堿參與并且影響著機體的所有生理活動。在細(xì)胞質(zhì)中谷氨酰胺與二氧化碳在氨基甲酰磷酸合成酶的作用下合成的氨基甲酰磷酸，繼而與天冬氨酸發(fā)生結(jié)合，經(jīng)過一系列反應(yīng)最終可生成尿嘧啶核苷酸[53]。在人體核酸中最常見的嘧啶有胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶3種。其在體內(nèi)最終可分解為氨、二氧化碳與水，胞嘧啶可轉(zhuǎn)化為尿嘧啶參與代謝反應(yīng)，并且3種嘧啶在酶的作用下生成的代謝中間產(chǎn)物可進入三羧酸循環(huán)，進行徹底氧化。其分解的氨與二氧化碳會生成尿素，以尿液排出體外。由樣本的代謝差異物可知，在使用注射液丹參多酚酸后，尿苷代謝增加，表明嘧啶分解增加，隨尿液排出的氨也隨之增加，可以減輕腦組織的氨含量，改善腦部能量供應(yīng)，減輕腦梗死癥狀，達(dá)到治療的目的。

綜上所述，本研究通過代謝組學(xué)技術(shù)探究表明了注射液丹參多酚酸可以通過改變組氨酸代謝、磷脂代謝、核酸代謝及能量代謝通路產(chǎn)生相應(yīng)效應(yīng)，證實了丹參多酚酸的臨床療效。然而，由于本實驗樣本量較少，只能作為初步探索。希望以后有樣本量更大多組學(xué)共同分析的高質(zhì)量臨床試驗，繼續(xù)深入研究，為缺血性腦卒中的早期診斷及診治提供可靠的臨床依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究使用代謝組學(xué)技術(shù)檢測到42種差異代謝物與22條代謝通路改變，表明注射用丹參多酚酸的作用機制與調(diào)節(jié)磷脂代謝、氨基酸代謝、核酸代謝及能量代謝相關(guān)。通過代謝組學(xué)可以更加全面的分析中藥在疾病治療中的機制，對臨床疾病的診斷及治療可提供客觀的理論依據(jù)，反映代謝組學(xué)與中醫(yī)相互印證的可行性及廣闊的發(fā)展前景。