龍江玲， 黃瑩瑩， 楊 婷， 李沁如， 徐啟鍵， 趙婷秀， 夏 荃△

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院， 廣州 510006； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 廣州 510006)

中藥藥性理論是中藥理論體系的基礎(chǔ)與核心[1]。“燥性”是中藥性能之一，但目前有關(guān)中藥燥性的研究相對(duì)較少[2]。炮制可以改變或調(diào)整藥性，探究中藥炮制前后的差異、闡釋可能的藥性變化規(guī)律是研究中藥藥性的思路之一[3]。枳殼是一味常用中藥，來源于蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)，具有理氣寬中、行滯消脹的功能[4]。一般認(rèn)為生枳殼“燥性”過強(qiáng)，久服易傷陰耗液，故常通過炮制達(dá)到緩和“燥性”的目的[5]。在廣東、香港等嶺南地區(qū)，多采用先發(fā)酵后蒸制的炮制工藝以緩解枳殼的“燥性”[6]，但對(duì)于這種嶺南特色炮制枳殼減燥作用的相關(guān)研究并不多見。

有研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期高劑量服用生枳殼后，大鼠會(huì)出現(xiàn)24 h糞便量減少等表現(xiàn)，故從影響腸道燥性的角度出發(fā)，論述了枳殼的燥性以及麩炒減燥的作用[7]。但本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，生枳殼所致大鼠腸道燥性的癥狀并不明顯，但可影響大鼠的唾液量、飲水量和胃腸道神經(jīng)肽含量。枳殼歸脾、胃經(jīng)，中醫(yī)藏象理論認(rèn)為“脾在液為涎”，故本實(shí)驗(yàn)從影響唾液分泌和唾液腺神經(jīng)肽的角度，探討嶺南特色炮制枳殼的減燥作用，也為中藥燥性的研究提供思路。本研究通過廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)ZYD-2020-137)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(粵)2019-0202。動(dòng)物飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房，光照12 h明暗交替，室溫22 ～ 24 ℃，濕度40% ～ 60%，普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物

生、制枳殼飲片(批號(hào)200501)，購(gòu)自廣州至信中藥飲片有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室張丹雁教授鑒定，確認(rèn)為蕓香科植物酸橙的干燥未成熟果實(shí)的合格飲片。

1.3 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉(廣州市齊云生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)GH-40C0)；蘇木精、伊紅(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)G1108、G1140)；血管活性腸肽(vasoactive peptide，VIP)試劑盒、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)試劑盒、P物質(zhì)(substance P，SP)試劑盒、水通道蛋白5(aquaporin5，AQP5)試劑盒(江蘇酶免生物科技有限公司，貨號(hào)分別為MM-0445R1、MM-0442R1、MM-0444R1、MM-0474R1)；DAB顯色試劑盒(中杉金橋有限公司，貨號(hào)212300304)；AQP5抗體(英國(guó)Affinity公司，貨號(hào)AF5169)；山羊抗兔IgG(江蘇親科生物研究中心有限公司，貨號(hào)7074S)。

MICROM STP 120型石蠟脫水機(jī)、HISTOSTAR型石蠟包埋機(jī)、HM304E型石蠟切片機(jī)、A81500101型自動(dòng)染片機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；BX53型光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司；Multiskan Go 1510型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；LUKYM-1型樣品冷凍研磨儀，廣州露卡測(cè)序儀器有限公司；3-18R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南可成儀器設(shè)備有限公司。

2 方法

2.1 生、制枳殼水煎液的制備

取一定量生、制枳殼飲片加水煎煮2次，第1次加入10倍量水，浸泡30 min后煎煮1 h；第2次加入8倍量水煎煮30 min，合并2次濾液，減壓濃縮至含生藥量1 g/mL，4 ℃冷藏備用。

2.2 分組及給藥方法

30只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、生枳殼低劑量組、生枳殼高劑量組、制枳殼低劑量組、制枳殼高劑量組，生、制枳殼給藥劑量按照大鼠與人的等效劑量換算公式計(jì)算?？瞻捉M大鼠給予1 mL/100 g 0.9%氯化鈉溶液，生、制枳殼低劑量組大鼠按1 g/kg劑量灌胃，生、制枳殼高劑量組大鼠按10 g/kg劑量灌胃，每天給藥1次，連續(xù)給藥4周。

2.3 處死與取材

末次給藥后禁食不禁水12 h，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，劑量為0.5 mL/100 g。麻醉后剪開大鼠頸部皮膚，摘取雙側(cè)頜下腺，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，一側(cè)頜下腺固定于4%多聚甲醛中用于HE染色和免疫組化，一側(cè)組織勻漿用于Elisa檢測(cè)，取材后脫頸處死大鼠。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 大鼠飲水量測(cè)定 將大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)于代謝籠中，每天定時(shí)添加飲水并測(cè)定水瓶總質(zhì)量，以前1天水瓶總質(zhì)量M1與當(dāng)天水瓶總質(zhì)量M0的差值作為大鼠的每日飲水總量，連續(xù)測(cè)定28 d大鼠的日飲水量，計(jì)算每組大鼠飲水量均值。

2.4.2 大鼠唾液流率的測(cè)定 在給藥后第7天、第14天、第21天、第28天測(cè)定每只大鼠的唾液流率。將大小適當(dāng)?shù)臐崈粜∶耷蜻M(jìn)行稱重，獲得棉球的干重，然后將棉球塞入大鼠口頰內(nèi)，放置3 min后取出，立即使用電子天平獲得棉球的濕重，再按公式計(jì)算出唾液分泌量和唾液流率。唾液分泌量(mg) = 棉球的濕重(mg) - 棉球的干重(mg)；唾液流率(mg/min) = 唾液分泌量(mg)/3。

2.4.3 大鼠頜下腺指數(shù)的測(cè)定 取出頜下腺后，用0.9%氯化鈉溶液洗凈，濾紙擦干表面多余的液體后稱重，頜下腺指數(shù)=頜下腺質(zhì)量(g)/大鼠體質(zhì)量(g)。

2.4.4 HE染色觀察頜下腺病理學(xué)變化 將頜下腺組織固定24 h后常規(guī)脫水，石蠟包埋。用切片機(jī)將其切成4 μm厚的切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察頜下腺組織病理學(xué)變化。

2.4.5 Elisa法測(cè)定頜下腺VIP、5-HT、SP、AQP5含量 根據(jù)試劑盒說明書步驟，Elisa法測(cè)定大鼠頜下腺組織中VIP、5-HT、SP、AQP5的含量。

2.4.6 免疫組化法測(cè)定頜下腺AQP5蛋白表達(dá) 石蠟切片置于檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)中進(jìn)行抗原修復(fù)后，加入適量的內(nèi)源性過氧化物阻斷劑，滴加AQP5一抗(1∶100)4 ℃孵育過夜。再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min后，加入DAB顯色液在室溫下孵育30 s，終止染色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核后中性樹膠封片。采用Image-pro plus 6.0軟件分析頜下腺組織棕黃色區(qū)域的平均光密度值，計(jì)算AQP5蛋白表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠飲水量比較

表1示，與空白組比較，各給藥組大鼠的飲水量均升高(P<0.01)；各給藥組之間比較，生枳殼高劑量組大鼠的飲水量升高最明顯(P<0.01)，即制枳殼也可升高大鼠飲水量但相較于生枳殼高劑量組，大鼠飲水量明顯降低(P<0.01)。生、制枳殼高劑量組大鼠的飲水量均高于低劑量組且呈劑量依賴性。

表1 枳殼炮制前后對(duì)各組大鼠飲水量的影響

3.2 各組大鼠唾液流率比較

表2示，與空白組比較，生枳殼組和制枳殼高劑量組大鼠的唾液流率顯著降低(P<0.01，P<0.05)，與制枳殼低劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與生枳殼高劑量組比較，制枳殼組大鼠唾液流率升高(P<0.01，P<0.05)；生、制枳殼高劑量組大鼠的唾液流率均低于低劑量組且呈劑量依賴性。

表2 枳殼炮制前后對(duì)各組大鼠唾液流率的影響

3.3 各組大鼠頜下腺指數(shù)比較

表3示，與空白組比較，其他給藥組大鼠的頜下腺指數(shù)均有所降低。相較于生枳殼組，制枳殼組大鼠的頜下腺指數(shù)升高，但各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 枳殼炮制前后對(duì)各組大鼠頜下腺指數(shù)的影響

3.4 各組大鼠頜下腺組織病理學(xué)觀察結(jié)果

圖1示，空白組大鼠頜下腺漿液腺數(shù)量較多且密集，呈正常的卵狀形，導(dǎo)管無(wú)擴(kuò)張，無(wú)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；生枳殼低劑量組大鼠頜下腺漿液腺數(shù)量有所減少，腺泡形態(tài)改變，而生枳殼高劑量組大鼠頜下腺腺泡數(shù)量明顯減少且大小不一，腺泡形態(tài)由卵形變?yōu)殚L(zhǎng)條形。與生枳殼組比較，制枳殼組大鼠頜下腺泡數(shù)量增加，且制枳殼高劑量組明顯多于制枳殼低劑量組，腺泡結(jié)構(gòu)有所改善。

圖1 各組大鼠頜下腺組織病理學(xué)觀察結(jié)果比較(HE×400)

3.5 各組大鼠頜下腺神經(jīng)肽VIP、5-HT、SP含量比較

表4示，與空白組比較，生枳殼組大鼠頜下腺VIP和5-HT含量均降低，其中生枳殼高劑量組顯著降低(P<0.05，P<0.01)；與生枳殼高劑量組比較，生、制枳殼低劑量組大鼠頜下腺中VIP含量均明顯升高(P<0.05)，制枳殼高劑量組大鼠頜下腺中5-HT含量明顯升高(P<0.05)，各給藥組大鼠頜下腺中SP含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 枳殼炮制前后對(duì)各組大鼠頜下腺神經(jīng)肽VIP、5-HT、SP含量影響

3.6 各組大鼠頜下腺組織AQP5含量比較

表5示，與空白組比較，生枳殼組大鼠頜下腺中AQP5含量顯著降低(P<0.01，P<0.05)，制枳殼組大鼠頜下腺AQP5含量升高，其中制枳殼高劑量組AQP5含量明顯升高(P<0.05)；與生枳殼高劑量組比較，制枳殼組大鼠AQP5含量明顯升高(P<0.01，P<0.05)。

表5 枳殼炮制前后對(duì)各組大鼠頜下腺AQP5含量影響

3.7 各組大鼠頜下腺組織AQP5的免疫組化染色結(jié)果

圖2示，空白組大鼠頜下腺中AQP5分布在腺泡的頂膜、側(cè)膜及基膜，表現(xiàn)為較強(qiáng)染色的棕黃色顆粒。與空白組比較，其他實(shí)驗(yàn)組大鼠頜下腺染色降低，其中生枳殼低、高劑量組大鼠頜下腺陽(yáng)性染色顯著降低(P<0.01，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與生枳殼高劑量組比較，制枳殼低、高劑量組棕黃色顆粒明顯增多(P<0.05)。

4 討論

燥性是中藥固有的性能之一。燥能除濕是中藥發(fā)揮的治療作用，但燥性太過會(huì)使機(jī)體損耗津液，引起干燥失潤(rùn)的表現(xiàn)[8]，如《證治要訣》中提到的“凡辛溫燥烈之品無(wú)不傷陰耗血之弊”。但是，不同藥物燥性傷陰的具體表現(xiàn)有差異。如本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，生枳殼給藥后，大鼠腸道燥性的表現(xiàn)不明顯，但唾液分泌減少、飲水量增加等癥狀顯著。在臨床中也觀察到部分患者服用枳殼后會(huì)有口渴、咽干等不適癥狀。

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與生枳殼高劑量組比較，#P<0.05；與生枳殼低劑量組比較，ΔP<0.05；AQP5(aquaporin5，水通道蛋白5)圖2 各組大鼠頜下腺AQP5的免疫組化染色比較(×400)

中醫(yī)稱唾液為涎、唾，由于二者都分泌于口，臨床實(shí)際中很難截然分開，故常合而稱之[9]。《素問·宣明五氣篇》曰：“五臟化液……脾為涎?！逼⒅鬟\(yùn)化水谷與水濕精微，若功能失常則會(huì)導(dǎo)致涎液分泌異常[10]。枳殼歸脾胃經(jīng)，生枳殼辛燥峻烈，易耗傷津液、損傷中氣，經(jīng)炮制后可緩和燥性，增強(qiáng)其理氣健脾的功效[11]。故本實(shí)驗(yàn)基于“脾在液為涎”的理論，從影響唾液分泌和唾液腺神經(jīng)肽的角度探討嶺南特色炮制枳殼的減燥作用。

在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高劑量的生枳殼可使大鼠的唾液分泌量降低、飲水量增加，表現(xiàn)出燥性耗液傷津的癥狀；相比于生枳殼，制枳殼可使大鼠唾液分泌量增加，飲水量降低，說明枳殼炮制后能夠緩解其生品的燥性。

唾液分泌的生理機(jī)制較為復(fù)雜，受多種因素調(diào)控和影響，其中頜下腺神經(jīng)肽和水通道蛋白的表達(dá)是重要的影響因素[12]。VIP是體內(nèi)重要的血管活性肽，可增加頜下腺局部的血管流量，直接影響唾液的分泌，同時(shí)也可通過磷酸化途徑調(diào)控頜下腺中環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)信號(hào)通路，從而間接影響唾液的分泌[13]。5-HT分布于大鼠頜下腺導(dǎo)管、漿液性腺泡、副交感神經(jīng)節(jié)等部位，對(duì)唾液的分泌起著重要的作用，5-HT含量的升高可使大鼠唾液分泌量增加[14]。SP存在于頜下腺組織顆粒曲管內(nèi)，是有效的舒張血管活性物質(zhì)，可維持頜下腺腺泡形態(tài)和功能，參與調(diào)節(jié)頜下腺腺泡液體的分泌[15]。在本實(shí)驗(yàn)中，生枳殼高劑量可明顯降低大鼠頜下腺VIP和5-HT含量，結(jié)果表明生枳殼所致唾液分泌量的減少與VIP和5-HT含量降低有關(guān)，且呈現(xiàn)劑量依賴的負(fù)相關(guān)性；制枳殼低劑量組大鼠頜下腺VIP含量高于生枳殼低、高劑量組，制枳殼高劑量組大鼠頜下腺5-HT含量明顯高于生枳殼高劑量組，結(jié)果提示制枳殼可通過調(diào)控VIP和5-HT含量使大鼠唾液分泌量增多，從而緩和生枳殼的燥性。在各組間大鼠頜下腺中SP含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明生、制枳殼影響大鼠唾液分泌的作用機(jī)制可能與SP含量無(wú)關(guān)。

唾液的分泌不僅與頜下腺神經(jīng)肽含量的改變有關(guān)，還與頜下腺中水通道蛋白的表達(dá)有關(guān)。其中AQP5是最早被確定分布在唾液腺腺泡頂膜、側(cè)膜、閏管和導(dǎo)管上皮細(xì)胞中的一種蛋白，AQP5的異常表達(dá)和分布被認(rèn)為可能是唾液分泌失調(diào)的重要因素之一[16]。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，生枳殼組大鼠頜下腺中AQP5的表達(dá)降低且呈劑量依賴；給予制枳殼后，AQP5表達(dá)升高，大鼠唾液分泌量升高，提示制枳殼炮制減燥的作用機(jī)制可能與升高AQP5表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，大鼠唾液分泌減少、飲水量增加等表現(xiàn)，為枳殼“燥性”的重要生物學(xué)表征，其內(nèi)在機(jī)制可能與頜下腺神經(jīng)肽及水通道蛋白的分泌與表達(dá)異常有關(guān)。枳殼經(jīng)嶺南特色炮制方法炮制后，可以在一定程度上糾正這些異常，起到炮制緩燥的作用。本研究既是炮制原理的初探，也可為中藥藥性理論、“脾在液為涎”等中醫(yī)基礎(chǔ)理論的研究提供一些思路。但是研究目前只關(guān)注了枳殼炮制前后對(duì)頜下腺分泌功能的影響，關(guān)于枳殼的“燥性”尚需更深入的研究，如燥性物質(zhì)基礎(chǔ)的明晰、全面的燥性生物學(xué)表征的構(gòu)建等，都是值得思考與探究的問題。