黃慶寶， 劉 霞， 周紅祖， 王 雯， 楊卓凡， 鄭智彬， 宣攢威， 羅浩鑫， 余惠旻△

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院深圳市中醫(yī)院， 深圳 518033；2.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部， 深圳 518060；3.深圳市第二人民醫(yī)院， 深圳 518025)

中國(guó)胃癌呈現(xiàn)高發(fā)病率、高死亡率的態(tài)勢(shì)[1]，手術(shù)、化療及靶向治療的預(yù)后很差[2]。大部分單靶點(diǎn)抗腫瘤藥物的應(yīng)用都受限于藥物的毒副作用和耐藥性，這為多靶點(diǎn)作用優(yōu)勢(shì)的中藥及其復(fù)方的研究提供了不可多得的機(jī)會(huì)。胃癌發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不明晰，因此尋找更多具有治療潛力的新靶點(diǎn)成為胃癌機(jī)制研究及治療藥物開發(fā)的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

Telocytes(TCs)中文名譯為特洛細(xì)胞、終隔細(xì)胞、遠(yuǎn)細(xì)胞等，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種廣泛分布在人體各種組織、器官的新型間充質(zhì)細(xì)胞，TCs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、血管生成及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，有望成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)，但研究尚處于起步階段。2013年Vannucchi MG等第一次提出人胃黏膜、黏膜下層和肌層中都存在數(shù)量不等的TCs[3]，但其提供實(shí)驗(yàn)圖片的正確性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。2018年Riccardo Ricci提示，TCs與血小板源性生長(zhǎng)因子受體α多肽(platelet-derived growth factor receptor alpha, PDGFR-α)變異有關(guān)的胃間質(zhì)瘤的發(fā)生存在一定聯(lián)系[4]，但其具體關(guān)系不明晰。TCs與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系未明，從TCs的角度闡明胃癌的發(fā)病機(jī)制具有很大的創(chuàng)新性和可行性。Padhi S等[5]關(guān)于“甲磺酸伊馬替丁、TCs與胰腺相關(guān)疾病”的研究，提示從已有的中藥及其復(fù)方制劑中發(fā)現(xiàn)并找到廉價(jià)有效的調(diào)控TCs的藥物成為可能。

本研究選取人胃的正常及癌變標(biāo)本，選用CD34、PDGFR-α、c-kit和CD31標(biāo)記物，采用多重?zé)晒饷庖呓M化技術(shù)，結(jié)合HE染色、透射電子顯微鏡、免疫組化等，確定TCs在人胃中的免疫表型、分布及其變化特點(diǎn)，從TCs的角度闡明胃癌的發(fā)病機(jī)制，將為臨床胃癌治療提供新的靶點(diǎn)，也將進(jìn)一步豐富和深化對(duì)TCs的認(rèn)知，并有可能在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)以TCs為作用靶點(diǎn)的抗腫瘤中藥復(fù)方或化合物。本研究通過深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)PN-202200055)。

1 材料

1.1 組織來源與分組

標(biāo)本組織來源于2020至2022年深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科分正常組和胃癌組。正常組包括代謝綜合征患者胃部切除的組織標(biāo)本6例(男2例，女4例，年齡23-40歲，平均28歲)與癌旁組織(距腫瘤邊緣大于5 cm)標(biāo)本19例(男12例，女7例，胃癌病人的年齡36-80歲，平均59歲)，胃癌組組織標(biāo)本19例(信息同癌旁組織標(biāo)本)，所有標(biāo)本均經(jīng)HE染色鑒定。

1.2 主要試劑及儀器

4%的多聚甲醛(貨號(hào)P0099-500 mL，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；牛血清蛋白(貨號(hào)FD0030，杭州弗德生物科技有限公司)；DAB試劑盒(貨號(hào)SW1040-1kit，深圳瑞景生物科技有限公司)；CD34 (ICO115) 抗體(貨號(hào)MA137329，深圳開克立科技有限公司)；檸檬酸鈉抗原修復(fù)液、四色多重?zé)晒饷庖呓M化試劑盒、PDGFR-α、CD31、c-Kit抗體(貨號(hào)分別為abs9248-100 mL、abs50012-20 T、3174 S、3528 S、37805 S，上海優(yōu)寧維生物科技有限公司)。

APS300 S組織脫水機(jī)、EG1150C石蠟包埋機(jī)，RM2235、RM2016石蠟切片機(jī)、HI1210攤烤烘片機(jī)、EM UC7超薄切片機(jī)，德國(guó)Leica公司；BX51正置熒光顯微鏡、BX61研究級(jí)正置自動(dòng)熒光顯微鏡，日本OLYMPUS公司；HT7700鎢燈絲透射電鏡，日本HITACH公司。

2 方法

2.1 標(biāo)本處理

2.1.1 組織石蠟標(biāo)本制作 選取組織標(biāo)本，取材面積約為15 mm×15 mm，厚度約為10 mm，常規(guī)處理，4%多聚甲醛中固定24 h，修整、梯度脫水、包埋、修蠟。

2.1.2 電鏡組織標(biāo)本制作 將胃部新鮮組織標(biāo)本(術(shù)后)分割成1 mm×1 mm×1 mm大小，常規(guī)處理、固定、脫水、包埋，后于45 ℃烘箱內(nèi)12 h 60 ℃烘箱內(nèi)48 h固化。

2.2 透射電子顯微鏡

超薄切片機(jī)切片70 mm、3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色、觀察、拍片(電壓80 kV)。

2.3 HE染色

石蠟切片脫蠟至水，常規(guī)方法處理，Harris蘇木素染色、分化、返藍(lán)、伊紅染色、脫水、封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

2.4 免疫組化

石蠟標(biāo)本連續(xù)切片常規(guī)處理，依次脫蠟、修復(fù)、封閉，分別加入一抗CD34(1∶200)、PDGFR-α(1∶500)、CD31(1∶100)和c-kit(1∶100)4 ℃過夜、復(fù)溫，加一抗放大劑、HRP生物素標(biāo)記的二抗，DAB避光顯色，蘇木精復(fù)染，1%鹽酸酒精分化、返藍(lán)、梯度脫水、透明、封片及鏡檢，其中空白對(duì)照組用PBS代替一抗，其余步驟同上。

2.5 多重?zé)晒饷庖呓M化

按試劑盒說明進(jìn)行操作，標(biāo)本經(jīng)脫蠟分別加一抗CD34、PDGFR-α、CD31和c-kit(濃度同上)，HRP標(biāo)記的二抗，熒光染料(TSA520或TSA570)等步驟處理后，再次進(jìn)行抗原修復(fù)，加第2種一抗、HRP二抗及另外一種熒光染料 (TSA520或TSA570)后加DAPI工作液，室溫孵育、水洗，再加抗熒光淬滅封片劑封片，以相同參數(shù)(包括目鏡、曝光時(shí)間、熒光強(qiáng)度和物鏡等)進(jìn)行免疫熒光圖片采集，將CD34/PDGFR-α雙陽(yáng)性表達(dá)且有細(xì)胞核視為TCs。

2.6 半定量分析

每組隨機(jī)選取6個(gè)相對(duì)應(yīng)的視野部位進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 HE染色觀察組織病理學(xué)

對(duì)6例代謝綜合征病人正常胃組織標(biāo)本，19例胃癌病人的正常胃組織及胃癌組織標(biāo)本進(jìn)行HE染色，確定組織結(jié)構(gòu)的完整性，鑒定為正常組織及胃癌組織。結(jié)果顯示，正常胃組織標(biāo)本中固有層、黏膜肌層、黏膜下層、肌層以及漿膜層結(jié)構(gòu)完整，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A)；胃癌組織中病理改變不同，有浸潤(rùn)深度限于黏膜及黏膜下層(圖1B)、腫瘤組織浸潤(rùn)至淺肌層(圖1C)及腫瘤組織浸潤(rùn)至漿膜層(圖1D)。

注：A為正常組織，B、C、D為胃癌組織圖1 人胃正常組織與癌組織HE染色比較(40×)

3.2 透射電子顯微鏡觀察人胃組織中TCs

選取25例正常組組織標(biāo)本，使用透射電子顯微鏡技術(shù)確定人胃中TCs的存在。對(duì)人胃正常組織中固有層、黏膜肌層、黏膜下層、肌層及漿膜層代表性橫斷面的區(qū)域進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)均有TCs存在，其胞體呈梭形或紡錘形，胞核和胞質(zhì)比近1∶1，有極細(xì)而長(zhǎng)且伴有節(jié)狀膨大的突起(telopodes，Tps)(圖2F)。TCs通過Tps緊貼著胃腺，包繞主細(xì)胞(圖2A)；TCs胞體呈梭形，與平滑肌細(xì)胞伴行(圖2B)；在黏膜下層中存在同型交聯(lián)，構(gòu)成3D網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(圖2C)；TCs存在于肌層的間質(zhì)中，Tps短而粗(圖2 D)；在漿膜層中可看到帶有一條Tps的TCs，Tps在細(xì)長(zhǎng)部和膨大部相間呈念珠狀(圖2E)。

注：A.固有層；B.黏膜肌層；C.黏膜下層；D.肌層；E.漿膜層；F.黏膜肌層圖2 人胃正常組織透射電子顯微鏡比較(1000×)

3.3 免疫組化檢測(cè)人胃組織中TCs的免疫表型

選取25例正常組組織標(biāo)本，以CD34、PDGFR-α、c-kit和CD31為免疫標(biāo)記物，采用免疫組化技術(shù)確定人胃組織中TCs的免疫表型。結(jié)果顯示，在胃各層中均有TCs存在，CD34與PDGFR-α標(biāo)記呈陽(yáng)性(圖3A、B、E、F、I、J、M、N、Q、R)，c-kit和CD31標(biāo)記呈陰性(圖3C、D、G、H、K、L、O、P、S、T)，各層中的免疫表達(dá)各具特點(diǎn)，細(xì)胞胞體為梭形、扁平狀或橢圓形，含有數(shù)量不等、形狀略有差異的Tps，與TCs、腺體及血管發(fā)生同型或異型交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。以固有層為例，不同部位中CD34和PDGFR-α的表達(dá)強(qiáng)度各不相同，CD34+細(xì)胞在胃小凹和上皮組織中豐度較低，在固有層底部靠近黏膜肌層的內(nèi)環(huán)肌附近豐度最高，PDGFR-α+細(xì)胞在胃小凹處豐度較高，呈多點(diǎn)彌散狀分布。

注：A～ D.固有層；E～ H.黏膜肌層；I～L.黏膜下層；M～ P.肌層；Q～ T.漿膜層；血小板源性生長(zhǎng)因子受體α多肽(platelet-derived growth factor receptor alpha, PDGFR-α)圖3 人胃正常組織各層免疫組化染色比較(400×)

3.4 多重?zé)晒饷庖呓M化檢測(cè)人胃組織中TCs的免疫表型

選取25例正常組組織標(biāo)本，多重?zé)晒饷庖呓M化技術(shù)進(jìn)一步明確CD34和PDGFR-α表達(dá)雙陽(yáng)性的TCs。結(jié)果顯示，正常胃組織各層中均有CD34與PDGFR-α雙陽(yáng)性的TCs存在(圖4)。固有層TCs胞體多為梭形，Tps細(xì)長(zhǎng)彎曲，環(huán)繞著胃腺，與胃腺形成異型連接(圖4D)；黏膜肌層TCs胞體多呈橢圓形或梭形，有較多短而粗的Tps(圖4H)，在2層平滑肌上的TCs通過Tps包繞著肥大細(xì)胞，與血管內(nèi)皮細(xì)胞存在交聯(lián)(圖4F)；黏膜下層TCs與血管細(xì)胞發(fā)生異型交聯(lián)，包繞在血管周圍，在疏松結(jié)締組織中TCs形成復(fù)雜的同型和異型細(xì)胞連接的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(圖4L)；肌層TCs伴行于肌束周邊、肌層間質(zhì)及肌間神經(jīng)叢中，胞體形狀為梭形，Tps的輪廓清晰且沿著平滑肌纖維向各個(gè)方向延伸，存在相互交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(圖4P)；漿膜層TCs間相互交聯(lián)，分布在結(jié)締組織中，圍繞在神經(jīng)及血管周圍(圖4I)。

注：A、E、I、M、Q為CD34(紅色)；B、F、J、N、R為PDGFR-α(綠色)；C、G、K、O、S為細(xì)胞核(藍(lán)色)；D、H、L、P、T為Merge；血小板源性生長(zhǎng)因子受體α多肽(platelet-derived growth factor receptor alpha, PDGFR-α)圖4 人胃正常組織多重?zé)晒饷庖呓M化比較(1000×)

3.5 多重?zé)晒饷庖呓M化檢測(cè)人胃癌組織中TCs的免疫表型

選取正常組組織標(biāo)本及胃癌組組織標(biāo)本各19例，采用多重?zé)晒饷庖呓M化技術(shù)探討TCs的差異表達(dá)。結(jié)果顯示，與正常人胃組織中TCs比較，人胃癌組織中，固有層TCs胞體形狀多為球狀或者橢圓形，Tps短于正常組織(圖5A、F)；黏膜肌層TCs胞體多為梭形或扁平狀，Tps細(xì)長(zhǎng)，Tps上的節(jié)點(diǎn)較少(圖5B、G)；黏膜下層，靠近血管附近可以觀察到TCs，貼合在血管周邊的TCs的數(shù)量明顯少于正常組織，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)缺失(圖5C、H)；肌層TCs均勻分布于肌肉束周邊，數(shù)量低于正常胃組織(圖5D、I)；漿膜層TCs分布較為松散。人胃癌組織中TCs在數(shù)量上呈現(xiàn)減少和缺失趨勢(shì)(見表1)，正常組織中黏膜下層和肌層TCs的數(shù)量明顯高于癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 人胃正常組織與胃癌組織中胃黏膜下層和肌層中Telocytes(TCs)數(shù)量比較

注：Control為人胃正常組織；Cancer為癌組織；A～E為人正常胃組織各層中CD34 (紅色)/ PDGFR-α(綠色)雙染；F～J為人胃癌各層中CD34 (紅色)/ PDGFR-α(綠色)雙染；血小板源性生長(zhǎng)因子受體α多肽(platelet-derived growth factor receptor alpha, PDGFR-α)圖5 人胃正常組織和胃癌組織各層中CD34/PDGFR-α多重?zé)晒饷庖呓M化比較(400×)

4 討論

近年來，胃癌的治療手段如手術(shù)、化療、放療等均有了很大的發(fā)展，但療效并不令人滿意，國(guó)內(nèi)外的臨床與科研人員一直在探尋胃癌治療的新方法。靶向治療聯(lián)合化療雖然可以改善包括胃癌在內(nèi)的實(shí)體瘤患者的預(yù)后，但靶點(diǎn)陽(yáng)性患者比例低，不能明確特定靶點(diǎn)人群的特征，無法做到精準(zhǔn)治療，如原癌基因人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2)是目前胃癌中明確的治療靶點(diǎn)，但在晚期胃癌患者中其陽(yáng)性率僅為12.1%[6]，在我國(guó)患者中這一比例可能更低。因此，從腫瘤生物學(xué)、細(xì)胞和分子機(jī)制的角度探索胃癌治療的新靶點(diǎn)顯得尤其重要。

TCs是近年來發(fā)現(xiàn)的一種廣泛分布在人體各種器官的新型間充質(zhì)細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，TCs與子宮肌瘤[7]、乳腺癌[8]、皮膚腫瘤[9]、顆粒細(xì)胞瘤[10]、黑素細(xì)胞痣[11]等腫瘤的發(fā)生有著重要聯(lián)系，有望成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)，但研究仍處于起步階段。對(duì)PubMed中的文獻(xiàn)(2010年至2021年)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，TCs相關(guān)的論文有489篇，明確表明癌癥與TCs有關(guān)聯(lián)的只有子宮肌癌[7]和乳腺癌[8]，涉及人胃的研究論文僅有2篇。2013年Vannucchi MG等雖然第一次提出人類胃黏膜、黏膜下層和肌層中都存在數(shù)量不等的TCs[3]，但其提供胃黏膜層的實(shí)驗(yàn)圖片中，CD34與PDGFR-α陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞幾乎相同，完全違背了胃部組織細(xì)胞學(xué)的免疫表型特征，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)是對(duì)該項(xiàng)研究有力的反駁和補(bǔ)充。2018年Riccardo Ricci提出TCs與PDGFR-α變異有關(guān)的胃間質(zhì)瘤的發(fā)生存在一定聯(lián)系[4]，但具體關(guān)系不明晰。胃癌中有95%是胃腺癌，4%-5%是胃間質(zhì)瘤，而PDGFR-α變異有關(guān)的胃間質(zhì)瘤發(fā)病率極低，僅占胃間質(zhì)瘤的6%-7%。因此，TCs與胃生理及病理(胃癌等)的關(guān)系研究在全球內(nèi)仍處于空白階段。

本研究結(jié)果表明，TCs在人胃固有層、黏膜肌層、黏膜下層、肌層及漿膜層中均有分布，胃各層組織中CD34、PDGFR-α陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞隨位置不同而異(圖2、3、4)。與正常人胃組織中TCs比較，固有層癌組織中(圖5F)、黏膜下層血管附近(圖5H)、肌層癌組織中(圖5I)的TCs，其Tps或短于正常組織，或具有較少的節(jié)點(diǎn)或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。腫瘤組織中CD34+/PDGFR-α+TCs的缺失可能是胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制之一(圖5L)，這一結(jié)果與肝癌[12]、侵入性乳腺癌[8]等研究結(jié)果相吻合。

由于胃部微環(huán)境的復(fù)雜性以及TCs缺乏特異性的免疫標(biāo)記，不同組織中免疫表型呈現(xiàn)不一致的狀態(tài)，給TCs與胃部疾病的研究帶來了巨大的障礙。本研究直接選用人胃部正常組織和腫瘤組織，突破了TCs與胃癌研究的瓶頸。本研究首次證實(shí)了TCs在胃各層組織(固有層、黏膜肌層、黏膜下層、肌層和漿膜層)中有明確的定位、分布與免疫表型。TCs在胃癌發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，具有成為胃腺癌預(yù)防和治療新靶點(diǎn)的潛力，并且可能成為藥物抗胃癌作用的潛在靶點(diǎn)。