齊玉敏，王友軍

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院 兒科，河南 鄭州 450000)

生理性黃疸和母乳性黃疸通常發(fā)生在新生兒期，由于血清游離膽紅素升高，大多數(shù)患兒為良性。然而，新生兒膽汁淤積性黃疸對肝臟損害較大[1]，其特征是血清結(jié)合膽紅素或直接膽紅素(DBIL)升高[2]。鑒別新生兒膽汁淤積性黃疸與非膽汁淤積性黃疸是非常重要的，因為新生兒膽汁淤積性黃疸可能涉及肝功能異常等嚴(yán)重疾病，需要及時診斷和治療。新生兒膽汁淤積性黃疸最常見的病因是膽道閉鎖和新生兒肝炎，其次是早產(chǎn)和先天性代謝障礙[3]。該病的發(fā)病機(jī)制是肝臟不能將膽紅素從血液中充分分泌到膽汁中[4]。鑒于腸道菌群在人的健康中起著重要作用，早期腸道菌群失調(diào)可能對免疫系統(tǒng)的成熟和健康狀況產(chǎn)生重大影響。膽紅素排入腸道后，部分經(jīng)腸道菌群的轉(zhuǎn)化作用生成糞膽原而排出體外[5]。此外，腸道中某些細(xì)菌可以直接使膽紅素轉(zhuǎn)化成糞膽原，或通過調(diào)節(jié)腸道蠕動間接影響膽紅素排出，腸道菌群對膽紅素直接或間接的代謝作用影響膽紅素腸肝循環(huán)途徑[6]，所以了解新生兒膽汁淤積性黃疸患兒腸道菌群的組成非常重要。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2019年8月至2021年8月南陽市中心醫(yī)院的新生兒膽汁淤積性黃疸[7]患兒109例，母乳性黃疸患兒68例，健康新生兒80例。膽汁淤積性黃疸組日齡8～23 d，平均(15.23±5.19) d，男19例，女11例。母乳性黃疸組日齡9～22天，平均(15.36±5.05)d，男12例，女6例。健康組日齡10～22 d，平均(14.97±5.21) d，男13例，女17例。3組日齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有新生兒都經(jīng)過家長知情確認(rèn)，獲得本院倫理委員會同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①足月兒或早產(chǎn)兒糾正胎齡后發(fā)病年齡≤28 d；②均有不同程度皮膚鞏膜黃染；總膽紅素(TBIL)>85.5 μmol/L，DBIL>17.1 μmol/L；③肝質(zhì)出現(xiàn)異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①體重異常；②先天疾??；③膽道完全梗塞。

1.2方法

1.2.1膽紅素水平檢測 空腹采集靜脈血3 ml，應(yīng)用托多利上海儀器公司生產(chǎn)的全自動生化分析儀，試劑采用上海蘇彭化生產(chǎn)的配套的生化試劑，測定TBIL、DBIL和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，并計算DBIL/TBIL值，同時記錄患兒年齡、是否母乳喂養(yǎng)和分娩方式。

1.2.2腸道菌群檢測 采用一次性無菌便盒，加入無菌棉簽，所有病例都在確診24小時內(nèi)，未經(jīng)過抗生素及其他藥物治療采集新鮮糞便標(biāo)本，放入盛有冰袋的泡沫盒中，24小時后分裝到EP管中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取腸道菌群總的DNA基因，按照試劑盒的使用說明進(jìn)行嚴(yán)格操作。使用166-rDNA測序?qū)S便DNA樣品進(jìn)行16s-DNA基因的PCR擴(kuò)增，在回收主要的DNA片段后構(gòu)建文庫，測序長度為100 bp，區(qū)域V2-3，采用lO1PE類型進(jìn)行測序。然后再對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理獲取有效數(shù)據(jù)，拼接序列，再采用Mother 對tags進(jìn)行冗余處理，進(jìn)行物種注釋，通過OUT注釋完成物種的組成和分類分析。屬水平上對前4的菌屬進(jìn)行對比分析，計算B/E比值。并以每個視野下的細(xì)菌數(shù)量501～5 000為菌群正常，101～500為Ⅰ度菌群失調(diào)，11～100為Ⅱ度菌群失調(diào)，小于10個為Ⅲ度菌群失調(diào)。

2 結(jié) 果

2.13組臨床特征比較 3組性別、年齡、母乳喂養(yǎng)方式和陰道分娩方式差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與健康組和母乳性黃疸組相比，膽汁淤積性黃疸組ALT、DBIL水平和DBIL/TBIL較高(P均<0.05)，菌群正常和Ⅰ度菌群失調(diào)占比較低(P<0.05)，Ⅱ度菌群失調(diào)和Ⅲ度菌群失調(diào)占比較高(P<0.05)。見表1。

表1 3組臨床特征比較

2.23組門水平優(yōu)勢菌群比較 與母乳性黃疸組相比，膽汁淤積性黃疸組擬桿菌門和厚壁菌門水平較高(P<0.05)，放線菌門和中變形菌門水平較低(P<0.05)。見表2。

表2 3組門水平優(yōu)勢菌群比較

2.33組屬水平優(yōu)勢菌群豐度比較 膽汁淤積性黃疸組雙歧桿菌、乳酸桿菌豐度和B/E值顯著低于健康組和母乳性黃疸組(P<0.05)，大腸桿菌和腸球菌豐度明顯高于健康組和母乳性黃疸組(P<0.05)。見表3。

表3 3組屬水平優(yōu)勢菌群豐度的比較

2.4膽汁淤積性黃疸組血清膽紅素水平與門水平優(yōu)勢菌群相關(guān)性 ALT與擬桿菌門、厚壁菌門呈正相關(guān)(均P<0.05)，與放線菌門呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)；TBIL與擬桿菌門、厚壁菌門呈正相關(guān)(均P<0.05)，與放線菌門呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)；DBIL與擬桿菌門、厚壁菌門呈正相關(guān)(均P<0.05)，與放線菌門呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)；DBIL/TBIL與擬桿菌門、厚壁菌門呈正相關(guān)(均P<0.05)，與放線菌門呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。見表4。

表4 血清膽紅素水平與門水平優(yōu)勢菌群相關(guān)性分析

2.5膽汁淤積性黃疸組血清膽紅素水平與屬水平優(yōu)勢菌群相關(guān)性 TBIL與雙歧桿菌、B/E值呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)，與大腸桿菌、腸球菌呈正相關(guān)(均P<0.05)；DBIL與雙歧桿菌、B/E值呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)；DBIL/TBIL雙歧桿菌、大腸桿菌、腸球菌、B/E值呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。見表5。

表5 血清膽紅素水平與屬水平優(yōu)勢菌群相關(guān)性分析

3 討 論

新生兒膽汁淤積性黃疸可導(dǎo)致肝外區(qū)域膽汁酸不足，尤其是腸道，腸道內(nèi)膽汁酸不足可能促進(jìn)細(xì)菌的易位，因為膽汁酸不僅可以抑制微生物進(jìn)入腸上皮細(xì)胞，還可以直接抑制病原微生物的增殖[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，膽汁淤積性黃疸組腸道菌群多樣性顯著增加，與母乳性黃疸組相比，擬桿菌門和厚壁菌門水平明顯升高，變形菌門和放線菌門水平顯著降低。膽汁淤積性黃疸組雙歧桿菌和乳酸桿菌豐度顯著低于健康組和母乳性黃疸組，大腸桿菌和腸球菌豐度明顯高于健康組和母乳性黃疸組，B/E值明顯低于健康組和母乳性黃疸組。大腸桿菌和腸球菌豐度升高，雙歧桿菌、乳酸桿菌豐度、B/E值降低，說明新生兒黃疸患兒腸道內(nèi)微生物定植抗力在降低，腸道菌群失調(diào)。腸道膽汁酸的缺乏會導(dǎo)致腸道菌群失衡，加劇有益菌的減少。本研究發(fā)現(xiàn)，共生菌如雙歧桿菌在膽汁淤積癥組中顯著下調(diào)，說明雙歧桿菌的減少與血清膽紅素水平升高相關(guān)。本研究認(rèn)為，膽汁淤積癥的發(fā)生與潛在致病菌的大規(guī)模生長和有益菌如雙歧桿菌的大量減少密切相關(guān)。

膽汁淤積性黃疸的主要表現(xiàn)是血清膽紅素升高[9]。眾所周知，紅細(xì)胞破壞后形成的膽紅素首先進(jìn)入肝臟，然后與UDP-葡萄糖醛酸結(jié)合形成水溶性膽紅素，隨后膽紅素分泌進(jìn)入膽道，通過腸道排泄[10]。腸道菌群可能在膽紅素排泄中發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究表明，無菌多藥耐藥造模小鼠，血清膽紅素水平上調(diào)，這為腸道菌群可能參與膽紅素代謝提供了證據(jù)[11]。另有研究表明，雙歧桿菌下調(diào)與血清膽紅素水平升高有關(guān)[12]。雖然關(guān)于膽紅素和菌群失調(diào)相關(guān)的報道較多，但是關(guān)于新生兒膽汁淤積性黃疸血清膽紅素水平與門水平優(yōu)勢菌群及屬水平優(yōu)勢菌群的相關(guān)報道較少。

本研究顯示，與健康組相比，膽汁淤積性黃疸組擬桿菌門和厚壁菌門水平顯著升高，放線菌門水平明顯降低，膽汁淤積性黃疸組中的雙歧桿菌、乳酸桿菌豐度及B/E值顯著降低，大腸桿菌和腸球菌豐度明顯升高。這可能意味著膽汁酸和腸肝循環(huán)是腸道菌群組成的主要決定因素，或者比飲食更有影響。此外，膽汁淤積性黃疸組血清膽紅素水平與門水平優(yōu)勢菌群、屬水平優(yōu)勢菌群具有一定的相關(guān)性。相關(guān)研究表明，雙歧桿菌通過半乳糖代謝途徑參與膽紅素的代謝，雙歧桿菌數(shù)量的減少，加之半乳糖代謝通路相關(guān)基因豐度的降低，導(dǎo)致腸道UDP-葡萄糖缺乏，影響下游葡萄糖醛酸通路形成膽紅素，膽紅素水平降低[13]。母乳喂養(yǎng)被認(rèn)為是母乳性黃疸的危險因素[14]，然而，母乳喂養(yǎng)是否在膽汁淤積性黃疸發(fā)病機(jī)制中起作用尚未得到很好的研究。腸道微生物群與人類機(jī)體相互依存、相互竟?fàn)?、相互抑制、共同進(jìn)化和促進(jìn)宿主的消化和代謝功能，進(jìn)而維護(hù)機(jī)體的健康，腸道微生物能夠發(fā)酵營養(yǎng)成分并分泌生物活性化合物，對生理和新陳代謝產(chǎn)生一定的影響[15-16]。新生兒膽汁淤積時，膽汁排入腸道減少，削弱膽汁對腸道細(xì)菌的抑菌作用，導(dǎo)致腸道細(xì)菌過度增殖，菌群紊亂，進(jìn)而腸道微環(huán)境發(fā)生變化[17]。同時腸道黏膜屏障功能受損，細(xì)菌易位進(jìn)入肝臟門脈系統(tǒng)，加劇膽汁淤積的程度[18]。相關(guān)研究表明，膽汁淤積性患兒中雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量明顯減少，大腸桿菌的數(shù)量明顯增多[19]，本研究結(jié)果與其一致。

綜上所述，膽汁淤積性黃疸患兒菌群失調(diào)，雙歧桿菌明顯減少，且血清膽紅素水平與菌群具有一定的相關(guān)性，提示膽汁淤積性黃疸患兒腸道菌群失調(diào)可能和雙歧桿菌減少有關(guān)，補(bǔ)充益生菌的方式可能成為治療膽汁淤積性黃疸一種有效方式。