林建平， 郭明玲， 金 京， 王 浩， 王詩忠， 陳少清△

(1.福建醫(yī)科大學健康學院， 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，福州 350122)

據統(tǒng)計，80%的成年人在一生中會發(fā)生腰背疼痛，多與腰部退行性病變相關[1]。其中腰部骨骼肌衰老(lumbar muscle aging,LMA)已成為腰痛發(fā)生的第一因素，常見于運動員、體力勞動、長期不良姿勢、用力不當者[2]。骨骼肌衰老表現(xiàn)為骨骼肌質量和力量的進行性和全面性喪失，其發(fā)病機制復雜，是激素和細胞因子失衡、肌細胞凋亡、蛋白質合成與再生功能障礙等多因素綜合作用的結果，其中肌細胞凋亡是其重要機制，當細胞凋亡調控失調出現(xiàn)過度或不充分的凋亡時，就可能誘發(fā)許多衰老相關疾病[3，4]。臨床治療骨骼肌衰老多采用營養(yǎng)支持療法，而研究證實針灸治療也對骨骼肌衰老有良好的療效[5，6]。但目前關于針刺治療骨骼肌衰老作用機制方面的研究仍較少，因此本研究采用D-半乳糖(D-Galactose，D-gal)建立LMA模型大鼠，觀察針刺“委中”“腎俞”對衰老大鼠腰肌質量、形態(tài)學、超微結構、肌細胞凋亡率等影響，進一步探討針刺療法延緩腰肌衰老的可能機制。本研究通過福建醫(yī)科大學倫理委員會批準(批號FJMU IACUC 2020-0038)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

SPF級3月齡健康雄性sprague-dawley(SD)大鼠50 只，體質量(371±30)g，由福建醫(yī)科大學提供，實驗動物許可證號SCXK(閩)2016-0002。大鼠在溫度(25±2)℃、濕度(55±5)%、明暗周期12 h∶12 h的條件下飼養(yǎng)，自由進食和飲水，適應性喂養(yǎng)1周后采用隨機數字表法分為空白組、模型組、針刺穴位組、 針刺非穴組、陽性藥物組5組各10 只。

1.2 主要試劑及儀器

Tunel試劑盒(貨號11684817910，瑞士Roche公司)；HE染色套裝(貨號G1003，武漢Servicebio公司)；D-gal、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-蘇氨酸、L-半胱氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-甲硫氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸(貨號分別為S11050g、S20044-25g、S20049-25g、S20042-25g、S20093-25g、S20077-100g、S20027-100g、S200123-25g、S20063-25g、S20060-25g、S20087-25g、S20082-25g，沃森生物有限公司)；一次性無菌針灸針(型號0.25 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；正置光學顯微鏡(型號Nikon Eclipse E100)日本Nikon公司；透射電鏡(型號EM208)飛利浦公司。

1.3 造模方法及評定

用0.9%氯化鈉溶液配置成12.5%D-gal溶液，充分攪拌均勻現(xiàn)配現(xiàn)用。除空白組外，其余4 組每日上午9 點頸背部皮下注射 12.5%D-gal (1 000 mg·kg-1·d-1)，空白組頸背部皮下注射等量0.9%氯化鈉溶液作為對照，注射按無菌操作要求進行，5組均常規(guī)飼養(yǎng)，自由活動，每日1次，連續(xù)8周。LMA模型成功標準[7]：肌肉衰減征指數(sarcopenia index，SI)值下降，HE染色肌細胞明顯萎縮，肌細胞凋亡指數增高。

1.4 干預方法

針刺穴位組自造模第29天起，穴位定位參照《實驗針灸學》[8]，選取雙側“委中”和“腎俞”，以 0.25 mm×25 mm 毫針直刺，針刺深度均取6～8 mm，下午16∶00治療，每次留針20 min，每日1次，6 d為1個療程，間歇1 d，連續(xù)4個療程。

針刺非穴組選取雙側“非經非穴位”(非經非穴位1：“委中”內側旁開0.5 cm；非經非穴位2：“腎俞”與“志室”中點)，余同針刺穴位組。

陽性藥物組參照Sebastiano B[9]研究，采用混合氨基酸進行灌胃干預，成年人每天8 g混合氨基酸。氨基酸組成：L-亮氨酸2.5 g、L-賴氨酸1.3 g、L-異亮氨酸1.25 g、L-纈氨酸1.25 g、L-蘇氨酸0.7 g、L-半胱氨酸0.3 g、L-組氨酸0.3 g、L-苯丙氨酸0.2 g、L-甲硫氨酸0.1 g、L-酪氨酸0.06 g和L-色氨酸 0.04 g。大鼠使用量按人與動物體表面積換算的等效劑量比率(0.018)：大鼠劑量=人 g/kg×70 kg×0.018/0.2 kg=6.3×人 g/ kg 計算，每日1次，6 d為1個療程，間歇1 d，連續(xù)4個療程。

1.5 標本采集及處理

末次干預結束后對所有大鼠稱重記錄，大鼠禁食不禁水24 h后，用4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，取俯臥位固定，于大鼠背部后正中線切開皮膚，剔除皮毛、筋膜剝離雙側豎脊肌，稱重并記錄肌肉濕重。選取豎脊肌腰段組織，一部分放入4%多聚甲醛溶液中固定，一部分放入電鏡液，另一部分標本經過液氮速凍后迅速轉移，放入超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 指標檢測

1.6.1 大鼠體質量增長率 大鼠體質量增長率=[第n周大鼠體質量(g)-第n-1周大鼠體質量(g)]/第n周大鼠體質量(g)×100%。

1.6.2 大鼠SI值 大鼠SI值為靶骨骼肌濕重與大鼠處死時最終體質量比值，現(xiàn)研究多采用SI值來間接評估骨骼肌萎縮程度。本研究取大鼠雙側豎脊肌作為靶骨骼肌，SI值(g/g)=[(脊旁雙側豎脊肌濕重(g)/最終體質量(g)]×100%。

1.6.3 HE染色觀察大鼠豎脊肌組織形態(tài) 大鼠麻醉后固定取材，取大鼠脊旁腰段豎脊肌組織，放入 4%多聚甲醛中室溫固定48 h，石蠟固定包埋，制作成4 μm厚切片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，HE 染色，中性樹膠封片，觀察大鼠豎脊肌組織形態(tài)變化。

1.6.4 透射電鏡觀察大鼠豎脊肌組織超微結構 取材3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定，1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀后固定，酒精-丙酮脫水，環(huán)氧樹脂618包埋劑包埋；超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察、攝影。

1.6.5 TUNEL法觀察肌細胞凋亡 肌肉組織進行石蠟包埋、切片后進行脫蠟，通過滴加蛋白酶K工作液進行修復，滴加破膜工作液進行破膜。根據片子數量和組織大小，按照TUNEL試劑盒說明書進行檢測，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。每張TUNEL陽性切片隨機選取3個高倍視野(×400)，凋亡細胞核為綠色，正常細胞核為藍色，計數每個視野中的凋亡細胞數和總細胞數使用加權法計算肌肉細胞凋亡指數。細胞凋亡指數(AI)=(凋亡細胞核數/總細胞核數)×100%。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠體質量增長率比較

表1示，針刺干預前與空白組比較，其余4組大鼠體質量增長率均降低(P<0.05)，干預后1周至4周與空白組比較，模型組大鼠體質量增長率均降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，針刺穴位組、陽性藥物組體質量增長率均升高(P<0.05，P<0.01)，而針刺非穴組體質量增長率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與陽性藥物組比較，針刺穴位組體質量增長率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠體質量增長率比較

2.2 各組SI值比較

圖1示，與空白組比較，模型組大鼠SI值下降(P<0.01)；與模型組比較，針刺穴位組、陽性藥物組SI值升高 (P<0.05，P<0.01)，針刺非穴位組SI值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與陽性藥物組比較，針刺穴位組SI值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

注: 與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01圖1 各組大鼠脊旁雙側豎脊肌濕質量比(SI值)

2.3 各組HE染色比較

圖2示，空白組大鼠符合正常骨骼肌組織的形態(tài)學特征，肌纖維細胞集合而成肌束，肌細胞排列整齊緊密呈多邊形，大小基本一致，細胞核大部分分布在肌細胞邊緣，極少位于細胞的中心部位；與空白組比較，模型組大鼠骨骼肌細胞呈現(xiàn)圓形化，大小不等，排列較松散，細胞間隙增大，細胞直徑的差別增大，出現(xiàn)不同程度的萎縮；與模型組比較，針刺穴位組、陽性藥物組大鼠骨骼肌纖維組織更加緊密，圓形化程度減少，肌細胞排列較為整齊，萎縮程度減少，細胞間隙減少。

圖2 各組大鼠豎脊肌組織形態(tài)表現(xiàn)比較(HE，×200)

2.4 各組透射電鏡比較

圖3示，空白組符合正常骨骼肌肌節(jié)結構正常，肌漿網形態(tài)正常且無腫脹；與空白組比較，模型組雖然肌節(jié)結構較為正常，肌絲排列整齊，但肌漿網呈現(xiàn)明顯腫脹特征且數量減少，肌漿網管出現(xiàn)不同程度的擴張；與模型組比較，針刺穴位組、陽性藥物組肌節(jié)結構正常，肌絲排列整齊，肌漿網形態(tài)較為正常，偶見局部輕度腫脹、擴張。

圖3 各組大鼠豎脊肌組織超微結構表現(xiàn)比較(透射電鏡)

2.5 各組肌細胞凋亡指數比較

圖4、5示，與空白組比較，模型組大鼠豎脊肌AI值升高(P<0.01) ; 與模型組比較，針刺穴位組、陽性藥物組豎脊肌AI值降低 (P<0.01)，針刺非穴位組AI值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與陽性藥物組比較，針刺穴位組AI值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

注：TUNEL法檢測凋亡細胞，藍色熒光為DAPI核染，綠色熒光為陽性凋亡細胞圖4 各組大鼠骨骼肌肌細胞TUNEL熒光結果比較(TUNEL×400)

注: 與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01圖5 各組大鼠骨骼肌肌細胞凋亡指數變化比較

3 討論

腰骨骼肌衰老、退變是造成腰椎失穩(wěn)的核心因素，引起腰痛的發(fā)生與反復發(fā)作。“腰背委中求”是目前臨床治療腰背部疾病的重要經驗指南。委中為背腰兩支膀胱經脈在腘窩的會合處，起疏調腰背之氣的作用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，委中的神經投射到脊髓節(jié)段分布和腰背部肌肉的神經節(jié)段分布，在脊髓和后根神經節(jié)有相互重疊的部位，說明刺激委中與治療腰背肌肉疾病有著密切關系[10]。腎俞為腎的背俞穴，是腎中精氣輸注的部位。腎為“先天之本”，主生長發(fā)育與生殖，腎虛而致衰。中醫(yī)認為選取腎俞可疏導腰部經氣，調和局部氣血[11]?，F(xiàn)代研究也證實，腎俞能改善免疫功能，調節(jié)激素水平，減輕氧化應激反應，是延緩衰老的重要穴位[12，13]。本實驗采用D-gal建立LMA模型大鼠，觀察針刺“委中”“腎俞”兩穴對衰老大鼠腰肌質量、組織形態(tài)、超微結構以及細胞凋亡的影響，初步探討針刺療法延緩腰肌衰老的可能機制。

研究顯示，D-gal致衰老模型大鼠會出現(xiàn)肌肉減少，導致體質量減小[14]。SI值是判定肌肉衰減的重要指標[15]。溫佩彤等[16]發(fā)現(xiàn)，電針“腎俞”“足三里”能提高骨骼肌濕質量比。本實驗結果顯示，采用針刺、陽性藥物干預后，大鼠體質量增長率、SI值均明顯提高，表明針刺“委中”“腎俞”能提高骨骼肌質量，延緩肌肉衰減。

隨著機體年齡的增長，且長期慢性炎癥、線粒體功能障礙以及活性氧累積造成的氧化應激，會直接損害骨骼肌興奮-收縮耦聯(lián)系統(tǒng)，最終導致肌肉無力和骨骼肌衰減[17，18]。而肌肉的正常收縮功能依賴于肌漿網上Ca2+的攝取與釋放平衡[19]?？梢姡{網對于保證骨骼肌正常功能至關重要。本研究HE結果顯示，針刺使骨骼肌纖維組織更加緊密，圓形化程度減少，萎縮程度減少，細胞間隙減少。進一步進行電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，針刺可增加肌漿網數量，改善肌漿網水腫和擴張，說明針刺“委中”“腎俞”能一定程度上糾正肌漿網的異常改變，修復肌漿網的功能，延緩肌肉衰老。

細胞凋亡是機體生命活動中的重要組成部分，通過誘導衰老、有害或受感染的細胞降解，維持細胞的更新，保證正常的生理生化和免疫功能。當細胞凋亡調控失調出現(xiàn)過度或不充分的凋亡時，就可能誘發(fā)許多衰老相關疾病，如肌肉衰老。Kujoth GC 等[20]證實，當線粒體γ聚合酶(Polg)突變在小鼠體內積累時，會通過誘導不同組織病理性的細胞凋亡，從而進一步加速小鼠的衰老。Zhang Y[21]等也對D-gal誘導的亞急性衰老小鼠的腦組織進行了TUNEL法檢測，結果顯示與空白組比較，衰老組小鼠凋亡指數明顯升高。此外，楊艷[22]在骨骼肌和心肌組織實驗中也得出衰老組大鼠凋亡指數較空白組升高的結果。本實驗結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠肌細胞凋亡率顯著升高，與上述研究結果一致。針刺干預后細胞凋亡率較模型組明顯下降，說明其抗衰老機制可能與改善骨骼肌細胞凋亡情況有關，可作為后續(xù)的進一步研究方向。

綜上，針刺“委中”“腎俞”可減少腰椎骨骼肌細胞凋亡，促進肌漿網功能修復,改善大鼠腰骨骼肌衰老狀態(tài)。