呂翠翠，沈 俊，鄧 琦

(1. 天津市第一中心醫(yī)院 血液科, 天津 300192；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所 實驗血液學(xué)國家重點實驗室, 天津 300020)

嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)介導(dǎo)的細(xì)胞免疫療法是一種治療腫瘤的新型精準(zhǔn)靶向療法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的快速識別和高效精準(zhǔn)殺傷。近些年，基于CAR的免疫細(xì)胞療法(如CAR-T和CAR-NK)正處于快速發(fā)展中，其中嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T-cell, CAR-T)療法目前已在血液腫瘤中取得了巨大的成效，尤其是在急性B淋巴細(xì)胞白血病的治療中[1-5]。在實體瘤治療中CAR-T和嵌合抗原受體修飾的自然殺傷細(xì)胞(chimeric antigen receptor-engineered NK cells，CAR-NK)的療效有限(表1)，其主要瓶頸包括T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells, NK)的滲透性不足以及免疫抑制性微環(huán)境等[6-8]。與T細(xì)胞或NK浸潤不良相反，巨噬細(xì)胞在實體瘤的腫瘤微環(huán)境中可被廣泛募集[9-11]。此外，與免疫抑制微環(huán)境會促使腫瘤浸潤的T淋巴細(xì)胞發(fā)生衰竭不同，腫瘤浸潤的巨噬細(xì)胞不會發(fā)生衰竭，具有更高程度的表型可塑性[9-11]。有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合了CAR的巨噬細(xì)胞(CAR-M)在實體瘤內(nèi)更易傾向發(fā)展成M1型活化的巨噬細(xì)胞，能在實體瘤內(nèi)持續(xù)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[12-14]。另外，作為抗原呈遞細(xì)胞，巨噬細(xì)胞還能提呈抗原給T細(xì)胞，從而激活T細(xì)胞，進(jìn)一步發(fā)揮抗腫瘤作用。與T細(xì)胞相比，巨噬細(xì)胞無組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)的限制性和發(fā)生移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD)的風(fēng)險，在體內(nèi)循環(huán)時間有限，非腫瘤靶向毒性也較小(表1)。因此，巨噬細(xì)胞有潛力被開發(fā)為靶向腫瘤的CAR-M療法，基于CAR-M的免疫細(xì)胞療法是攻克實體瘤的重要途徑。本文通過對當(dāng)前CAR-M的相關(guān)研究(包括CAR-M的細(xì)胞來源，CAR-M載體的結(jié)構(gòu)構(gòu)建和傳遞及CAR-M的臨床研究)進(jìn)行綜述，旨在為CAR-M的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供參考和奠定理論基礎(chǔ)。

表1 不同CAR免疫細(xì)胞比較

1 CAR-M的細(xì)胞來源

1.1人腫瘤細(xì)胞系 人腫瘤細(xì)胞系(THP-1)是從一名1歲兒童患者中分離出來的一種急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系。該細(xì)胞系具有與人原代單核細(xì)胞類似的形態(tài)學(xué)和功能學(xué)特性。例如，THP-1可被佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)等誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞；在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)的刺激下能進(jìn)一步被誘導(dǎo)為M1型巨噬細(xì)胞；而在白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-4等刺激下又可向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變。與人原代單核/巨噬細(xì)胞不同的是，THP-1具有穩(wěn)定一致的遺傳背景，易于體外擴(kuò)增、存儲和基因編輯。因此在實驗室條件下，THP-1常被用來探究單核/巨噬細(xì)胞生理行為的調(diào)節(jié)，如免疫反應(yīng)、細(xì)胞間相互作用和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[15]。盡管THP-1與原代單核/巨噬細(xì)胞具有高度的相似性，但在生理功能上并不完全一致，因此無法完全替代原代單核/巨噬細(xì)胞。例如，在原代巨噬細(xì)胞中通?？梢杂^察到LPS的誘導(dǎo)耐受，但THP-1來源的巨噬細(xì)胞能通過上調(diào)核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)等特定基因信號的表達(dá)，從而維持對LPS的敏感性[15]。此外，在M1極化過程中，相對于外周血的原代單核細(xì)胞，THP-1中的IL-6和IL-10的表達(dá)會缺失，IL-8的分泌會減少[15]。隨著CAR技術(shù)的進(jìn)步，THP-1可被用作CAR-M載體結(jié)構(gòu)設(shè)計和篩選的工具用來研究和提高CAR-M抗原依賴性的吞噬能力。有研究發(fā)現(xiàn)，以CD3ζ為基礎(chǔ)的CAR可增強(qiáng)THP-1源性巨噬細(xì)胞的抗腫瘤吞噬功能[13]。然而，考慮到成瘤風(fēng)險，將來THP-1介導(dǎo)的CAR-M應(yīng)用于臨床面臨著較大的挑戰(zhàn)。

1.2人外周血單核細(xì)胞 人外周血單個核細(xì)胞包含多種類型的免疫細(xì)胞，如單核細(xì)胞。在粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)等細(xì)胞因子的刺激下，單核細(xì)胞可進(jìn)一步向巨噬細(xì)胞分化[13]。與THP-1相比，外周血來源的單核/巨噬細(xì)胞能更好地保留其原始形態(tài)[15]。此外，外周血來源的單核/巨噬細(xì)胞具有更強(qiáng)大的促炎癥特性：在LPS和IFN-γ刺激下，原代單核/巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生更多的促炎因子，如IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，并表達(dá)更高水平的表面標(biāo)志物，包括利鈉肽受體、CD14和CD68[15]。借助腺病毒轉(zhuǎn)染體系，有研究者利用外周血來源的單核/巨噬細(xì)胞構(gòu)建了靶向?qū)嶓w瘤抗原的CAR-M，并在體內(nèi)外實驗中驗證了原代CAR-M良好的抗腫瘤效應(yīng)[13]。然而，考慮到原代巨噬細(xì)胞的來源有限，轉(zhuǎn)染困難及無法有效擴(kuò)增和凍存(表1)，將來人外周血單核細(xì)胞介導(dǎo)的CAR-M在臨床上的大規(guī)模應(yīng)用面臨著巨大的挑戰(zhàn)。

1.3人多能干細(xì)胞 人多能干細(xì)胞 (human pluripotent stem cells, hPSC)包括胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)，具有自我更新和多向分化潛能，理論上可以源源不斷地分化成巨噬細(xì)胞[16-19]。目前，借助于共培養(yǎng)或基質(zhì)膠介導(dǎo)的2D分化方案或擬胚體介導(dǎo)的3D分化體系，研究人員已能夠?qū)PSC在體外誘導(dǎo)分化出巨噬細(xì)胞[20]。hPSC來源的巨噬細(xì)胞首先解決了原代巨噬細(xì)胞來源不足的問題，而且利用單克隆來源的hPSC還可以生成同質(zhì)性的標(biāo)準(zhǔn)化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)品(表1)。此外，hPSC易于被基因編輯，經(jīng)基因編輯和純化后的hPSC在分化過程中能百分百攜帶編輯位點，因此，結(jié)合CAR等技術(shù)能夠做到高靶向性(表1)。此外，hPSC來源的巨噬細(xì)胞可以在分化早期進(jìn)行凍存和復(fù)蘇，易于做成現(xiàn)貨型產(chǎn)品(表1)。基于上述優(yōu)點，hPSC正在成為巨噬細(xì)胞分化和治療的研究熱點。實際應(yīng)用中，我們可以將特定的CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)到hPSC中，然后經(jīng)過分選和單克隆擴(kuò)增建立CAR-hPSC, 最后利用分化技術(shù)將CAR-hPSC分化成巨噬細(xì)胞，從而源源不斷地得到均一的CAR-M(圖1)。在一項以iPSC為種子細(xì)胞的CAR-M研究中，研究者首先使用編碼重編程因子的非整合載體誘導(dǎo)iPSC克?。蝗缓髮⒑?-1BB和CD3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)到iPSC中再進(jìn)一步誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞，這些誘導(dǎo)來的CAR-M具有M2表型; 當(dāng)遇到靶細(xì)胞時，這些CAR-M能吞噬靶細(xì)胞，并向M1型轉(zhuǎn)化；體內(nèi)研究進(jìn)一步表明，iPSC來源的CAR-M可以發(fā)揮腫瘤靶向作用[12]。

圖1 利用hPSC構(gòu)建CAR-M的過程 注：hPSC:人多能干細(xì)胞；CAR-hPSC: 嵌合抗原受體人多能干細(xì)胞； CAR-M:嵌合抗原受體巨噬細(xì)胞

2 CAR-M載體的構(gòu)建和傳遞

在CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計上，CAR-M整體上遵循CAR-T的構(gòu)建原則，包括細(xì)胞外抗原識別域、鉸鏈區(qū)和一個或多個胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)域。CAR-M與CAR-T結(jié)構(gòu)設(shè)計的主要不同在于胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。

2.1吞噬信號激活載體的設(shè)計 CAR-M載體結(jié)構(gòu)設(shè)計的重點和難點在于細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。CD3ζ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含免疫受體酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)，在CAR-T中介導(dǎo)T細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。與CAR-T類似，CAR-M可以直接使用CD3ζ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域激活吞噬信號，但激活的分子機(jī)制與CAR-T不同。在CAR-T中，ITAM在CAR結(jié)合時被Src家族激酶磷酸化，接著與激酶ZAP70中的串聯(lián)SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，進(jìn)而激活CAR-T以發(fā)揮殺傷作用[21]。巨噬細(xì)胞不表達(dá)ZAP70，而是表達(dá)另一種含有串聯(lián)SH2結(jié)構(gòu)域的激酶Syk，可以結(jié)合CD3ζ并在巨噬細(xì)胞中傳遞吞噬信號[21]。除CD3ζ外，其他含有ITAM的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，如Fc受體共同γ鏈(Fc receptor common gamma chain, FcRγ)和多個表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域蛋白10(multiple epidermal growth factor-like domains protein 10, Megf10)，也被發(fā)現(xiàn)與CD3ζ具有相當(dāng)?shù)耐淌勺饔茫叙じ紾蛋白偶聯(lián)受體B1(adhesion G protein-coupled receptor B1, Bai1)和酪氨酸蛋白激酶 Mer (tyrosine-protein kinase Mer, MerTK) 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的CAR-M則不能進(jìn)行有效的吞噬[22]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cRγ主要介導(dǎo)巨噬細(xì)胞中抗體依賴性細(xì)胞吞噬信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而Megf10在巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞中起關(guān)鍵作用[22]。在另一項靶向C-C趨化因子受體7型(C-C chemokine receptor type 7, CCR7)的CAR-M研究中，研究者則發(fā)現(xiàn)相比Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)2、TLR4和TLR6等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，含有MerTK的CAR-M在體外具有較強(qiáng)的吞噬能力和細(xì)胞殺傷活性[23]。

大多數(shù)CAR-M僅能內(nèi)化靶細(xì)胞片段，而不能整個吞噬腫瘤細(xì)胞，如何提高CAR-M對靶細(xì)胞的整體吞噬能力是該領(lǐng)域的難點。在CAR-T相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)含有CD3結(jié)構(gòu)域而不含共刺激結(jié)構(gòu)域的第一代CAR-T在體內(nèi)的活性和功能有限[24-27]。因此，現(xiàn)階段批準(zhǔn)上市的CAR-T產(chǎn)品都含有共刺激胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，CD28和(或)41BB。與第二代和第三代CAR-T類似，額外的信號傳導(dǎo)域或許能進(jìn)一步增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用。此前有報道稱，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)信號對大顆粒的吞噬作用很重要，這表明額外的PI3K信號或許能增強(qiáng)CAR-M的吞噬作用[28]。研究者通過將CD19-PI3K募集結(jié)構(gòu)域串聯(lián)融合到基于FcRγ的CAR結(jié)構(gòu)中，結(jié)果使靶細(xì)胞的整體吞噬作用顯著增強(qiáng)[28]。

2.2非吞噬信號激活載體的設(shè)計 除了設(shè)計上述具有激活吞噬作用的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，有研究者設(shè)計了一種含有CD147激活域(CAR-147)的CAR用來降解腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)[14]。CD147是一種調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)表達(dá)和ECM重塑的蛋白質(zhì)。ECM所造成的物理屏障是引起免疫細(xì)胞向腫瘤浸潤不足的重要原因。CAR-147不轉(zhuǎn)導(dǎo)吞噬信號，CAR-147巨噬細(xì)胞與靶細(xì)胞的結(jié)合顯著上調(diào)某些MMP的表達(dá)，但不影響巨噬細(xì)胞的其他功能，如吞噬作用、促進(jìn)活性氧產(chǎn)生和炎性細(xì)胞因子分泌等[14]。研究發(fā)現(xiàn)，CAR-147巨噬細(xì)胞上調(diào)少量MMP的表達(dá)可顯著降低腫瘤中的膠原含量，誘導(dǎo)CD3+T細(xì)胞浸潤并抑制腫瘤生長[14]。

2.3CAR-M載體傳遞方式 單核/巨噬細(xì)胞對基因操縱具有天然抵抗力，因此將CAR和其他基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞具有一定的挑戰(zhàn)性[29]。目前針對巨噬細(xì)胞的主要傳遞策略有病毒和非病毒兩種，在具體操作上又分為體外傳遞和體內(nèi)傳遞。

Bobadilla等[30]創(chuàng)造了新的HIV-1衍生慢病毒顆粒，能夠通過利用病毒輔助蛋白Vpx感染髓系細(xì)胞。Vpx平臺可以容納任何預(yù)先存在的基于艾滋病病毒(HIV)的慢病毒載體，因此提供了一種編輯髓系細(xì)胞的可行性策略。鑒于巨噬細(xì)胞的增殖能力有限，有研究者假設(shè)非整合、復(fù)制缺陷型腺病毒載體或許具有好的轉(zhuǎn)導(dǎo)效果，并依此設(shè)計了一種復(fù)制功能不全的嵌合腺病毒載體作為向巨噬細(xì)胞遞送CAR的方法[13]。該策略不僅顯示出轉(zhuǎn)導(dǎo)的高效性，而且在不同供體之間展現(xiàn)了可重復(fù)性[13]。此外一些非病毒策略也被開發(fā)用于工程化單核/巨噬細(xì)胞，包括質(zhì)粒DNA，信使核糖核酸(mRNA)和轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)[31-33]。

在CAR傳遞的具體操作上，目前基本上都是基于體外編輯后系統(tǒng)回輸這種傳統(tǒng)操作。為了避免復(fù)雜和昂貴的體外制備過程，一種基于納米載體的體內(nèi)編輯遞送技術(shù)正在興起。有研究表明，在體內(nèi)注射巨噬細(xì)胞靶向納米載體和編碼CAR-IFN-γ的質(zhì)粒DNA所組成的納米復(fù)合物后能夠誘導(dǎo)體內(nèi)巨噬細(xì)胞形成CAR-M1型巨噬細(xì)胞，并能發(fā)揮抗腫瘤作用[34]。在另一項研究中，研究者構(gòu)建了一種可注射的基因納米載體-水凝膠超結(jié)構(gòu)遞藥系統(tǒng)，可對術(shù)后瘤腔周圍巨噬細(xì)胞進(jìn)行原位編輯，并成功應(yīng)用于惡性腦膠質(zhì)瘤動物模型的術(shù)后免疫治療[35]。

3 CAR-M臨床研究進(jìn)展

在一項針對非肌肉浸潤性膀胱癌的多中心、隨機(jī)臨床試驗中，研究者已證實大劑量(109個/次)多次回輸巨噬細(xì)胞后無明顯毒副作用[36]。此外，到目前為止，已有一項CAR-M的I期臨床試驗被美國FDA批準(zhǔn) (Clinicaltrials.gov 號:NCT04660929)。該試驗來自CARISMA Therapeutics的候選藥物CT-0508。這是一種來源于外周血單核細(xì)胞經(jīng)由腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2, HER2)的自體CAR-M療法，主要適應(yīng)證是治療復(fù)發(fā)/難治性HER2過表達(dá)的腫瘤患者。該試驗于2021年開始，目前該款CAR-M產(chǎn)品在人體內(nèi)的安全性和有效性仍有待進(jìn)一步驗證。

4 小結(jié)與展望

基于CAR-M的細(xì)胞免疫療法在實體瘤的治療上盡管展現(xiàn)出了巨大的發(fā)展?jié)摿?，但仍有很多問題亟待解決?？煽康募?xì)胞來源和可持續(xù)擴(kuò)增是CAR-M臨床應(yīng)用的必要條件。相比腫瘤細(xì)胞及外周血單核細(xì)胞，hPSC是CAR-M將來能做到成藥的重要候選細(xì)胞。然而，當(dāng)前hPSC向巨噬細(xì)胞的分化仍然面臨效率低下，功能不足等難題，基于多能干細(xì)胞的高效分化策略仍有待進(jìn)一步開發(fā)和優(yōu)化。其次，如何提高CAR-M的抗腫瘤效應(yīng)是CAR-M臨床應(yīng)用的另一難點。設(shè)計和篩選針對巨噬細(xì)胞的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是進(jìn)一步提升CAR-M功效的重要手段。鑒于實體瘤靶點不明確，篩選合適的靶點對于提升CAR-M的療效也有積極意義。從安全性角度考慮，巨噬細(xì)胞雖無GVHD風(fēng)險，但在CAR-M的制作上仍然面臨很多安全問題。hPSC具有成瘤風(fēng)險，篩選高純度的巨噬細(xì)胞能大大降低多能干細(xì)胞的殘留。此外，CAR-M多采用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，可能會誘發(fā)插入突變；體內(nèi)直接編輯也存在靶向性問題、遞送效率問題和毒性問題等。然而，隨著美國FDA批準(zhǔn)的基于CAR-M的I期臨床試驗的開展，將來關(guān)于CAR-M的臨床研究會越來越多，相關(guān)的各種難題也會隨著技術(shù)的進(jìn)步逐漸被攻克?？梢灶A(yù)期未來基于CAR-M的腫瘤免疫療法在實體瘤的治療中將發(fā)揮重要作用。